Какая коробка стоит на лада х рей: Коробка автомат на Лада Х Рей

Содержание

Автомат Лады XRAY — вариатор или нет? — журнал За рулем

В Тольятти заявили, что новая коробка передач для Лады XRAY не является вариатором. «За рулем» расставляет точки над i.

На днях пресс-служба АВТОВАЗа выпустила видеоролик, посвященный новой и, по заверениям заводчан, необычной коробке передач для Лады XRAY Cross. То, о чем говорится в мини-фильме, хотелось бы обсудить. Но для начала предлагаем его посмотреть:

Материалы по теме

Обычные рекламные реплики о том, что все будет лучше, надежнее, удобнее и так далее, оставим без внимания. Нас в большей степени зацепила попытка АВТОВАЗа убедить зрителей в том, что эта коробка передач не является вариатором в привычном понимании, а представляет собой некий микс технологий: вариатора, механики и традиционного автомата. На такое мы закрывать глаза попросту не вправе. Ведь для Иксрея предназначен обычный, давно известный агрегат фирмы Jatco, имеющий обозначение JF015E, который называют еще CVT7.

Неужели и автомобили Nissan Juke, Qashqai, Tiida, Sentra, Renault Kaptur и Fluence тоже оснащены неким миксом из вариатора, механики и автомата? Ведь на них установлен тот же самый агрегат JF015E. Но почему-то ни один менеджер Renault-Nissan никогда не называл этот узел иначе, чем вариатор. Давайте разбираться.

Конструктивные особенности

Материалы по теме

Начнем с того, что гидротрансформатор действительно есть. Только он есть у всех современных вариаторов и, по сути, выполняет роль сцепления, позволяя остановить автомобиль, в то время как селектор коробки передач остается в режиме drive. При этом модель JF015E немного отличается от прочих вариаторов фирмы Jatco.

У агрегата Jatco JF011E, который ставили, к примеру, на Nissan X-Trail, гидротрансформатор передает вращение планетарному механизму, обеспечивающему возможность движения вперед и назад. Дальше крутящий момент приходит на пару раздвижных шкивов, соединенных гибким стальным ремнем.

Это и есть устройство, меняющее передаточное отношение между ведущим и ведомым валами. От последнего приводится главная пара. Дальше только дифференциал, приводы и колеса. А у модели JF015E планетарный механизм обеспечивает не только задний ход, но и два передаточных отношения на переднем ходу.

JF015E. Хорошо видны очень маленькие конусы и двухступенчатая планетарная передача на вторичном валу.

Гидротрансформатор сразу приводит ведущий шкив вариатора, а ведомый соединен с планетарной передачей, обеспечивающей задний ход и две ступени для движения вперед. Такая схема позволила значительно уменьшить размеры конусов и, соответственно, общие габариты вариатора.

Новая компоновка позволила уменьшить габариты вариатора.

Одно передаточное отношение реализуется при низкой скорости автомобиля и высоких оборотах двигателя. Другой режим — большие скорости движения машины и малые обороты мотора. Эти два режима могут пересекаться при средних соотношениях скорости и частоты вращения двигателя. Выбор осуществляет электронный блок и с помощью подачи жидкости под давлением включает тот или иной пакет фрикционов. Система ASC подбирает наилучшее передаточное число во время движения, при разгоне и торможении. Все это позволило слегка уменьшить средний расход топлива, особенно при езде по городу.

Диапазоны включения ступеней пересекаются, а вместе могут обеспечить агрегату в целом беспрецедентно большой диапазон изменения передаточных отношений, равный 7,3. У того же JF011E этот диапазон передаточных отношений равен 6,09. И уж совсем маленький диапазон 4,1 дает гидромеханический 4-ступенчатый автомат Jatco JF 414E, которым комплектуют ряд моделей АВТОВАЗа.

Диапазоны включения ступеней пересекаются, а вместе могут обеспечить агрегату в целом беспрецедентно большой диапазон изменения передаточных отношений, равный 7,3. У того же JF011E этот диапазон передаточных отношений равен 6,09. И уж совсем маленький диапазон 4,1 дает гидромеханический 4-ступенчатый автомат Jatco JF 414E, которым комплектуют ряд моделей АВТОВАЗа.

Резюмируя, можно сказать, что вариатор JF015E — современный, достаточно компактный и эффективный агрегат. Однако любое усложнение конструкции, как правило, приводит к снижению надежности и долговечности. Так что же с надежностью на самом деле?

Опыт эксплуатации

Материалы по теме

До сих пор все выглядело как хвалебная ода новому перспективному агрегату. Но не забывайте — агрегат не нов! Практика использования его на ряде автомобилей альянса Renault-Nissan показала, что с долговечностью далеко не все в порядке. В среднем вариатор JF015E редко работает больше 100 000 км, а в некоторых случаях неприятности могут начаться при «детском» пробеге в 20 000–35 000 км.

Многие детали вариатора изнашиваются намного быстрее, чем на других модификациях этого агрегата без двухступенчатого редуктора. Ремень, вследствие меньших размеров шкивов, сгибается по меньшему радиусу и быстрее изнашивает рабочие поверхности шкивов и боковые контактные поверхности пластин. Наблюдается быстрый износ подшипников, на которых вращаются конусы. И даже посадочные места под подшипники порой разбивает. Все эти процессы дают обильную стружку (продукты износа), которая начинает путешествовать по гидросистеме. Из-за продуктов износа зависает редукционный клапан насоса, создающего давление в гидросистеме. Давление масла все больше «уходит» из допустимых значений, а это сбивает настройку всего агрегата, полностью управляемого гидравликой. Продукты износа засоряют соленоиды гидроблока.

Гидроблок JF015E по конструкции схож с аналогичными устройствами других вариаторов.

Довольно быстро изнашиваются элементы, соединяющие «половинки» шкива. Часто страдают составляющие планетарной передачи, что практически не встречается на других вариаторах. На части автомобилей с этим вариатором не устанавливают охладитель рабочей жидкости. А ее перегрев может усугубить ситуацию.

Ремонт этого вариатора сложен — за работу редко берутся даже независимые СТО. Зачастую единственный выход из положения, если гарантия на автомобиль уже закончилась, — купить новый вариатор.

На переднем плане блок планетарной передачи и конусы с ремнем вариатора JF015E.

Итак, по конструкции главного элемента, регулирующего передаточное отношение, и по фирменному названию, и по документам агрегат, бесспорно, является вариатором. Аббревиатура CVT, от английского Continuously Variable Transmission, дословно означает «постоянно изменяющаяся передача».

Стоит ли опасаться новой версии Иксрея с вариатором? Зависит от того, как вы планируете эксплуатировать машину. Мы уже выяснили, что агрегат проверен на ряде других автомобилей, и, исходя из опыта их эксплуатации, причислить вариатор к наиболее надежным автоматическим коробкам передач, имеющимся на рынке сегодня, к сожалению, нельзя. Но при должном техническом обслуживании и спокойной манере езды, исключающей возможный перегрев охлаждающей жидкости, этот агрегат послужит вам как минимум в период гарантийного срока. А вот «джиповать» на Ладе XRAY Cross с «новым» вариатором не советую — себе дороже. Особенно если выбираете машину всерьез и надолго.

Коробка передач для Lada XRAY — варианты двигателей в комплектациях с МКПП и АМТ

Выбор качественной и надежной трансмиссии – это один из наиболее важных моментов при выборе и покупке нового автомобиля. Какая коробка передач, из предложенных в качестве трансмиссии для Lada XRay, наилучшим образом ответит ожиданиям и потребностям потенциальных покупателей, можно узнать в этой статье.

Какие коробки передач устанавливаются на Икс Рей

Возможность выбора не очень велика – производитель предложил всего два варианта в линейке доступных трансмиссий. Однако, предложенные типы коробок вполне способны удовлетворить потребности любого отечественного водителя.

Для данной модели доступны: пятиступенчатая роботизированная КПП — АМТ и рассчитанная на пять скоростей МКПП. Что они собой представляют — необходимо рассказать подробнее.

5-ступенчатая МКПП

Механическая коробка переключения передач для Lada XRay, по мнению многих экспертов, станет одним из наиболее востребованных вариантов комплектации автомобиля. В качестве МКПП будет использоваться французская разработка, успешно применяемая концерном Рено, которая в свою очередь была предоставлена для оснащения многих моделей «Рено» и «АвтоВАЗ». Высокий хэтчбек Lada XRay с передним приводом не стал исключением. Данная коробка демонстрирует хорошие результаты и работает как часы.

Срок службы и ресурс коробки, примененной ранее французским производителем для комплектации Renault Logan второго поколения, не вызывают никаких сомнений в ее качестве и долговечности. Она достаточно неприхотлива в использовании, редко требует серьезного ремонта.

Ранее данная МКПП уже была успешно применена при сборке Лады Весты, выпущенной в продажу в ноябре 2015 года. Как показывают отзывы покупателей Весты, данный агрегат не вызывает никаких нареканий в работе, поэтому станет достойным выбором и для каждого покупателя Лады Х-Рей.

Единственный вопрос, который может возникнуть у потенциального покупателя – некоторый дисбаланс в отношении силы мотора. По некоторым причинам конструкторы создали достаточно жесткие рамки при сборке силовых агрегатов, поэтому МКПП используется только в комплекте с двумя не самыми мощными двигателями. Российский двигатель ВАЗ-21129 (1.6 литра, 106 лошадиных сил) и японский h5Mk (1.6 литра, 110 лошадиных сил) слабее мотора ВАЗ-21179 (1.8 литра, мощность 122 л.с.), который доступен только с АМТ. Например, в самой бюджетной версии Икс Рея, мощность в 106 л.с. может оказаться недостаточной для обеспечения необходимой динамики автомобиля.

5-ступенчатая роботизированная АКПП (АМТ)

Что же касается автомата, то «АвтоВАЗ» использовал собственную разработку – роботизированную пятиступенчатую трансмиссию с возможностью «перехвата» управления в ручной режим. Использовать предложенный разработчиком «робот» для оснащения Lada XRay будет возможно только в комплектации силового агрегата совместно с двигателем ВАЗ-21179, который имеет объем 1.8 литров и номинальную мощность 122 л.с.

О том, как именно функционирует автоматическая трансмиссия отечественного производителя, можно более подробно узнать в многочисленных видео, которые создавались как независимыми экспертами, так и журналистами крупных печатных изданий автомобильной тематики. В целом, работа вариатора была признана достаточно неплохой, с учетом последних корректировок от производителя.

К недостаткам АМТ можно отнести тенденцию автоматического понижения передачи при подъеме по крутому склону. Если автомобиль начинает снижать мощность, есть риск потерять динамику при обгоне на этом подъеме (несмотря на встроенную электронную систему курсовой устойчивости). Свою лепту в это недоразумение вносила и некорректная настройка противобуксовочной системы, которая приглушала обороты двигателя при пробуксовке несущих передних колес. Поскольку данные нюансы были замечены еще при первых тест-драйвах, есть надежда, что производитель вовремя исправил данные недостатки. В крайнем случае рекомендуется перехватывать ручное управление, переключая вариатор.

Второй нюанс является общим для всех АКПП. Так или иначе, электроника немного «притормаживает» с повышением или понижением передачи, поэтому наблюдаются некоторые задержки в работе механизма. Опытный водитель при ручном управлении трансмиссии получит значительно лучшие показатели разгона автомобиля, чем даже самый продвинутый автомат.

Почему «АвтоВАЗ» отказался от собственной механики

Один из важнейших вопросов по поводу трансмиссии Lada XRay может стать именно этот фактор. Почему производитель проигнорировал собственную механическую коробку передач в пользу французской разработки? Причин этому несколько.

Во-первых, французская разработка действительно показывает более высокий уровень надежности. Этот агрегат более долговечен, не требует столь частой замены масла и в целом ведет себя значительно лучше. В ходе эксплуатации автомобилей, оснащенных пятискоростной французской МКПП, вопросы возникают крайне редко.

Во-вторых, отечественные конструкторы так и не смогли исправить российскую механику собственного изготовления к началу серийного производства Икс Рея. Данный агрегат, примененный в некоторых разработках концерна, предшествующих Весте (например, в Калине и Гранте), показывал слишком высокий уровень шума – работа коробки была слышна даже в салоне автомобиля, что сильно давило на нервы многих водителей.

Если учесть, что цены французской и отечественной МКПП вполне сопоставимы (отечественная немного дешевле зарубежной), то данное решение оказывается наиболее разумным и выгодным при полном рассмотрении сборки Лады Х-Рей.

Выводы для потенциальных покупателей

Вывод достаточно прост, но не слишком очевиден. Так как механикой снабжены два менее мощных двигателя, без возможности ее установки на флагманский мотор ВАЗ-21179, а автомат, напротив, не может быть установлен на более слабые моторы – покупатель серьезно ограничивается в выборе. Выбирая механику, он автоматически исключает из своего поля зрения самый производительный двигатель из предложенной линейки, а выбирая автомат – теряет возможность сэкономить на моторе, выбрав менее требовательный по топливу.

Тем не менее, данный недочет вызывает больше внимания к комплектации Lada XRay «Комфорт», в которой доступен выбор и механики с японским двигателем, и АКПП на 1.8-литровом двигателе. По мнению многих экспертов, именно эта комплектация будет наиболее продаваемой и востребованной.

Какая коробка передач на Лада х Рей

В новой Ладе х рей применяют современные коробки передач, разработка которых велась специально под данную модель. Представленные КПП являются следующим шагом для автомобилей АвтоВАЗа. О них заслуженно звучат положительные отзывы среди автолюбителей, испытавших их в действии.

Для xRay предусмотрено три варианта КПП, из которых два разрабатывались французами, а третья самим АвтоВАЗом. Первые два варианта имеют пятиступенчатое механическое переключение скоростей, а отечественная коробка роботизированный автомат. Отечественная АМТ трансмиссия быстро проявила себя как самая надежная и качественная среди данного типа КПП. При ее использовании водитель может быстро переключиться между механическим и автоматическим режимами.

Коробки передач подразделяются на следующие варианты:

МКПП JR5 518 – французская 5-ступенчатая, использующая многоконусный синхронизатор;
МКПП Jh4 512 – французская 5-ступенчатая КПП;
Робот ВАЗ-21827 – роботизированная коробка АвтоВАЗа.
Вариатор Jatco JE015E

Механика в lada xRay

Механическая коробка передач Х Рее подразделяется на два варианта: JR5518 и JR3512. Хоть они обе имеют по 5 ступеней передач, но отличаются по четкости переключения и надежности трансмиссии в целом. В отличие от старых коробок передач, используемых производителем, новые работают существенно тише и меньше вибрируют. Ход рычага переключения приобрел плавность и легкость хода, что снижает прилагаемые усилия во время езды.

Кроме того, новые коробки используют гораздо меньше масла, благодаря перемещению механизма переключения в верхнюю сферу. Эти изменения привели к снижению вероятности затруднения переключения передач в отрицательные температуры, а также полному исчезновению проблемы с загустением и замерзанием масла.

Модуль переключения передач для х рей, который отвечает за плавность переключения был произведен в германии. Бесшумность и прочность коробке предает вторичный вал и новые синхронизаторы.

Роботизированная КПП в xRay

По стратегическим соображениям, АвтоВАЗом было принято решение заменить обычный автомат х рей на роботизированную коробку передач. Изначально данная КПП не была принята автолюбителями, но спустя некоторое время она смогла заполучить отличную репутацию, показав на практике свои преимущества. Она смогла обойти по качеству исполнения иностранные аналог.

Роботизированная КПП обладает встроенным электрокомпонентами, которые компенсируют работу сцепления. Само сцепление было произведено Valeo, а актуаторы родом из Германии. В коробке присутствует защита, предотвращающая неправильное переключение. КПП обладает низким расходом топлива и масла. В ней доступен как ручной, так и автоматический режим, а также режим сброса передач. Переключения передач происходят быстро и без подергиваний.

Автоматическая коробка передач в xRay способна самостоятельно подстроиться под образ вождения владельца, и не требует прогрева даже при сильных морозах. В целом отзывы владельцев положительны, однако есть и вопросы по ее работе. Например, необходимость фиксации нажатия педали газа или во время остановки не кемпинг. В некоторых случаях могут быть легкие подергивания КПП.

Понравилась статья?

коробка автомат и особенности данной трансмиссии

Модель Лада Х Рей до момента выхода оставалась достаточно ожидаемым автомобилем по целому ряду очевидных причин. Прежде всего, современный дизайн, экономичные и производительные моторы, а также наличие коробки-автомат в сочетании с приемлемой ценой на фоне конкурентов в данном классе сделали модель Lada XRAY достаточно популярной и востребованной.

При этом максимум внимания изначально был прикован к АКПП, типу трансмиссии и особенностям. Далее мы рассмотрим, что представляет собой лада Х Рей с АКПП, какая автоматическая коробка на Икс Рей, а также на что обратить внимание при выборе версии Лада Икс Рей коробка автомат.

Содержание статьи

Модель Хray Lada: коробка автомат

Как известно, современный автопром сегодня предлагает сразу несколько типов АКПП. Наиболее распространенным до недавнего времени оставался так называемый «классический» гидромеханический автомат, который долгое время фактически был единственным доступным вариантом. Данный вид автоматов достаточно надежен, обеспечивает высокий комфорт и плавность при езде, отличается большим ресурсом, ремонтопригодностью и т.д. Однако есть и минусы.

С учетом того, что классические АКПП дорогие в производстве и последующем обслуживании, сложные в плане конструкции и ремонта, а также зачастую не являются экономичными решениями (благодаря снижению КПД и потерям в гидротрансформаторе), инженеры и автопроизводители постоянно ищут более дешевые и экономически выгодные варианты.

Конкуренцию гидротрансформаторным АКПП в свое время попытался составить вариатор CVT, но определенные особенности не позволили вариаторной трансмиссии вытеснить традиционный автомат. По этой причине следующим типом АКПП стал робот. Более того, сегодня существует сразу два типа роботизированных коробок передач – однодисковые РКПП (с одним сцеплением) и преселективные коробки с двойным сцеплением.

Каждый из указанных типов «роботов» имеет как плюсы, так и минусы, однако такие КПП многие производители стали активно устанавливать на свои авто вместо привычного гидромеханического автомата или вариатора. Исключением не стала и модель Лада Иксрей.

Итак, на модели Xray реализовано роботизированное переключение передач, а типом коробки является однодисковый робот AMT. Другими словами, на данном автомобиле установлена не автоматическая, а роботизированная коробка передач. Теперь давайте рассмотрим, какие особенности имеет автоматическая роботизированная коробка Лады Х Рей.

Прежде всего, Хрей представляет собой переднеприводный автомобиль, основным силовым агрегатом для данной модели является бензиновый двигатель с рабочим объемом на 1.6 литра и мощностью 114 л. с. Такой мотор предполагает установку в паре с 5-и ступенчатой механикой МКПП. Также производитель предлагает и более мощный двигатель с рабочим объемом 1.8 литра с автоматом – роботом AMT.

Так вот, АМТ – это все та же 5-и ступенчатая механическая коробка передач, однако вместо ручного управления трансмиссия работает под управлением ЭБУ и специальных исполнительных механизмов (сервомеханизмов, актуаторов).
Если иначе, на стандартную пятиступенчатую МКПП дополнительно установили механизмы, отвечающие за включение/выключение сцепления, а также за выбор нужной передачи и ее включение в автоматическом режиме и в зависимости от различных дорожных условий. Всем этим управляет специальный электронный блок, в память которого «зашиты» определенные алгоритмы работы (ПО, прошивка, программное обеспечение).

Таким образом, весь процесс полностью автоматизирован, что дает водителю удобство автомата в сочетании с высокой топливной экономичностью, разгонной динамикой и надежностью механической коробки передач. Кстати, прямое участие в создании коробки-робот для Лада Х Рей принимали инженеры известной немецкой компании ZF, которая специализируется на производстве трансмиссий, а также разных узлов и агрегатов для автомобилей (как легковых, так и грузовых) и других видов техники.

Данная КПП АМТ уже знакома многим автолюбителям по моделям Калина и Приора, однако там коробка установлена в паре с 1.6 литровым двигателем мощностью 106 л.с. На Лада X-RAY двигатель мощнее и больше по объему (1.8 литра и 122 л.с.), в результате чего коробка робот была дополнительно адаптирована для работы в паре с таким ДВС.

Также при разработке АМТ для Иксрей отдельно учитывался не только другой двигатель, но и вес автомобиля, различные технические характеристики и т.д. Еще АКПП Лада Х Рей дорабатывалась в реальных условиях (предсерийная версия активно тестировалась немецкими специалистами). После ряда тестов было внесено много важных изменений в алгоритмы работы АМТ.

Так или иначе, модель пошла в серию. Коробка АМТ получилась дешевой в производстве (что повлияло на конечную стоимость Лада Хрей) и достаточно экономичной. Главная задача, которая стояла перед разработчиками, была успешно решена.

При этом даже с учетом всех доработок и адаптации, а также низкой себестоимости, не всем водителям нравится такой автомат. Другими словами, перед покупкой машины с такой АКПП, нужно отдельно принимать во внимание определенные минусы АМТ коробки.

Недостатки робота АМТ на Lada Xray

C одной стороны, машина получила новый современный двигатель от АвтоВАЗа (16-клапанный ВАЗ-21179, объем 1.8 литра, мощность 122 л.с., крутящий момент 170 Нм.). Казалось бы, с такими характеристиками ДВС в паре с адаптированным и настроенным роботом динамика должна быть отличная. Однако с другой именно недостатки коробки АМТ в данной связке проявляются в полной мере.

Сразу отметим, тут нет никакой вины специалистов ZF, которые разрабатывали КПП и программное обеспечение. Основная проблема заключается в том, что коробки АМТ сами по себе являются хоть и дешевым, однако далеко не идеальным решением, что подтверждается печальным опытом многих производителей по всему миру.

В АвтоВАЗе это также прекрасно понимают, однако в приоритете стоит задача сэкономить и любым способом снизить себестоимость автомобиля, чтобы иметь возможность конкурировать. Чтобы было понятно, однодисковые роботы типа АМТ являются самым дешевым видом роботизированных коробок передач.

Если не вдаваться в подробности, сразу после разработки их начали ставить крупнейшие автопроизводители (европейские, японские и т.д.). В результате такие роботы оказались под капотами бюджетных моделей, а также на машинах из среднего сегмента 2006-2009 годов выпуска (например, Toyota, Ford, Honda, Opel, Peugeot и т.д.).

С учетом того, что указанные автоматы позиционировались в качестве доступной замены «классическим» АКПП и рекламные компании делали акцент на их преимуществах, многие автовладельцы приобрели машины с таким автоматом-роботом. Однако в дальнейшем выяснилось, что до традиционных АКПП и вариаторов коробкам типа АМТ еще очень далеко.

Прежде всего, благодаря особенностям конструкции (автоматизированная механика), при езде водитель, который пересел с «классического» автомата, сразу замечает рывки, задержки и провалы. Причина — механическое сцепление вместо ГДТ, а также задержки срабатывания сервомеханизмов, так как время тратится на включение/выключение сцепления, выбор и переключение передачи и т.д.

Рекомендуем также прочитать отдельную статью о том, что такое коробка AMT. Из этой статьи вы узнаете об устройстве РКПП данного типа, а также какие плюсы и минусы имеет автоматизированная механическая трансмиссия.

Указанные недостатки на деле являются более серьезным минусом, чем преимущества АМТ в виде низкой стоимости, а также хорошей разгонной динамики одновременно с лучшей топливной экономичностью.

Еще нужно отметить, что в дальнейшем владельцы роботов также столкнулись с быстрым износом сцепления и поломками сервомеханизмов, управляющих коробкой, уже к 80-100 тыс. км. пробега. На многих авто требовалось регулярно делать адаптацию сцепления (каждые 15-20 тыс.км), а также само сцепление «ходило» около 60-80 тыс. км.

Если к этому добавить достаточно высокую стоимость сервомеханизмов и их низкую ремонтопригодность в сочетании с высокой стоимостью отдельных запчастей для АМТ, то такая роботизированная механика по надежности оказалась вовсе не тем «неубиваемым» агрегатом (по аналогии с МКПП), как многими ожидалось.

В результате крупные мировые производители начали быстро отказываться от роботизированных коробок данного типа в пользу «классических» АКПП, вариаторов или новейших преселективных роботизированных коробок передач с двойным сцеплением (типа DSG).

Если же говорить о Lada Xray с роботом, даже с учетом доработок, потенциал мощного двигателя не может быть полноценно реализован с коробкой данного типа. Машина «клюет» носом при переключениях, возникают неожиданные провалы и паузы.

Фактически, коробка более-менее предсказуемо срабатывает только в спокойном режиме, однако при динамичной езде о плавности и моментальной отзывчивости можно забыть. Не спасает даже ручной режим (по аналогии с Типтроник на АКПП), так как он тоже полуавтоматический.

Еще, в отличие от АКПП, с коробкой АМТ машина сама не едет вперед после того, как водитель отпускает педаль тормоза. Если точнее, XRAY тронется с места только после того, как водитель нажмет на газ, что явно затрудняет процесс перемещения в пробках.

Подведем итоги

Как видно, если нужна машина с АКПП и в приоритете Лада Икс Рей, коробка автомат на данной модели является как преимуществом, так и недостатком. Прежде всего, сама трансмиссия не автоматическая АКПП, а автоматизированная механика АМТ (роботизированная КПП) со всеми плюсами и минусами, которые мы рассмотрели выше.

Как показывает практика, сегодня такие коробки обычно ставятся на дешевые автомобили для снижения себестоимости. Также, хотя конструкция самой КПП относительно простая и надежная, слабым местом является сцепление и актуаторы, причем последние могут быстро выйти из строя, плохо поддаются ремонту и дорого стоят.

Напоследок отметим, что роботы типа АМТ больше подходят спокойным водителям, которые предпочитают размеренный стиль езды. При активном разгоне, рваном темпе езды, маневрировании и постоянных перестроениях неизбежны рывки, толчки и провалы.

Также на срок службы роботов типа АМТ напрямую влияют условия эксплуатации. Указанные коробки могут потребовать обслуживания и ремонта уже к 80 тыс. км. (как минимум, замена сцепления), если автомобиль эксплуатируется в загруженном городе в режиме старт-стоп. Чтобы увеличить ресурс АМТ и ее элементов необходимо знать и четко понимать, как ездить на коробке робот правильно, чем она отличается от АКПП, а также как обслуживать и чего нельзя делать с роботизированной трансмиссией данного типа.

Чем отличаются механические коробки передач на LADA XRAY » LADA Xray | Лада Х Рей

Разбираемся в особенностях механических КП альянса Renault-Nissan для нового русского компактного кроссовера.

Сегодня будущим владельцам LADA XRAY предлагают приобрести автомобиль в двух вариантах: иностранном комплекте с двигателем от альянса Renault-Nissan h5M (1.6 л. 110 л.с.) и французской механической коробкой передач Jh4, русском варианте с новым мотором 21179 (1.8 л. 122 л.с.) производства ОАО «АВТОВАЗ» и автоматизированной механической трансмиссией LADA. Чуть позже у официальных дилеров появится симбиоз нашего мотора 21129 (1.6 л. 106 л.с. ) и иностранной коробкой передач JR5 альянса Renault-Nissan, который уже применяется на автомобилях LADA Vesta.

Общие моменты

В этом материале мы рассмотрим различия механических коробок передач Jh4 и JR5, которые предусмотрены для нового компактного кроссовера. Обе коробки передач во многом одинаковы по конструкции, но различаются узлами выключения сцепления, передаточными числами в коробке, механизмами переключения передач и комфортом для пассажиров. Как одна, так и другая коробка передач для XRAY изготовлены по двухвальной схеме, и имеют синхронизаторы всех передач переднего движения, которые объединены с дифференциалом и главной передачей. Для первой и второй передачи используется 3-конусный синхронизатор. Для третьей, четвертой и пятой используются обычные синхронизаторы. Все коробки имеют защиту «от дурака» и блокируют включение задней передачи во время движение вперёд. В обе коробки еще на производстве заливается трансмиссионное масло, срок службы которого равен сроку службы всего автомобиля. Поэтому его замена при плановом техническом обслуживании автомобиля не производится.

Наглядные различия

Узел выключения сцепления коробки передач JHЗ представляет тросовое переключение соединенное с педалью сцепления. Узел выключения сцепления коробки передач JR5 представляет собой гидравлический рабочий цилиндр. Рабочий цилиндр соединен трубопроводом с главным цилиндром, на шток которого воздействует педаль сцепления. Управляют коробкой передач JНЗ с помощью жесткой тяги, а коробкой передач JR5 с помощью двух гибких тросов. В результате, включение передач коробки предназначенной для русского мотора будет более комфортным, нежели это производится у КПП для альянсовского мотора. Особенно заметно это будет сказываться на самом принципе включения, который будет производиться легче и без свойственного коробкам с тяговым управлением щелчка. Преимущество коробки Jh4 будет раскрыто только на высоких скоростях. Большее значение передаточных чисел 3,4, 5 скорости позволяют автомобилю быстрее набирать скорость и как следствие, шустрее совершать обгоны. В плане максимальной скорости эта КП тоже выигрывает у коробки JR5 для русского мотора. Максимальная скорость с русским агрегатом будет ниже на 5 км/ч. Зато количество оборотов мотора на одной и той же скорости у пары с JR5 будет ниже.

В плане расхода топлива по паспортным данным пара Renault-Nissan h5M (1.6 л. 110 л.с.) и французская механическая коробка передач Jh4 будет экономичнее нашего мотора 21129 (1.6 л. 106 л.с. ) и иностранной коробки передач JR5 альянса Renault-Nissan. Согласно данным, представленным на официальном сайте LADA, потребление в смешанном цикле будет меньше на 0.5 литра, а по трассе на 0.3 литра. Различия в расходе топлива не такие великие, и если владельцу важны меньшие вибронагрузки на рычаг КП и более лёгкое переключение скоростей, то его выбор будет комплект с русским мотором и французской коробкой. Ещё одним важным фактором будет и цена на Т.О. Комплектующие для отечественного агрегата стоят дешевле аналогичных деталей для иностранного собрата.

Механические коробки передач LADA XRAY: отличия

Разбираемся в особенностях механических КП альянса Renault-Nissan для нового русского автомобиля Lada Xray.

Также советуем ознакомиться

Лада Xray отзывы владельцев Двигатель 21179 технические характеристики Как отключить esp на Lada Xray

Источник: www.ladaxray.net

Lada Х рей Кросс Comfort 2021, механика/автомат, 1.6: цена, фото, что входит

Classic 1.6 (106), MT5, Передний, 5 мест	2021	5	1.6	106	Механика (MT5)	Передний	805 900 ₽	170 590 ₽	~~805 900 ₽~~ 635 310 ₽	9 авто	Купить
Classic / Optima 1.6 (106), MT5, Передний, 5 мест	2021	5	1.6	106	Механика (MT5)	Передний	842 900 ₽	174 290 ₽	~~842 900 ₽~~ 668 610 ₽	3 авто	Купить
Comfort 1.6 (106), MT5, Передний, 5 мест	2021	5	1.6	106	Механика (MT5)	Передний	890 900 ₽	179 090 ₽	~~890 900 ₽~~ 711 810 ₽	1 авто	Купить
Classic / Optima 1.6 (113), CVT, Передний, 5 мест	2021	5	1.6	113	Вариатор (CVT)	Передний	937 900 ₽	192 790 ₽	~~937 900 ₽~~ 745 110 ₽	8 авто	Купить
Black 1.8 (122), MT5, Передний, 5 мест	2021	5	1.8	122	Механика (MT5)	Передний	966 900 ₽	195 690 ₽	~~966 900 ₽~~ 771 210 ₽	—	Купить
Luxe 1.8 (122), MT5, Передний, 5 мест	2021	5	1.8	122	Механика (MT5)	Передний	975 900 ₽	196 590 ₽	~~975 900 ₽~~ 779 310 ₽	5 авто	Купить
Comfort 1.6 (113), CVT, Передний, 5 мест	2021	5	1.6	113	Вариатор (CVT)	Передний	985 900 ₽	197 590 ₽	~~985 900 ₽~~ 788 310 ₽	4 авто	Купить
Luxe / Prestige 1.8 (122), MT5, Передний, 5 мест	2021	5	1.8	122	Механика (MT5)	Передний	1 007 900 ₽	199 790 ₽	~~1 007 900 ₽~~ 808 110 ₽	—	Купить
Black 1.6 (113), CVT, Передний, 5 мест	2021	5	1.6	113	Вариатор (CVT)	Передний	1 026 900 ₽	201 690 ₽	~~1 026 900 ₽~~ 825 210 ₽	2 авто	Купить
Luxe / Prestige 1.8 (122), MT5, Передний, 5 мест	2021	5	1.8	122	Механика (MT5)	Передний	1 029 900 ₽	201 990 ₽	~~1 029 900 ₽~~ 827 910 ₽	4 авто	Купить
Luxe 1.6 (113), CVT, Передний, 5 мест	2021	5	1.6	113	Вариатор (CVT)	Передний	1 035 900 ₽	202 590 ₽	~~1 035 900 ₽~~ 833 310 ₽	3 авто	Купить
Cross Instinct 1.8 (122), MT5, Передний, 5 мест	2021	5	1.8	122	Механика (MT5)	Передний	1 049 900 ₽	203 990 ₽	~~1 049 900 ₽~~ 845 910 ₽	—	Купить
Cross Instinct 1.8 (122), MT5, Передний, 5 мест	2021	5	1.8	122	Механика (MT5)	Передний	1 054 900 ₽	204 490 ₽	~~1 054 900 ₽~~ 850 410 ₽	1 авто	Купить
Luxe / Prestige 1.6 (113), CVT, Передний, 5 мест	2021	5	1.6	113	Вариатор (CVT)	Передний	1 067 900 ₽	205 790 ₽	~~1 067 900 ₽~~ 862 110 ₽	1 авто	Купить
Luxe / Prestige 1.6 (113), CVT, Передний, 5 мест	2021	5	1.6	113	Вариатор (CVT)	Передний	1 089 900 ₽	207 990 ₽	~~1 089 900 ₽~~ 881 910 ₽	1 авто	Купить
Cross Instinct 1.6 (113), CVT, Передний, 5 мест	2021	5	1.6	113	Вариатор (CVT)	Передний	1 109 900 ₽	209 990 ₽	~~1 109 900 ₽~~ 899 910 ₽	—	Купить
Black 1.8 (122), MT5, Передний, 5 мест	2021	5	1.8	122	Механика (MT5)	Передний	973 900 ₽	—	973 900 ₽ 973 900 ₽	—	Купить
Black 1.6 (113), CVT, Передний, 5 мест	2021	5	1.6	113	Вариатор (CVT)	Передний	1 033 900 ₽	—	1 033 900 ₽ 1 033 900 ₽	—	Купить
Cross Instinct 1.6 (113), CVT, Передний, 5 мест	2021	5	1.6	113	Вариатор (CVT)	Передний	1 114 900 ₽	—	1 114 900 ₽ 1 114 900 ₽	—	Купить

Отслеживание промежуточных продуктов Са2 + АТФазы в реальном времени с помощью рассеяния рентгеновских лучей

Abstract

Sarco / эндоплазматический ретикулум Ca ²⁺ Транспортеры АТФазы (SERCA) регулируют передачу сигналов кальция за счет активного обратного захвата ионов кальция во внутренние хранилища. Структурные переходы, связанные с транспортом, были охарактеризованы рентгеновской кристаллографией, но критические промежуточные соединения, участвующие в переключении доступности через мембрану, отсутствуют. Мы объединили эксперименты по рассеянию рентгеновских лучей в растворе с временным разрешением (TR-XSS) и моделирование молекулярной динамики (MD) для отслеживания в реальном времени согласованной динамики цикла реакции SERCA в нативной мембране.Равновесное состояние [Ca ₂] E1 до лазерной активации отличалось расположением доменов по сравнению с кристаллическими структурами, и после индуцированного лазером высвобождения заключенного в клетку АТФ образовался промежуточный продукт длительностью 1,5 мс, который показал закрытие цитоплазматических доменов, типичных для E1 состояния со связанными Ca ²⁺ и АТФ. Последующее 13-мс переходное состояние показало ранее неразрешенную структуру исполнительного (A) домена, которая экспонировала сайт связывания АДФ после фосфорилирования. Следовательно, полученные модели TR-XSS определяют относительное время до сих пор неуловимых перегруппировок доменов в естественной среде.

ВВЕДЕНИЕ

Аденозин-5′-трифосфат (АТФ) -зависимый транспорт ионов Ca ²⁺ через мембрану сарко / эндоплазматического ретикулума (SR / ER) восстанавливает уровни кальция в цитоплазме после передачи сигналов кальция. Этот процесс очень активен при прекращении мышечного сокращения и является центральным для физиологии мышц и сердца ( 1 ), но также, например, в секреторной ( 2 ) и нейрональной ( 3 ) тканях. Аденозинтрифосфатаза (АТФаза) (SERCA) SR / ER Ca ²⁺ проходит через мембрану SR / ER и катализирует активный транспорт из цитоплазмы в SR / ER двух ионов Ca ²⁺ ( 4 ).Нарушения функциональности SERCA и, следовательно, гомеостаза Ca ²⁺, могут приводить к патологическому мышечному контролю, например, при сердечных заболеваниях, и нарушении секреторных функций ( 5 ). Гидролиз АТФ в активном центре, расположенном в цитоплазматических доменах A (исполнительный механизм), N (связывание нуклеотидов) и P (фосфорилирование), и связывание ионов в M (мембранном) домене перемещают белок между состояниями высокого (E1) и низкого (E2) ионное сродство, сопровождающееся альтернативным доступом к внутренним сайтам связывания иона (рис.1). Используя ингибиторы, аналоги АТФ и металлофториды, SERCA был захвачен и кристаллизован в промежуточных состояниях, описывающих реакционный цикл на атомистическом уровне ( 6 , 7 ). Полученные кристаллические структуры показывают, что транспорт Ca ²⁺ связан с обширными меж- и внутридоменными перестройками, которые связывают гидролиз АТФ с переносом ионов. Однако кристаллические структуры демонстрируют динамику только в локальном пространственном масштабе ( 8 , 9 ), в то время как крупномасштабная динамика вызывает исчезновение особенностей электронной плотности и, кроме того, ключевые структурные промежуточные соединения, связанные с аденозин-5′-дифосфатом (ADP) и выброс Ca ²⁺ отсутствуют (рис.1А). Мониторинг в реальном времени динамики SERCA, возможно, может разрешить переходные структурные состояния, недоступные для известных протоколов захвата, а также ответить на фундаментальный вопрос, в какой степени структурные перестройки, определенные с помощью рентгеновской кристаллографии в смесях детергент-липид, сохраняются в нативной мембране, которая имеет высокоспецифический состав липидов ( 10 ).

Рис. 1 Основные состояния, участвующие в SERCA-опосредованном транспорте Ca ²⁺.

( A ) Схема реакционного цикла основных состояний SERCA и кристаллических структур (PDB ID), использованных в структурном уточнении. [Ca ₂] E1P-ADP и [Ca ₂] E1P: ADP представляют собой переходные и ковалентные состояния фосфорилирования, [Ca ₂] E1P и [Ca ₂] E2P представляют собой фосфорилированные состояния без ADP, тогда как E2P, E2-P и E2: P _i относятся к ковалентным состояниям, переходным состояниям гидролиза и состояниям фосфофермента, связанным с P _i. ( B ) SERCA [Ca ₂] E1 (PDB ID: 2C9M) и ( C ) E2-P (PDB ID: 3N5K) кристаллические структуры с N (красный), P (синий), A (желтый) ) и домены M (серый), встроенные в имитаторы мембран саркоплазматического ретикулума [состоящие из фосфатидилхолина (синий), фосфатидилэтаноламина (красный), фосфатидилсерина (оранжевый), фосфатидилинозитола (зеленый) и сфингомиелина (розовый), необходимые для конформации липидов]). для достижения перехода E1-to-E2, связанного с транспортом Ca ²⁺.

В нормальных физиологических условиях транспортный цикл [обзор в ( 7 , 11 )] инициируется, когда белок SERCA обеспечивает доступ двух ионов Ca ²⁺ и одной молекулы АТФ к сайтам связывания в M и N доменов, соответственно, формируя таким образом состояние, связанное с Ca ²⁺, с закрытой цитоплазматической головкой ([Ca ₂] E1ATP) (рис. 1). Перестройка в первую очередь домена N для приближения к домену P создает основу для аутофосфорилирования Asp ³⁵¹, которое происходит через переходный ([Ca ₂] E1P-ADP) и ковалентный ([Ca ₂] E1P: ADP ) состояния образования фосфоэнзима.Структурные перестройки в высокоэнергетическом состоянии [Ca ₂] E1P-ADP приводят к деформации домена A, который, таким образом, тянет трансмембранные (TM) спирали M1 – M2 к цитоплазме, перекрывая ионы Ca ²⁺.

Кристаллические структуры, соответствующие состояниям Ca ²⁺-связанного E1 ([Ca ₂] E1) и Ca ²⁺-включенного фосфорилированного E1 ([Ca ₂] E1P-ADP), показали, что связывание АТФ и фосфорилирование связаны с большими структурными изменениями в цитоплазматических доменах, переходящими от открытого и динамичного к компактному и стабильному расположению ( 6 , 7 ).Однако масштабы этого структурного изменения обсуждались. Например, было высказано предположение, что гибкость N-домена вызвана отсутствием АТФ и, следовательно, не зависит от остального белка, и что кристаллизованные открытые состояния [Ca ₂] E1 представляют собой лишь некоторые из возможных состояний. в присутствии Ca ²⁺, который может не быть доминирующим, если вообще присутствует в физиологических условиях с высоким содержанием АТФ в цитоплазме ( 12 ).Структуры не содержащего Ca ²⁺ промежуточного соединения E1 демонстрируют более компактное расположение с открытым цитоплазматическим путем, ведущим к сайтам связывания Ca ²⁺ ( 13 , 14 ).

Следующим структурно известным промежуточным продуктом реакционного цикла является открытое наружу состояние E2P, захваченное BeF ₃ ^—, которое следует за диссоциацией ADP в цитоплазму ( 6 , 7 ). В этом состоянии структурные перестройки домена A индуцируют движения M1-M6, приводящие к искаженным сайтам Ca ²⁺, экспонированным в просвет SR, чтобы обеспечить высвобождение Ca ²⁺.Следовательно, в настоящее время существует пробел в структурных знаниях, связанных с переключателем доступности через мембрану. Структуры состояний Ca ²⁺, включающих [Ca ₂] E1P и [Ca ₂] E2P, связанные с высвобождением ADP (на этой стадии ADP-чувствительный) и инициированием высвобождения кальция в просвет SR, ведущего к ADP -инчувствительное состояние E2P пока неизвестно. Эти промежуточные соединения, однако, наблюдались, например, по данным биохимической ( 15 ) и флуоресцентной микроскопии ( 16 ).Остальная часть реакционного цикла проходит через состояния E2, связанные с протонированием посредством 2-3 H ⁺ (E2-P) и дефосфорилированием (E2: P _i и E2), что в конечном итоге приводит к конформации E1 и высвобождению протона для цитоплазма.

Кинетика и динамика реакционного цикла SERCA сильно зависят от температуры и условий образца. Например, исследования с временным разрешением, изолирующие частичные реакции, предположили, что этапами, ограничивающими скорость в реакционном цикле SERCA, являются переход E1P – E2P ( 17 ) или реформация состояния E1 после дефосфорилирования E2P ( 18 ), я.е. переходы внутрь-наружу или наруж-внутрь относительно мембраны в зависимости от используемого состояния образца. Следовательно, выбор экспериментальных условий, в которых накапливается состояние, ограничивающее скорость перехода E1P-E2P, может, в принципе, позволить структурные методы, которые исследуют конформационные изменения в реальном времени, чтобы предоставить структурную информацию о неуловимых фосфорилированных промежуточных соединениях, связанных с Ca ²⁺. , если они были задействованы в согласованных действиях. Кроме того, поскольку мембраны SR быстрых скелетных мышц кролика состоят из SERCA до> 90% от общего содержания белка ( 19 ), такая характеристика динамики белка может быть выполнена непосредственно в естественной среде.

В ранних исследованиях дифракции падающих рентгеновских лучей, индуцированное лазером высвобождение АТФ из заключенного в клетку АТФ [АТФ γ- (1- [2-нитрофенил] этил) эфир] использовалось для запуска синхронизации циклов реакции SERCA, что позволило обнаружить промежуточный продукт реакции, соответствующий связанному фосфорилированному Ca ²⁺ состоянию в пределах одного цикла ( 20 ). В том же исследовании аналогичное состояние [Ca ₂] E1P наблюдалось для накопления в стационарных условиях, что указывает на то, что переход E1P – E2P может быть этапом, ограничивающим скорость в транспортном реакционном цикле Ca ²⁺. .Однако эксперименты по ламеллярной дифракции на частично дегидратированных мультислоях SR могут разрешить только различия профилей, перпендикулярных нормали к мембране, в то время как исследования рассеяния в растворе в принципе позволяют моделировать трехмерные оболочки белковых структур.

Методология рассеяния рентгеновских лучей с временным разрешением (TR-XSS) может использоваться для характеристики тонкой структурной динамики в фотоактивных химических веществах ( 21 ), димеризации белков ( 22 ) и для отслеживания конформационных изменений растворимых веществ. белки ( 23 — 26 ), а также мембранные белки в мицеллах детергентов ( 8 , 27 ) и нанодисках ( 28 ).Также был предложен гибридный подход, способный разрешить как локальные, так и глобальные структурные перестройки ( 29 ). В этих экспериментах с накачкой и зондированием обычно используется импульс лазера накачки для запуска желаемой реакции, за которым следует рентгеновский зондирующий импульс. Устройства ввода на синхротронах третьего поколения могут доставлять 10 ¹⁰ фотонов на образец за один рентгеновский импульс длительностью ~ 100 пс ( 30 ). Интенсивность зондирующего импульса можно увеличить, выбирая микросекундные последовательности одиночных рентгеновских импульсов.Это увеличивает отношение сигнал-шум и подходит для отслеживания структурной динамики сложных биологических макромолекул, которые обычно реагируют во временном масштабе от микро до миллисекунд.

В этой работе мы использовали методологию TR-XSS для отслеживания структурной динамики SERCA между 20 мкс и 200 мс после лазерно-индуцированного фотолиза клеточного АТФ, тем самым охватывая как одноцикловую, так и стационарную динамику. Выбранные экспериментальные условия были специфичными для исходного состояния [Ca ₂] E1. Моделирование предымпульсного состояния TR-XSS предполагает компактное расположение цитоплазматических доменов в растворе по сравнению с кристаллическими структурами [Ca ₂] E1.Кинетический анализ структурной динамики после фотолиза клеточного АТФ соответствовал двум переходам со временем нарастания переходного состояния на 1,5 мс (промежуточное состояние) и нарастанием устойчивого состояния на 13 мс (позднее состояние). Промежуточное состояние показало перестройки домена, соответствующие связыванию АТФ и фосфорилированию состояния E1. Позднее состояние показало обширное вращение домена A в направлении положения E2P, но с доменами P, N и M, оставшимися в основном в положениях E1.Эта конформация раскрывает сайт связывания АДФ. Следовательно, TR-XSS-модель позднего состояния описывает ранее ненаблюдаемую структуру, которая соответствует ADP-чувствительному [Ca ₂] состоянию E1P.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Мониторинг динамики реакции SERCA в реальном времени

Для выявления переходных состояний SERCA мы отслеживали одноцикловую динамику и установившееся накопление в реакционном цикле SERCA, отслеживая рассеяние рентгеновских лучей от 20 мкс до 200 мс после лазерного излучения. фотолиз клеточного АТФ.Разностные спектры были получены путем вычитания спектра, записанного за 50 мкс до лазерной вспышки (рис. S1, A и B). Полученные данные о различиях содержали особенности, происходящие из перегруппировок с участием вторичных и третичных структурных элементов, а также окружающей мембраны SR. Отрицательные и положительные особенности при 0,04 и 0,09 Å ^-1, соответственно, стали различимы через 5 мс (рис. 2А), что согласуется с наблюдаемыми скоростями высвобождения АТФ из заключенного в клетку АТФ ( 31 ).Кроме того, отрицательная особенность наблюдалась при 0,12 Å ^-1 и два более слабых положительных пика при 0,16 и 0,22 Å ^-1, соответственно (рис. S1B). Данные не сильно различались после временной задержки в 50 мс, что совпадает с продолжительностью цикла реакции при аналогичных условиях ( 32 ) и указывает на накопление состояния с ограничивающим скорость затуханием для временных задержек> 50 мс. Добавление ингибитора тапсигаргина, который захватывает белок в состоянии E2 ( 33 ), полностью устранило разницу в интенсивностях (рис.2Б).

Рис. 2 Мониторинг структурных изменений и кинетики SERCA с помощью TR-XSS.

( A ) Разностные данные рассеяния рентгеновских лучей (черные линии), полученные вычитанием темных эталонов (-50 мкс) из измерений, записанных от 20 мкс до 200 мс после запуска лазера. Восстановленные данные (красные линии), полученные в результате линейной комбинации базисных спектров и соответствующих плотностей населенностей, полученных из кинетической модели [см. ( C ) и ( D )], были выровнены с экспериментальными разностными кривыми рассеяния.( B ) Данные TR-XSS для SERCA в присутствии ингибитора тапсигаргина. Масштаб оси y идентичен шкале на (A). (C) Независимые от времени базисные спектры, полученные из спектрального разложения, выявили три переходных состояния: раннее состояние (черный), промежуточное состояние (красный) и позднее состояние (синий). (D) Временные сдвиги в плотности населения ранних (черный), промежуточных (красный) и поздних (синий) переходных состояний в результате глобального соответствия трех базисных спектров экспериментальным данным.Квадраты показывают оптимальные линейные комбинации в каждый отдельный момент времени.

Временное развитие переходных состояний лучше всего было представлено последовательной моделью с тремя состояниями (см. Материалы и методы). Спектральная декомпозиция извлекла три независимых от времени базисных спектра (рис. 2C) с временем нарастания из раннего в промежуточное состояние τ ₁ = 1,5 мс и переходом из промежуточного состояния в позднее τ ₂ = 13 мс ( Рис. 2D). Поскольку спектр раннего базиса был зашумленным и происходил в том же временном режиме, что и фотоактивация клеточного АТФ, мы рассмотрели только структурную интерпретацию промежуточного и позднего базисных спектров.Образование промежуточного состояния могло бы содержать структурную информацию о временно сформированном состоянии во время первого реакционного цикла. Последующее позднее состояние определялось базисным спектром с ~ 6.5-кратной величиной спектральных особенностей по сравнению с базисным спектром промежуточного состояния. Следовательно, можно ожидать более выраженных структурных изменений, необходимых для формирования позднего состояния. Кроме того, в то время как промежуточное состояние представлено белками SERCA в самом первом раунде реакционных циклов, позднее состояние содержало задержки до 200 мс и, следовательно, также измерялось установившееся образование с учетом последующих реакционных циклов, что дополнительно способствует увеличенная величина позднего состояния.При температуре 294 K шкала времени τ ₂ соответствует ранее наблюдаемым скоростям фосфорилирования белка SERCA ( 32 , 34 ), что является относительно медленным шагом, который инициирует движение внутрь-наружу ( E1P в E2P) и транспорт Ca ²⁺ через мембрану SR ( 32 ). Подобная временная эволюция состояний также наблюдалась при независимом анализе разложения по сингулярным значениям (SVD) данных с временным разрешением, который показал присутствие второстепенного компонента при более коротких временных задержках, за которым следовало постепенное увеличение основного компонента при более длительных временных задержках. (Рисунок.S1, D и E).

Сравнение переходных состояний TR-XSS с промежуточными продуктами кристаллической структуры

Чтобы охарактеризовать идентифицированные переходные состояния структурно, мы сначала сравнили экспериментальные данные с разностными кривыми XSS, полученными вычитанием профилей рассеяния, рассчитанных из кристаллических структур. Поскольку мембраны, содержащие SERCA в нашем исследовании, были приготовлены при уровнях насыщения ионов Ca ²⁺ (см. Материалы и методы), и поскольку весь АТФ в образце был заблокирован в фотокамерах, можно предположить, что доминирующее предымпульсное состояние представлено по [Ca ₂] Структуры E1.Мы также сгенерировали разностные профили с использованием линейных комбинаций состояний E1 и E2, поскольку данные малоуглового рассеяния нейтронов (SANS) с использованием детергентов с уровнями дейтерирования, оптимизированными для обеспечения невидимого фона в не содержащем кальция буфере D ₂ O, оказались наиболее подходящими. с линейной комбинацией состояний SERCA без Ca ²⁺ E1 и E2 в растворе ( 35 ). Однако ни в одном случае линейные комбинации не превосходили посадки, полученные в результате предположения [Ca ₂] E1 [идентификатор банка данных белка (PDB): 2C9M] в качестве единственного компонента в предымпульсном растворе (таблица S1), что также согласуется в условиях эксперимента с избытком Ca ²⁺ для насыщения сайтов связывания.Следовательно, разностные профили XSS были получены путем вычитания рассчитанного рассеяния из связанного с Ca ²⁺ состояния E1 (PDB ID: 2C9M) из профилей рассеяния, рассчитанных для каждого из состояний цикла реакции SERCA: [Ca ₂] E1ATP ( PDB ID: 3N8G), [Ca ₂] E1P-ADP (PDB ID: 1T5T), [Ca ₂] E1P: ADP (PDB ID: 3BA6), E2P (PDB ID: 3B9B), E2-P ( ID PDB: 3N5K), E2: Pi (ID PDB: 3FGO) и E2 (ID PDB: 3NAL).

Рассчитанные разностные профили для кристаллических структур с E1-состоянием были почти идентичными, что отражает их структурное сходство после формирования компактного расположения цитоплазматических доменов, в то время как соответствующие рассчитанные разностные профили для кристаллических структур E2 показали большее разнообразие (рис.3, А и Б). Чтобы количественно оценить соответствие между рассчитанными и экспериментальными профилями разности XSS, мы вычислили R-фактор, который аналогичен стандартному R-фактору в кристаллографии белков (уравнение 6; см. Материалы и методы). Масштабный коэффициент использовался для приведения экспериментальных результатов к тому же масштабу, что и расчетные разностные профили рассеяния. Отражая большую величину спектра позднего базиса, этот масштабный коэффициент был в ~ 6.5 раз больше для спектра со промежуточным базисом. Поскольку этот масштабный фактор возникает не только из-за различий в структурных изменениях, но и из-за позднего состояния, включая задержки во времени, превышающие один цикл реакции, и, следовательно, большее количество белковых молекул в ограничивающей скорость конформации, сравнивались базовые спектры промежуточного и позднего состояний. отдельно к рассчитанным разностным профилям.Нормальные тепловые флуктуации белка SERCA, смоделированные при 294 К, привели к коэффициенту R 0,1 (см. «Материалы и методы»), который можно рассматривать как минимально возможное значение или идеально подходит для экспериментальных данных.

Рис. 3 Структурное уточнение спектров промежуточного и позднего базиса.

Сравнение промежуточных спектров TR-XSS ( A ) и позднего базиса ( B ) с разностными профилями рассеяния, полученными вычитанием рассчитанного рассеяния кристаллической структуры [Ca ₂] E1 (PDB ID: 2C9M) из каждого из рассматриваемые кристаллические структуры состояний E1 (идентификаторы PDB: 3N8G, 1T5T и 3BA6) и E2 (идентификаторы PDB: 3B9B, 3N5K, 3FGO и 3NAL).Смоделированная динамика перехода от кристаллической структуры [Ca ₂] E1 (PDB ID: 2C9M) в целевое состояние ( C ) [Ca ₂] E1ATP (PDB ID: 3N8G) или целевое состояние ( D ) ) E2-P (идентификатор PDB: 3N5K). На графике показаны RMSD (красный) для каждой целевой структуры и соответствующий R-фактор (черный) по отношению к (C) промежуточному и (D) позднему базисному спектрам. Кадры моделирования, соответствующие самым низким R-факторам, обведены (красным). Улучшения в лучшей посадке для промежуточного звена ( E ) (с 6.5-кратный масштабный коэффициент по отношению к спектру позднего базиса) и спектры позднего базиса ( F ) показаны для профилей разности, рассчитанных на основе кристаллических структур (черный), моделирования переходов (красный) и моделирования мембраны (пурпурный).

Сравнение позднего состояния с профилями разности кристаллической структуры дало неудовлетворительный R-фактор ~ 0,9 (таблица S2). Промежуточное состояние, однако, привело к снижению R-фактора на ~ 0,2, что предполагает, что расположение доменов в промежуточном состоянии больше напоминает наблюдаемое в кристаллографии, в то время как домены в позднем состоянии объединены в пока еще ненаблюдаемом расположении. .Особенности в спектре TR-XSS поздних состояний, не наблюдаемые в кристаллических структурах, включали выраженный сдвиг пика на q на 0,08 Å ⁻¹ и его относительный размер по сравнению с остальными особенностями, а также особенность на q <0,05 Å ⁻¹ (рис. 3Б).

Моделирование динамики переходов

Чтобы выяснить, можно ли объяснить переходные промежуточные соединения TR-XSS структурной динамикой за пределами кристаллических решеток, мы сначала смоделировали динамику перехода между кристаллическими структурами с помощью целевого моделирования молекулярной динамики (МД) без липидов.Белковые структуры экстрагировали по траекториям, начиная от состояния [Ca ₂] E1, представленного кристаллической структурой 2C9M, до каждого из семи исследованных промежуточных соединений кристаллической структуры (рис. S1, F и G). Смоделированные переходные структуры к кристаллическим структурам E1 показали снижение R-фактора с ~ 0,7 до ~ 0,5 по сравнению с промежуточным базисным спектром со среднеквадратичным отклонением (RMSD) <5 Å в сторону целевых структур (рис. 3C и рис. S2). Сравнение переходов E1 с базисным спектром поздних состояний дало более высокие R-факторы, с лучшими R-факторами, возникающими при RMSD переходов> 15 Å.Мы пришли к выводу, что промежуточное состояние, но не позднее состояние, можно объяснить закрывающим движением цитоплазматических доменов, что является первым крупным структурным переходом, ожидаемым после фотолиза заключенного в клетку АТФ для связывания SERCA. Отраженные структурным сходством состояний E1, три рассматриваемых структуры E1 дали почти одинаковые оценки R-фактора (таблица S2). Поскольку состояние [Ca ₂] E1ATP встречается первым в реакционном цикле SERCA, мы рассматриваем структуру, дающую самый низкий R-фактор в этом переходе, как кандидата на дальнейшее структурное уточнение промежуточного состояния (обведено на рис.3С). Согласие между полученными спектрами TR-XSS улучшилось за счет уменьшения положительного признака при 0,08 Å ⁻¹ по сравнению с отрицательным признаком при 0,15 Å ⁻¹, что привело к снижению R-фактора с 0,73 до 0,51 (рис. 3Е). Разложение динамики реакционного цикла на последовательные этапы с использованием известных кристаллических структур приводит к пикам при 0,07 и 0,14 Å ^-1 при переходе от состояния [Ca ₂] E1 к состоянию [Ca ₂] E1ATP, что указывает на то, что эти особенности представляют собой закрытие цитоплазматических доменов при связывании АТФ (рис.S3B).

Базовый спектр поздних состояний лучше согласуется с переходами E2, где E2P (PDB ID: 3B9B, комплекс BeF ₃, имитирующий фосфорилирование) и E2-P (PDB ID: 3N5K, комплекс AlF ₄, имитирующий дефосфорилирование) состояния привели к более низким R-факторам по сравнению с последующими состояниями E2: P _i (PDB ID: 3FGO, комплекс MgF ₄ ^2-) и E2 (PDB ID: 3NAL, стабилизированный аналогом тапсигаргина) (рис. . 3D и рис. S4). Минимальные R-факторы обоих переходов E2P и E2-P происходят из белковых структур в середине перехода к структурам-мишеням (RMSD> 7 Å).Основные улучшения были связаны с особенностью q <0,05 Å ^-1, которая не присутствовала ни в одном из профилей разности, рассчитанных по кристаллическим структурам с использованием структуры [Ca ₂] E1 в качестве общего предымпульсного состояния (рис. 3F). Однако сравнение с вкладом рассеяния рентгеновских лучей кристаллическими структурами на отдельных стадиях цикла реакции показывает, что переход в состояние E2P, а также событие дефосфорилирования связаны с особенностями при q <0.05 Å ⁻¹ (рис. S3B). Следовательно, позднее состояние может быть лучше всего объяснено ранее неуловимым расположением доменов, захваченным при переходе между состояниями E1 и E2.

Моделирование естественного окружения и локализации домена в предымпульсе [Ca

₂] E1-состоянии

Поскольку функциональность SERCA зависит от липидной среды ( 36 ), мы вставили наиболее подходящие структуры переходного белка, соответствующие промежуточному и поздние состояния, а также кристаллическую структуру [Ca ₂] E1 (PDB ID: 2C9M), представляющую предымпульсное состояние, в мембраны, которые были смоделированы в соответствии с содержанием липидов в мембране SR ( 10 ).В неограниченном МД-моделировании три структуры SERCA отбирали конформационную динамику, ограниченную исключительно наличием мембраны. По каждой траектории было извлечено 200 смоделированных структур. Пары промежуточных / предымпульсных и поздних / предымпульсных структур, которые лучше всего согласовывались с соответствующими экспериментальными данными, были идентифицированы из матриц корреляции R-фактора, полученных из 40000 разностных профилей рассеяния, сгенерированных вычитанием интенсивностей рассеяния смоделированных предымпульсных структур из тех, что были получены из промежуточных и поздних -государственное моделирование.Локальные минимумы R-фактора на разных участках траекторий моделирования соответствовали аналогичным конструктивным решениям, что демонстрирует надежность уточняющего подхода (рис. S5). Учет рассеяния от окружающего растворителя и липидов не изменил распределение R-фактора между траекториями (рис. S6, от A до C). Структурные пары, приводящие к самым низким R-факторам, были одинаковыми вне зависимости от того, было ли включено мембранное рассеяние, что, возможно, можно объяснить большими конформационными изменениями в выступающих растворимых доменах белка SERCA, доминирующими в разностном рассеянии по сравнению со структурными изменениями в мембране. .

Разностные спектры смоделированных промежуточных и поздних состояний показали лучшее согласие с данными с временным разрешением при вычитании смоделированных структур [Ca ₂] E1 по сравнению с кристаллической структурой 2C9M (рис. 3, E и F, и таблица S2). Следовательно, основная масса структур в предымпульсном состоянии в растворе недостаточно хорошо представлена кристаллической структурой 2C9M. Структуры из моделирования 2C9M, которые привели к самому низкому R-фактору для промежуточного и позднего TR-XSS состояний, были в целом похожими (RMSD основной цепи 5 Å) и показали относительно незначительные перестройки доменов M и P (рис.4, рис. S5, D и E и таблица S3). Однако положения домена A и, в частности, домена N были смещены по сравнению с кристаллической структурой. Эта перегруппировка привела к более компактному расположению доменов A и N с изменением расстояния от 45 до 29 Å между Thr ¹⁷¹ (домен A) и Lys ⁵¹⁵ (домен N).

Рис.4 Уточненные TR-XSS модели предымпульса, промежуточного и позднего состояний (домены N, A, P и M, окрашенные, как на рис.1) показаны с ближайшими соответствующими кристаллическими структурами (белый цвет) и временем нарастания образования из кинетического анализа.

Все белковые структуры были наложены на спирали M7 – M10.

Структурная интерпретация моделей TR-XSS промежуточного и позднего состояния

Уточнение моделей TR-XSS промежуточного и позднего состояния на основе МД привело к значительному снижению R-факторов до 0,48 и 0,30 соответственно , а полученные структуры являются представлениями белка SERCA в нативной среде в реальном времени (рис.3 и таблица S2). Промежуточное состояние 1,5 мс показало ограниченные перестройки доменов P (RMSD, 5,8 ± 0,7 Å) и M (RMSD, 5,7 ± 0,1 Å) по сравнению с кристаллической структурой [Ca ₂] E1ATP (PDB ID: 3N8G). (Рис. 4 и таблица S3). Однако ориентация, в частности, A-домена (RMSD, 11 ± 0,8 Å), а также N-домена (RMSD, 6,9 ± 3 Å) отличалась от кристаллической структуры, что можно объяснить присущей им гибкостью при переходе. в следующие состояния. Следовательно, промежуточная модель TR-XSS с индексом 1.Время нарастания 5 мс представляет собой раннее состояние E1, связанное с Ca ²⁺, когда цитоплазматические домены замыкаются вокруг субстрата АТФ с несколько иной ориентацией доменов A и N по сравнению с кристаллическими структурами.

Уточнение 13-мс позднего состояния привело к структуре, в которой домен A не соответствовал кристаллической структуре состояний E1 / E1P или E2P / E2, тогда как домен N лучше согласовывался с ориентацией E1 (рис. 4 и таблица S3). Домены P и M не показали явных тенденций к обоим состояниям.Позднее состояние, таким образом, захватило SERCA после частичного перемещения домена A к позиции E2P, но до любого существенного перемещения домена N. Таким образом, доменные перестройки в позднем состоянии были значительно более выраженными по сравнению с таковыми в промежуточном состоянии, что вносит вклад в наблюдаемую разницу в величинах соответствующих базисных спектров (рис. 2D). Для структурного сравнения кристаллические структуры, наиболее точно представляющие эту часть реакционного цикла SERCA, [Ca ₂] E1P: ADP (PDB ID: 3BA6) и E2P (PDB ID: 3B9B), были наложены на TR в позднем состоянии. -XSS модель.Домен A в модели TR-XSS был расположен на вращающейся оси между кристаллическими структурами [Ca ₂] E1P: ADP и E2P (рис. 5A). Сайт связывания нуклеотидов в цитоплазматических доменах открыт в кристаллической структуре E2P, в то время как он закрыт в состоянии [Ca ₂] E1P: ADP ( 37 ) (рис. 5B). Однако сайт связывания ADP оказывается экспонированным уже в модели TR-XSS позднего состояния (рис. 5C). По сравнению со структурой [Ca ₂] E1P: ADP модель TR-XSS показала структурный сдвиг фосфорилированного Asp ³⁵¹ и, таким образом, уменьшение расстояния до мотива Thr-Gly-Glu-Ser (TGES). от 28 до 18 Å, что примерно на полпути к положению E2P-состояния (рис.5D). Спирали TM1-TM3 были несколько смещены в сторону соответствующих положений E2P, но с кальций-координирующими остатками в конфигурации [Ca ₂] E1P-ADP и доменом M, полностью закрытым с обеих сторон мембраны (Fig. 5E). Следовательно, модель TR-XSS позднего состояния, вероятно, представляет собой промежуточное состояние перехода [Ca ₂] E1P: ADP в E2P, который, как мы предполагаем, является ADP-чувствительным, окклюзированным кальцием [Ca ₂] E1P. состояние (рис. 6).

Инжир.5 Динамика в реальном времени по сравнению с известными структурными перестройками.

( A ) Структурные различия в домене A между поздней моделью TR-XSS (желтый), [Ca ₂] E1: ADP (ID PDB: 3BA6; синий) и E2P (ID PDB: 3B9B; пурпурный) состояния. Домен N окрашен в красный цвет. ( B ) Кристаллическая структура [Ca ₂] E1: ADP (PDB ID: 3BA6) отображает закрытый интерфейс AN, тогда как в модели TR-XSS позднего состояния в ( C ) A домен (желтый) переместился относительно домена N (красный), открыв карман для связывания ADP (обведен кружком).Усеченная остальная часть АТФазы показана серым цветом. ( D ) Мотив TGES и динамика Asp351 в [Ca ₂] E1: ADP (ID PDB: 3BA6; голубой) и E2P (ID PDB: 3B9B; розовый) (вверху) и [Ca ₂] E1 : ADP (PDB ID: 3BA6; голубой) и позднее состояние TR-XSS (пурпурный) (внизу). ( E ) Спирали TM1 – TM3 и домены A из [Ca ₂] E1: ADP (PDB ID: 3BA6), E2P (PDBID: 3B9B) и позднее состояние с цветовой кодировкой, как в (A), и ионное связывающие остатки из позднего состояния. Усеченный остаток белка показан как прозрачная поверхность.

Рис. 6 Схематическое сравнение основных структурных перестроек между кристаллическими структурами и моделями TR-XSS.

В предымпульсном состоянии показано уменьшенное открытие цитоплазматических доменов, промежуточная модель TR-XSS подобна состоянию [Ca ₂] E1ATP, а смещение домена A в поздней модели TR-XSS открывает сайт ADP, но с доменом N еще не в позиции E2. Цветовая кодировка белков такая же, как на рис.1, АТФ и АДФ отображаются в виде четырех и трех фиолетовых пятиугольников, мотив TGES представлен зеленым прямоугольником, фосфорилированная аспарагиновая кислота окрашена в желтый цвет, а ионы кальция изображены в виде зеленых кружков. .

ОБСУЖДЕНИЕ

Мембранные белки, осуществляющие активный транспорт через липидные бислои, имеют решающее значение для широкого спектра клеточных процессов, таких как генерация ионных градиентов. Поскольку мембранные переносчики обычно очень динамичны и демонстрируют функциональную зависимость от окружающей мембраны, усилия по выявлению лежащих в основе молекулярных принципов функционирования и заболевания в идеале должны отслеживать транспортную реакцию в липидной среде при комнатной температуре в режиме реального времени.Учитывая сложность липидной среды и масштаб от микро до миллисекунд, в котором работают мембранные транспортеры, получение прямых структурных данных представляет собой серьезную проблему и еще не стандартизировано. Методология TR-XSS, используемая в этой работе, регистрирует структурные отпечатки пальцев в режиме реального времени, что в сочетании с подходящими подходами к структурному уточнению может предоставить структурные данные временных промежуточных соединений, участвующих, например, в мембранном транспорте, наряду с их кинетикой. Структурное уточнение основывается на наличии структурных данных с высоким разрешением, и поэтому методологию TR-XSS следует рассматривать как дополнительный метод в структурной биологии, который очень своевременен, поскольку он использует, например, следующие.g., последние разработки в области криогенной электронной микроскопии (крио-ЭМ).

В этой работе мы отслеживали динамику транспорта в белке SERCA после лазерно-индуцированного доступа к АТФ. Временная эволюция разностных сигналов, извлеченные константы скорости, связанные с переходным промежуточным состоянием, и накопление ограничивающего скорость состояния согласуются с наблюдаемыми скоростями фосфорилирования и оборота ферментов ( 32 ). В процедуре структурного уточнения нам нужно было смоделировать предымпульсное состояние для получения разностных данных.Выбранные экспериментальные условия с избытком Ca ²⁺ для насыщения сайтов связывания ионов SERCA, но без доступного АТФ, должны лучше всего описываться состоянием E1, связанным с Ca ²⁺. Однако структурные особенности состояния [Ca ₂] E1 обсуждаются. Кристаллические структуры формы [Ca ₂] E1 (PDB ID: 2C9M или 1SU4) принимают открытую конформацию цитоплазматических доменов ( 38 ), что резко контрастирует с более компактными структурами, обнаруженными в структурах других состояний SERCA. .Кроме того, обширные структурные перестройки, необходимые для перехода от открытого к компактному расположению растворимых доменов, не согласуются с резонансным переносом энергии Фёрстера, который не показал значительных изменений расстояния между доменами N и P в состояниях E1 и E2 ( 12 ). Модель предымпульсного состояния TR-XSS состояния [Ca ₂] E1, представленная здесь, показала заметное уменьшение междоменного расстояния N-A по сравнению с кристаллическими структурами [Ca ₂] E1 (рис.4), что указывает на преимущественно компактную конформацию цитоплазматических доменов (см. Схему на рис. 6). Однако, хотя большая часть структурного ансамбля демонстрирует замкнутое расположение цитоплазматических доменов, вполне вероятно, что также отбираются образцы более открытых конформаций, хотя и реже ( 11 ).

Вариации экспериментальных условий определяют, какое состояние SERCA накапливается в установившемся состоянии. Например, наблюдалось, что состояние [Ca ₂] E1P доминирует в присутствии KCl и высокой концентрации Ca ²⁺ ( 39 — 41 ).Кроме того, с помощью микроскопии с резонансным переносом энергии флуоресценции одиночных молекул (FRET) было показано, что АТФаза Ca ²⁺ из Listeria monocytogenes в условиях насыщения Ca ²⁺ демонстрирует лимитирующую стадию фосфорилирования и использует короткую -живой интермедиат с окклюзией кальция, который предшествует необратимой стадии, связанной с высвобождением ионов Ca ²⁺ ( 16 ). При аналогичных условиях насыщения Ca ²⁺ мы получаем прямую структурную информацию о состоянии, в котором несмещенное моделирование предполагает положение домена A, который находится между кристаллическими структурами [Ca ₂] E1P-ADP и E2P. состояний, но с доменами N и P все еще в ориентации E1.В состоянии E2P мотив TGES в домене A реструктурирован, чтобы защитить фосфорилированный Asp ³⁵¹ от цитоплазмы, что делает белок SERCA нечувствительным к возможным обратным реакциям, индуцированным ADP. В поздней конформации TR-XSS мотив TGES в домене A начал приближаться к фосфорилированному Asp ³⁵¹ (рис. 5D), и сайт связывания ADP экспонируется в цитоплазму и, следовательно, примирован для ADP. релиз. Таким образом, уточненное состояние позднего TR-XSS (с временем нарастания 13 мс) может представлять неуловимое ADP-чувствительное состояние [Ca ₂] E1P SERCA, которое после связывания ADP может преобразовывать ATP из [Ca ₂] E1P ( схему на рис.6). Триггером, высвобождающим наблюдаемую динамику, очень вероятно завершение фосфорилирования, которое, в сущности, нарушает напряженную конфигурацию цитоплазматических доменов. Одномолекулярные FRET исследования Listeria Ca ²⁺ -АТФазы показывают, что белок претерпевает очень быстрые, крупномасштабные конформационные изменения после того, как произошло фосфорилирование ( 16 ).

Возникающее мнение о том, что липиды являются аллостерическими модуляторами функции мембранных белков ( 42 ), требует усилий в области структурной биологии для мониторинга структуры и динамики белков в естественной среде.Эти исследования часто затруднены из-за неоднородности белков в нативных мембранах. Мембрана SR представляет собой исключение, поскольку она содержит> 90% белков SERCA ( 19 ), что позволяет проводить структурные исследования в естественной среде. Однако учет вкладов окружающей липидной динамики в эксперименты TR-XSS чрезвычайно сложен, и в настоящее время не существует стандартизированных методов ( 8 , 27 , 28 ). Поскольку цитоплазматические домены SERCA существенно выступают из мембраны и обнаруживают сильно доминирующие конформационные изменения, было обнаружено, что вклад окружающих липидов незначителен.Чтобы подготовить почву для характеристики менее выраженных структурных изменений белков, лишенных выступающих подвижных частей, необходимо разработать стратегии, позволяющие учитывать влияние рассеяния от окружающих липидов.

Наконец, с технической точки зрения, измерения TR-XSS фотоактивных химикатов ( 21 ), светочувствительных белков ( 8 , 23 — 28 ) и димеризации белков ( 22 ) проложили путь к успеху. способ для данных, представленных в этом исследовании.Используя лазерно-индуцированную активацию заключенного в клетку соединения для запуска транспортной реакции, наши разработки позволили расширить метод TR-XSS, включив в него мембранные белки, которые по своей природе не чувствительны к световой активации, что резко увеличивает количество потенциальных биологических мишеней, поддающихся воздействию метод TR-XSS. Кроме того, ожидаемая повышенная яркость, например, в синхротронах Европейского центра синхротронного излучения (ESRF) –Extremely Brilliant Source (EBS) (Гренобль, Франция) и лаборатории MAX IV (Лунд, Швеция) будет способствовать дальнейшему улучшению отношения сигнал-шум в TR-XSS эксперименты, что упрощает обнаружение и определение характеристик переходных промежуточных продуктов в ранее недоступных временных режимах.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Саркоплазматический ретикулум Ca

²⁺ Препарат АТФазы P-типа

Мембраны SR из быстро сокращающихся скелетных мышц кролика были приготовлены в соответствии с ( 43 ) и суспендированы в буфере, содержащем 150 мМ MOPS KOH (pH 7.0), 150 мМ KCl и 75 мкМ CaCl ₂ с последующим центрифугированием при 140000 г в течение 40 мин с последующим ресуспендированием в том же буфере с добавлением 5 мМ MgCl ₂, 10 мМ дитиотриетола и 10 мМ АТФ в клетке нитрофениэтилового эфира (NPE) (конечные концентрации) при конечной концентрации 25 мг / мл мембран SR.Чтобы избежать нарушения естественной среды, мы воздержались от экстракции детергентом белка SERCA и, следовательно, сохранили чистоту природного белка 90% ( 19 ).

Сбор данных TR-XSS

Эксперименты TR-XSS проводились на выделенном канале с временным разрешением ID09 в ESRF в Гренобле, Франция ( 44 ). Поскольку высвобождение АТФ является необратимой реакцией, очищенные и концентрированные мембраны SR, содержащие SERCA, прокачивались с постоянной скоростью потока 3 мкл / мин через кварцевый капилляр размером 300 мкм (Hampton Research), тем самым пополняя образец для каждого цикла «насос-зонд». .АТФ с клетками NPE в образце фотолизовали наносекундным лазером Ekspla NT342B на длине волны 355 нм. Лазерный луч фокусировался в месте расположения образца эллиптическим пятном размером 1 мм на 0,25 мм с плотностью энергии 1 мДж / мм ². Лазер попал в капилляр со стороны, длинной осью, параллельной направлению падающего рентгеновского луча (60 мкм на 100 мкм). Рентгеновский пучок, генерируемый ондулятором в вакууме, имел ширину полосы по энергии Δ E / E = 3% и пиковую энергию 17,5 кэВ. Расстояние между образцом и детектором составляло 400 мм, а коническая камера, заполненная гелием, помещалась между образцом и детектором для уменьшения фонового рассеяния от воздуха.Импульсы рентгеновского излучения длительностью 20 мкс выделялись от синхротрона в многосгустковом режиме с помощью высокоскоростного вращающегося прерывателя. Температура в экспериментальной клетке составляла 294 К.

Каждый эксперимент генерировал данные с определенной временной задержкой между лазерной вспышкой и рентгеновским импульсом. Удовлетворительное отношение сигнал / шум было достигнуто после измерения в каждую временную точку ~ 1000 раз. Чтобы избежать экспериментального отклонения в измерениях, временные задержки регистрировались в заранее определенном порядке и перемежались с отрицательной временной задержкой после трех временных задержек: -50 мкс, 20 мкс, 10 мс, 100 мс, -50 мкс, 5 мс, 1 мс. , 20 мс, −50 мкс, 50 мс, 2 мс и 200 мс.Следовательно, результирующий временной ряд составил 20 мс, 1 мс, 2 мс, 5 мс, 10 мс, 20 мс, 50 мс, 100 мс и 200 мс. Интенсивность рассеянного рентгеновского излучения регистрировалась на камере устройства с зарядовой связью (ПЗС) с использованием импульсов рентгеновского излучения длительностью 20 мкс, и перед каждым считыванием детектора накапливалось 40 импульсов. Временной ряд был повторен 27 раз, и разностные профили рассеяния, следовательно, являются средними из 1080 измерений, для которых потребовалось всего 20 мг мембран SR. Эксперименты проводились с частотой повторения 1 Гц, обеспечивая полное пополнение образца в промежутках между циклами.Поскольку полученные данные TR-XSS также содержат реакцию растворителя на нагревание ( 45 ), эти эффекты были устранены в соответствии с предыдущим протоколом ( 23 ) (рис. S1C). Контрольные эксперименты с буфером или клеточным АТФ в буфере не показали видимой разницы в интенсивностях при 10 и 200 мс (рис. S6, D и E).

Обработка данных

Записанные изображения XSS были интегрированы по азимуту для получения радиальных кривых интенсивности S ( q , ∆ t ) как функции величины вектора рассеяния q = 4πsinθ / λ, где 2θ — угол отклонения, λ — длина волны рентгеновского излучения, а ∆ t — временная задержка между фотоактивирующим лазерным импульсом и рентгеновским зондирующим импульсом.Для получения разностных спектров «темные» эталоны -50 мкс были вычтены из каждого спектра после нормализации в области q от 2,0 до 2,1 Å ^-1, где ожидаются минимальные различия. Данные о разнице, которые разошлись более чем в 3,5 раза по сравнению со стандартным отклонением для данной временной задержки, рассматривались как выбросы и исключались из дальнейшего анализа. В результате сохранялось не менее 85% данных для каждой временной точки. Следовательно, полученные разностные кривые рассеяния содержат только сигналы структурных перестроек в образце.

Анализ SVD

Набор данных TR-XSS был организован в матрицу м × n , содержащую разностные интенсивности рассеяния, записанные в 799 ( м ) q значениях и 9 ( n ) временных точках и разложенные используя SVD в соответствии со следующим уравнением: ∆S (q, ∆t) = U (q) SvV (∆t) T (1)

Здесь U ( q ) — это м × м матрица, содержащая ортонормированные базисные спектры набора данных ∆ S . S _v — это диагональная матрица m × n , указывающая вклады базисных спектров (сингулярные значения), а V (∆ t ) — это матрица n × n , описывающая изменение базисных спектров во времени. Исходя из этого, были определены основные компоненты, содержащие сигнал в наборе данных. В соответствии с полученными результатами SVD, которые показали один доминирующий компонент (рис. S1, D и E), амплитуды пиков в позднем базисном спектре были значительно больше по сравнению с ранним и промежуточным спектрами.

Спектральное разложение

Чтобы охарактеризовать переходные промежуточные соединения во времени, для описания разностных спектров TR-XSS использовались кинетические модели с увеличивающимся числом состояний. Данные разностного рассеяния SERCA от 0 до 2,35 Å ⁻¹ были спектрально разложены в соответствии с последовательными кинетическими моделями Раннее → k1 Позднее → k1 Промежуточное → k2 Позднее, где константы скорости соответствуют образованию переходных состояний. Кинетические модели предполагают необратимые шаги и то, что ранние состояния формируются одновременно с лазерным импульсом.Для получения не зависящих от времени базисных спектров и констант скорости, связанных с образованием переходных структурных промежуточных состояний, мы выполнили спектральную декомпозицию с глобальной подгонкой к данным разностного рассеяния SERCA S ( q , ∆ t ) в соответствии с ∆S (q, ∆t) теория = Ured (q) C (∆t) (2) где U _{красный} ( q ) — матрица размером м × k , содержащая первые k компонентов, а C (∆ t ) представляет собой матрицу k × n с кинетическими профилями для различных переходов k .Последний задается интегральными уравнениями скорости [ранний] = e − k1t (3) [средний] = k1k2 − k1 (e − k1t − e − k2t) (4) [поздно] = 1 + [(k1 * e− k2t) — (k2 * e − k1t)] / (k2 − k1) (5)

Константы скорости были оптимизированы глобальным уточнением методом наименьших квадратов между экспериментальными и восстановленными данными. Чтобы оценить соответствие экспериментальным данным, линейные комбинации полученных базисных спектров и соответствующих плотностей населенностей были подогнаны к экспериментальным разностным данным. Модель с тремя состояниями привела к лучшему глобальному методу наименьших квадратов ( S = 1.9 × 10 ⁻⁶; Рис. 2A) по сравнению с моделированием перехода между двумя состояниями ( S, = 2,9 × 10 ⁻⁶) или распадом одного состояния ( S = 1,2 × 10 ⁻⁵). Полученные базовые спектры были подвергнуты 10-точечному сглаживанию, что позволило избежать экспериментального шума.

Структурное уточнение

Кривые разностного рассеяния рассчитывали с использованием программного обеспечения CRYSOL ( 46 ). Профили разности с поправкой на атомы и растворитель показали очень похожие характеристики, но с поправкой на растворитель, которая привела к несколько худшим R-факторам, что, вероятно, зависит от того, что везикулы интактных мембран SR плохо моделируются при допущении водного окружения.Поэтому, чтобы избежать введения дополнительного подгоночного параметра и возможного переобучения экспериментальных данных, мы использовали атомное рассеяние для сравнений, которые не включали модель мембраны. Кристаллическая структура SERCA, соответствующая состоянию [Ca ₂] E1 (PDB ID: 2C9M), представляет собой «основное» состояние начального предымпульса. В качестве представителей основных промежуточных состояний SERCA были выбраны восемь кристаллических структур. Все структуры были модифицированы, чтобы они содержали только белок и такое же количество аминокислотных остатков.Полученные расчетные разностные профили рассеяния были скорректированы с учетом использования полихроматического излучения путем свертки с измеренным спектром ондулятора. R-фактор был определен для измерения соответствия между разностными кривыми XSS, предсказанными на основе структурных моделей, и экспериментальными данными разностного рассеяния в диапазоне 0 < q <0,6 Å ⁻¹ R = Σ (∆Stheory − c * ∆Sexperiment ) 2∑ (c * ∆Sexperiment) 2 (6)

Здесь ∆ S ^{эксперимент} представляет собой разностный базисный спектр XSS из спектрального разложения экспериментальных данных, ∆ S ^теория представляет вычисленную разницу Кривая XSS для данной структурной модели, а c — коэффициент масштабирования, который можно изменять, чтобы можно было сравнивать показания детектора и вычисления CRYSOL.Чтобы измерить тепловую динамику белка при комнатной температуре (т. Е. Минимальный R-фактор), целевые разностные спектры были получены из первого и последнего кадров в симуляции целевой молекулярной динамики (TMD). R-фактор 0,1 был рассчитан на основе динамики, отображаемой после полного перехода, то есть, когда белок смещен в сторону целевой структуры и, следовательно, исследует динамику, не переходя в другое состояние.

Целевое моделирование МД

Кристаллическая структура, соответствующая состоянию [Ca ₂] E1 (PDB ID: 2C9M), была центрирована в блоке моделирования с размерами 200 Å на 200 Å на 200 Å и сольватирована водами TIP3P с использованием CHARMM -GUI ( 47 ) и расслаблен в минимизации энергии наискорейшего спуска с 5000 шагов в GROMACS 5.1.4 ( 48 ), за которым следует короткое уравновешивание постоянного числа (N), объема (V) и температуры (T) (NVT) за 25 пс с временным шагом 1 фс при температуре 303,15 K, поддерживаемой Схема температурной связи Носа-Гувера ( 49 , 50 ). Параметры силового поля описывались аддитивным силовым полем для белков CHARMM36 ( 51 ). В семи целевых МД-моделированиях состояние [Ca ₂] E1 приводилось к каждому из следующих состояний (и кристаллических структур): [Ca ₂] E1ATP (PDB ID: 3N8G), [Ca ₂] E1P -ADP (ID PDB: 1T5T), [Ca ₂] E1P: ADP (ID PDB: 3BA6), E2P (ID PDB: 3B9B), E2-P (ID PDB: 3N5K), E2: Pi (ID PDB: 3FGO) и E2 (идентификатор PDB: 3NAL).В симуляциях TMD использовалась коллективная переменная RMSD из плагина для молекулярной динамики (PLUMED) ( 52 ). Для траекторий 10 нс использовалась муфта давления Парринелло-Рахмана ( 53 , 54 ) и термостат Носа-Гувера ( 49 , 50 ). Координаты белков извлекались каждые 100 пс, что давало 100 структур на траекторию и состояние TMD. Рассчитанное рассеяние из состояния [Ca ₂] E1 затем вычиталось из каждого из полученных из 100 белковых структур, равномерно распределенных по траекториям перехода, для получения 100 разностных профилей рассеяния.

Мембранные моделирование MD

Мембрана SR, содержащая 366 димиристоиламинодезоксифосфатидилхолина (DDPC), 138 пальмитоилолеоилфосфотидилэтаноламин (POPE), 48 фосфатидилсерин (POPS), была создана с использованием 12-пальмитоил-фосфатилсерина (30-пальмитоил-фосфил-фосфат), 12 пальмитоил-фосфатил-фосфат (30-спи-нид-фосфатил-фосфат). Конструктор мембран ( 55 ) в CHARMM-GUI ( 47 ). Белковые структуры SERCA были вставлены в модель мембраны SR в соответствии с базой данных Orientations of Protein in Membranes ( 56 ).Параметры силового поля описывались дополнительным силовым полем CHARMM36 для белка ( 51 ) и липидов ( 57 ). Энергия каждой системы моделирования была минимизирована с помощью метода наискорейшего спуска с 5000 шагами, с последующим постепенным уменьшением ограничений на тяжелые атомы белков и липидов для трех последовательных 25-пс моделирования NVT. В этих симуляциях использовался временной шаг 1 фс, а температура 303,15 К поддерживалась с использованием схемы температурной связи Берендсена ( 58 ).За этим последовали три последовательных моделирования NPT длительностью 100 пс с дальнейшим постепенным снятием ограничений, связанных с тяжелыми атомами. В последнем моделировании за 100 пс липиды полностью не удерживались, и им позволяли расслабиться вокруг удерживаемого белка. В этих моделированиях использовался временной шаг 2 фс, а давление поддерживалось постоянным на уровне одного бара с использованием полуизотропного баростата давления Берендсена ( 58 ).

Конформации белка, используемые в процедуре структурного уточнения, затем были получены в ходе неограниченного моделирования продолжительностью 300 нс, по одной для каждого состояния.В этих моделированиях использовался временной шаг 2 фс, а температура поддерживалась на уровне 303,15 К с помощью термостата Носа-Гувера ( 49 , 50 ) и полуизотропного баростата Парринелло-Рахмана ( 53 , 54 ) использовался для регулирования давления. Набор из 200 белковых структур был извлечен из неограниченного моделирования 2C9M (предымпульсное состояние) и вычтен из каждой из структур, сгенерированных из моделирования переходных моделей, соответствующих промежуточному и позднему состояниям, соответственно.Комбинация привела к получению 40 000 разностных профилей, которые сравнивались со спектрами промежуточного и позднего базиса.

Поскольку в динамике структуры транспорта SERCA доминируют большие конформационные изменения в растворимых доменах, выступающих из мембраны, влияние окружающих липидов на разностное рассеяние должно быть незначительным. Чтобы проверить, может ли включение перекрестных членов рассеяния на окружающие липиды и исключенный растворитель изменить структурную интерпретацию, мы смоделировали беспорядок из одного участка мембраны SR, рассчитав профили разностного рассеяния dS ( q ), включая 200-Å ² Дебая. — Фактор Валлера B, как описано ранее ( 27 , 59 ).

Статистический анализ

Для оценки ошибок при описании локализации цитоплазматических доменов мы выбрали 10 структур в предымпульсном, промежуточном и позднем состояниях из траекторий моделирования мембраны, которые получили наилучшие оценки с точки зрения R-фактора на экспериментальной промежуточной и поздней основе. спектры. R-факторы были в пределах 0,05 от наилучшего соответствия. Среднеквадратичные значения RMSD доменов A, P, N и M были рассчитаны по отношению к типичным кристаллическим структурам [Ca ₂] E1, [Ca ₂] E1P: ADP, E2P и E2-P состояний. (Идентификаторы PDB: 2C9M, 3BA6, 3B9B и 3N5K).Средние значения и SD вычисленного RMSD домена для 10 пар приведены в таблице S3.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Дополнительные материалы к этой статье доступны по адресу http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/12/eaaz0981/DC1

Рис. S1. Анализ данных и целевой подход MD.

Рис. S2. Целевой MD состояний E1.

Рис. S3. Схема реакции и различия в последовательном рассеянии рентгеновских лучей.

Рис. S4. Целевой MD состояний E2.

Рис. S5. Анализ R-фактора моделирования мембран и предимпульсных моделей TR-XSS.

Рис. S6. Вклады рассеяния растворителя и мембраны и контрольные эксперименты TR-XSS.

Таблица S1. Создание разностного рассеяния с использованием линейных комбинаций рассчитанного рассеяния на кристаллических структурах предполагаемых предымпульсных состояний.

Таблица S2. Кристаллические структуры (и идентификаторы PDB), соответствующие основным переходным ферментативным состояниям в реакционном цикле SERCA, рассматриваемые при уточнении структуры.

Таблица S3. Структурное сходство (RMSD) между доменами.

Таблица S4. Список сокращений.

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution-NonCommercial, которая разрешает использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что конечное использование будет , а не для коммерческих целей и при условии, что оригинальная работа правильно цитируется.

Благодарности: Финансирование: Эта работа была поддержана Stiftelsen Olle Engkvist Byggmästare (2015/768) Х.R., докторская стипендия IWT, предоставленная агентством Agentschap Innoveren & Ondernemen (VLAIO) AS, Lundbeck Foundation через центры BRAINSTRUC (R328-2019-546) и DANDRITE (R248-2016-2518) для PN, а также шведского исследовательского совета Стартовый грант (2016-03610), Грант на интеграцию карьеры Марии Кюри (FP7-MC-CIG-618558), Магнус Бергваллс Стифтельсе (2016-01593) и Оке Вибергс Стифтельсе (M16-0164) для MA. Шведской национальной инфраструктурой для вычислений (SNIC) через Центр высокопроизводительных вычислений Север (HPC2N) в рамках проекта SNIC 2018 / 2-32.A.D. был софинансирован Международной академией трансляционных исследований Уильяма Харви и получил финансирование от Седьмой рамочной программы Европейского Союза для исследований, технологических разработок и демонстрационной деятельности в соответствии с соглашением о гранте No. 608765. Вклад авторов: MA задумал и разработал исследование. H.R., M.N.P., M.E., A.S., C.L., A.D., M.L. и M.A. провели синхротронные эксперименты в ESRF при поддержке со стороны канала ID09, M.W.H.R. выполнила моделирование.H.R., M.N.P., A.B., P.N. и M.A. проанализировали данные. C.O. и П. предоставил образец. Все авторы внесли свой вклад в написание рукописи. Конкурирующие интересы: Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов. Доступность данных и материалов: Все данные, необходимые для оценки выводов в статье, представлены в документе и / или дополнительных материалах. Дополнительные данные, относящиеся к этой статье, могут быть запрошены у авторов.

Copyright © 2020 Авторы, некоторые права защищены; эксклюзивный лицензиат Американской ассоциации содействия развитию науки.Нет претензий к оригинальным работам правительства США. Распространяется по некоммерческой лицензии Creative Commons Attribution 4.0 (CC BY-NC).

Комбинированный подход к рентгеновской кристаллографии и компьютерному моделированию для исследования связывания C-концевого пептида Hsp90 с FKBP51

Shrestha, L., Bolaender, A., Patel, HJ & Taldone, T. HSP) Открытие и разработка лекарств: нацеливание на белки теплового шока при заболеваниях. Curr. Вершина. Med. Chem. 16 , 2753–2764 (2016).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Scheufler, C. et al. . Структура комплексов TPR домен-пептид: критические элементы в сборке многочаперонной машины Hsp70-Hsp90. Ячейка 101 , 199–210 (2000).

CAS Статья PubMed Google Scholar

Д’Андреа, Л. Д. и Реган, Л. Белки TPR: универсальная спираль. Trends Biochem. Sci. 28 , 655–662 (2003).

Артикул PubMed CAS Google Scholar

Haslbeck, V. et al. . Белки TPR, взаимодействующие с шаперонами, у Caenorhabditis elegans. J. Mol. Биол. 425 , 2922–2939 (2013).

CAS Статья PubMed Google Scholar

Hinds, T. D. Jr и Sanchez, E. R. Протеиновая фосфатаза 5. Int. J. Biochem. Cell Biol. 40 , 2358–2362 (2008).

CAS Статья PubMed Google Scholar

Эдкинс, А. Л. ЧИП: ко-шаперон для деградации протеасомой. Субъячейка. Biochem. 78 , 219–242 (2015).

CAS Статья PubMed Google Scholar

Аврамут, М. и Ахим, К. Л. Иммунофилины в дегенерации и регенерации нервной системы. Curr. Вершина. Med. Chem. 3 , 1376–1382 (2003).

CAS Статья PubMed Google Scholar

Sittler, A. et al. . Гелданамицин активирует реакцию теплового шока и ингибирует агрегацию хантингтина в модели культуры клеток болезни Хантингтона. Hum.Мол. Genet. 10 , 1307–1315 (2001).

CAS Статья PubMed Google Scholar

Auluck, P.K., Chan, H.Y., Trojanowski, J.Q., Lee, V.M. & Bonini, N.M. Подавление чапероном токсичности альфа-синуклеина в модели болезни Паркинсона у дрозофилы. Наука 295 , 865–868 (2002).

ADS CAS Статья PubMed Google Scholar

10.

Waza, M. и др. . 17-AAG, ингибитор Hsp90, облегчает дегенерацию мотонейронов, опосредованную полиглутамином. Nat. Med. 11 , 1088–1095 (2005).

CAS Статья PubMed Google Scholar

11.

Дики, К. А. и др. . Высокоаффинный комплекс HSP90-CHIP распознает и избирательно разрушает фосфорилированные клиентские белки тау. J. Clin.Вкладывать деньги. 117 , 648–658 (2007).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

12.

Banerjee, A. et al. . Контроль субклеточной локализации рецепторов глюкокортикоидов и прогестерона лиганд-связывающим доменом опосредуется различными взаимодействиями с белками тетратрикопептидных повторов. Биохимия 47 , 10471–10480 (2008).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

13.

Denny, W. B., Valentine, D. L., Reynolds, P. D., Smith, D. F. и Scammell, J. G. Иммунофилин беличьей обезьяны FKBP51 является мощным ингибитором связывания глюкокортикоидного рецептора. Эндокринология 141 , 4107–4113 (2000).

CAS Статья PubMed Google Scholar

14.

Reynolds, P. D., Ruan, Y., Smith, D. F. и Scammell, J. G. Устойчивость к глюкокортикоидам у беличьей обезьяны связана со сверхэкспрессией иммунофилина FKBP51. J. Clin. Эндокринол. Метаб. 84 , 663–669 (1999).

CAS PubMed Google Scholar

15.

Jinwal, U.K. et al. . Кочаперон Hsp90, FKBP51, увеличивает стабильность тау-белка и полимеризует микротрубочки. J. Neurosci. 30 , 591–599 (2010).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

16.

Blair, L. J. et al. . Ускоренная нейродегенерация за счет олигомеризации тау, опосредованной шаперонами. J. Clin. Вкладывать деньги. 123 , 4158–4169 (2013).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

17.

О’Лири, Дж. С. 3-й, и др., . Новая антидепрессивная стратегия для пожилых людей: устранение FKBP5 / FKBP51. PLoS One 6 , e24840 (2011).

ADS Статья PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

18.

Hartmann, J. et al. . Участие FK506-связывающего белка 51 (FKBP5) в поведенческих и нейроэндокринных эффектах стресса хронического социального поражения. Нейрофармакология 62 , 332–339 (2012).

CAS Статья PubMed Google Scholar

19.

Touma, C. et al. . Связывающий белок 5 FK506 формирует реакцию на стресс: модуляцию нейроэндокринной реактивности и копинг поведения. Biol. Психиатрия 70 , 928–936 (2011).

CAS Статья PubMed Google Scholar

20.

Албу, С. и др. . Дефицит FK506-связывающего белка (FKBP) 51 изменяет архитектуру сна и реакции восстановительного сна на стресс у мышей. J. Sleep Res. 23 , 176–185 (2014).

Артикул PubMed Google Scholar

21.

Саббаг, Дж. Дж. и др. . Связанная с возрастом эпигенетическая регуляция гена FKBP5 выборочно снижает устойчивость к стрессу. PLoS One 9 , e107241 (2014).

ADS Статья PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

22.

Майару, М. и др. . Регулятор стресса FKBP51 вызывает хроническую боль, модулируя передачу сигналов глюкокортикоидов в спинном мозге. Sci. Пер. Med. 8 , 325ra319 (2016).

Артикул CAS Google Scholar

23.

Stechschulte, L.А. и др. . Нулевые мыши FKBP51 устойчивы к ожирению, вызванному диетой, и к агонисту PPARgamma розиглитазону. Эндокринология 157 , 3888–3900 (2016).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

24.

Заннас, А. С., Вихманн, Т., Гассен, Н. К. и Биндер, Э. Б. Генная стресс-эпигенетическая регуляция FKBP5: клинические и трансляционные последствия. Нейропсихофармакология 41 , 261–274 (2016).

CAS Статья PubMed Google Scholar

25.

Gaali, S. et al. . Селективные ингибиторы FK506-связывающего белка 51 путем индуцированной подгонки. Nat. Chem. Биол. 11 , 33–37 (2015).

CAS Статья PubMed Google Scholar

26.

Yi, F. & Regan, L. Новый класс низкомолекулярных ингибиторов Hsp90. ACS Chem. Биол. 3 , 645–654 (2008).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

27.

Ядав А. и др. . Оценка потенциальных флавоноидных ингибиторов глиоксалазы-I на основе виртуального скрининга и исследований in vitro . J. Biomol. Struct.Дин. 34 , 993–1007 (2016).

CAS Статья PubMed Google Scholar

28.

Кумар, Р., Лангстрем, Б. и Даррех-Шори, Т. Новые лиганды холинацетилтрансферазы, разработанные с помощью in silico молекулярного докинга, голограммы QSAR и оптимизации свинца. Sci. Реп. 6 , 31247 (2016).

ADS CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

29.

Ву, Б. и др. . 3D-структура человеческого FK506-связывающего белка 52: значение для сборки гетерокомплекса глюкокортикоидный рецептор / Hsp90 / иммунофилин. Proc. Natl. Акад. Sci. США 101 , 8348–8353 (2004).

ADS CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

30.

Бланделл, К. Л., Пал, М., Роу, С. М., Перл, Л. Х. и Продромоу, К.Структура FKBP38 в комплексе с тетратрикопептидным связывающим мотивом MEEVD Hsp90. PLoS One 12 , e0173543 (2017).

Артикул PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

31.

Морган Р. М. и др. . Структура TPR-домена AIP: отсутствие взаимодействия клиентского белка с С-концевой спиралью альфа-7 TPR-домена AIP является достаточным для предрасположенности к аденоме гипофиза. PLoS One 7 , e53339 (2012).

ADS CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

32.

Taylor, P. et al. . Две структуры циклофилина 40: фолдинг и верность в доменах TPR. Структура 9 , 431–438 (2001).

CAS Статья PubMed Google Scholar

33.

Синарс, К. Р. и др. . Структура большого FK506-связывающего белка FKBP51, Hsp90-связывающего белка и компонента комплексов стероидных рецепторов. Proc. Natl. Акад. Sci. США 100 , 868–873 (2003).

ADS CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

34.

Нисен, Ф. Х., Берглунд, Х. и Ведади, М. Использование дифференциальной сканирующей флуориметрии для обнаружения взаимодействий лигандов, которые способствуют стабильности белка. Nat. Protoc. 2 , 2212–2221 (2007).

CAS Статья PubMed Google Scholar

35.

Виволи М., Новак Х. Р., Литлчайлд Дж. А. и Хармер Н. Дж. Определение взаимодействий белок-лиганд с использованием дифференциальной сканирующей флуориметрии. Дж . Vis . Опыт . 51809 (2014).

36.

Марз, А. М., Фабиан, А. К., Козаны, К., Bracher, A. & Hausch, F. Большие FK506-связывающие белки определяют фармакологию рапамицина. Мол. Cell Biol. 33 , 1357–1367 (2013).

Артикул PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

37.

Эмсли П., Локамп Б., Скотт В. Г. и Коутан К. Особенности и развитие Coot. Acta Crystallogr. D Biol. Кристаллогр. 66 , 486–501 (2010).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

38.

Криссинел, Э. и Хенрик, К. Сопоставление вторичных структур (SSM), новый инструмент для быстрого выравнивания структуры белка в трех измерениях. Acta Crystallogr. D Biol. Кристаллогр. 60 , 2256–2268 (2004).

CAS Статья PubMed Google Scholar

39.

Ито, С. и Навиа, М. А. Сравнение структур нативных и мутантных рекомбинантных комплексов FKBP12 человека с иммунодепрессантом FK506 (такролимус). Protein Sci. 4 , 2261–2268 (1995).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

40.

Lovell, S.C. et al. . Подтверждение структуры по геометрии Calpha: отклонения фи, пси и Сбета. Белки 50 , 437–450 (2003).

CAS Статья PubMed Google Scholar

41.

Бенкерт, П., Тосатто, С. К. и Шомбург, Д. QMEAN: комплексная функция скоринга для оценки качества модели. Белки 71 , 261–277 (2008).

CAS Статья PubMed Google Scholar

42.

Wiederstein, M. & Sippl, M. J. ProSA-web: интерактивный веб-сервис для распознавания ошибок в трехмерных структурах белков. Nucleic Acids Res. 35 , W407 – W410 (2007).

Артикул PubMed PubMed Central Google Scholar

43.

Krissinel, E. Определение олигомерных состояний белков в jsPISA на основе запасов. Nucleic Acids Res. 43 , W314 – W319 (2015).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

44.

Xu, D., Tsai, C.J. и Nussinov, R. Водородные связи и солевые мостики через границы раздела белок-белок. Protein Eng. 10 , 999–1012 (1997).

CAS Статья PubMed Google Scholar

45.

Ласковски, Р. А. и Суинделлс, М.B. LigPlot +: диаграммы взаимодействия нескольких лиганд-белок для открытия лекарств. J. Chem. Инф. Модель. 51 , 2778–2786 (2011).

CAS Статья PubMed Google Scholar

46.

D’Arrigo, P. et al. . Регуляторная роль ко-шаперона FKBP51s в экспрессии PD-L1 в глиоме. Онкотоваргет 8 , 68291–68304 (2017).

PubMed PubMed Central Google Scholar

47.

Yu, H. M., Wang, Q. & Sun, W. B. Отключение FKBP51 снижает механический болевой порог, ингибирует DRG воспалительные факторы и медиаторы боли через сигнальный путь NF-kappaB. Джин 627 , 169–175 (2017).

CAS Статья PubMed Google Scholar

48.

Fayon, M. et al. . Экспрессия генов IL-6 и FKBP51 эпителиальных клеток носовых дыхательных путей и чувствительность к стероидам у детей с астмой. PLoS One 12 , e0177051 (2017).

Артикул PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

49.

Mueller, U. et al. . Каналы макромолекулярной кристаллографии в BESSY II Берлинского центра им. Гельмгольца: текущее состояние и перспективы. Eur. Phys. J. Plus 130 , 141 (2015).

Артикул Google Scholar

50.

Стронг, М. и др. . К структурной геномике комплексов: Кристаллическая структура белкового комплекса PE / PPE из Mycobacterium tuberculosis. Proc. Natl. Акад. Sci. США 103 , 8060–8065 (2006).

ADS CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

51.

Vonrhein, C. et al. . Обработка и анализ данных с помощью инструментария autoPROC. Acta Crystallogr. D Biol. Кристаллогр. 67 , 293–302 (2011).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

52.

Tickle, I. J. et al. . Staraniso. Кембридж , Великобритания : Global Phasing Ltd . (2017).

53.

McCoy, A. J. et al. . Кристаллографическое программное обеспечение Phaser. J. Appl. Кристаллогр. 40 , 658–674 (2007).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

54.

Winn, M. D. et al. . Обзор пакета CCP4 и текущих разработок. Acta Crystallogr. D Biol. Кристаллогр. 67 , 235–242 (2011).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

55.

Bricogne, G. et al. . BUSTER версия 2.10.3. Кембридж , Великобритания : Global Phasing Ltd . (2016).

56.

Chen, V. B. et al. . MolProbity: проверка структуры всех атомов для кристаллографии макромолекул. Acta Crystallogr. D Biol. Кристаллогр. 66 , 12–21 (2010).

CAS Статья PubMed Google Scholar

57.

Шредингер Л.Л.С. Система молекулярной графики PyMOL. Версия 1 , 8 (2015).

Google Scholar

58.

Steinkellner, G., Rader, R., Thallinger, G.G., Kratky, C. & Gruber, K. VASCo: вычисление и визуализация аннотированных поверхностных контактов белка. BMC Bioinformatics 10 , 32 (2009).

Артикул PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

59.

Адамс, П. Д. и др. . PHENIX: комплексная система на основе Python для решения макромолекулярных структур. Acta Crystallogr. D Biol. Кристаллогр. 66 , 213–221 (2010).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

60.

Celniker, G. et al. . ConSurf: Использование эволюционных данных для подтверждения проверяемых гипотез о функции белков. Isr. J. Chem. 53 , 199–206 (2013).

CAS Статья Google Scholar

61.

Zhang, M. et al. . Саперонированное убиквитилирование — кристаллические структуры убиквитинлигазы CHIP U Box E3 и комплекса CHIP-Ubc13-Uev1a. Мол. Ячейка 20 , 525–538 (2005).

CAS Статья PubMed Google Scholar

62.

Kajander, T., Sachs, J. N., Goldman, A. & Regan, L. Электростатические взаимодействия Hsp-организующих белковых тетратрикопептидных доменов с Hsp70 и Hsp90: вычислительный анализ и белковая инженерия. J. Biol. Chem. 284 , 25364–25374 (2009).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

63.

Ван, Л. и др. . Молекулярный механизм негативной регуляции белка Smad1 / 5 карбоксильным концом Hsc70-взаимодействующего белка (CHIP). J. Biol. Chem. 286 , 15883–15894 (2011).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

64.

Zhang, H. et al. . Двустороннее взаимодействие между Hsp70 и CHIP регулирует убиквитинирование шаперонированных клиентских белков. Структура 23 , 472–482 (2015).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

65.

Морган, Р. М., Пал, М., Роу, С. М., Перл, Л. Х. и Продрому, С. Димеризация с заменой спирали Tah2 предотвращает смешанные комплексы с шаперонами Hsp90. Acta Crystallogr. D Biol. Кристаллогр. 71 , 1197–1206 (2015).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

66.

Теобальд, Д. Л. и Стейндел, П. А. Оптимальное одновременное наложение нескольких структур с отсутствующими данными. Биоинформатика 28 , 1972–1979 (2012).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

67.

Берендсен, Х. Дж. К., ван дер Споэль, Д. и ван Друнен, Р. ГРОМАКС: реализация параллельной молекулярной динамики с передачей сообщений. Comput.Phys. Commun. 91 , 43–56 (1995).

ADS CAS Статья Google Scholar

68.

Lindahl, E., Hess, B. & van der Spoel, D. GROMACS 3.0: пакет для молекулярного моделирования и анализа траектории. J. Mol. Модель. 7 , 306–317 (2001).

CAS Статья Google Scholar

69.

Абрахам, М. Дж. и др. . GROMACS: высокопроизводительное молекулярное моделирование за счет многоуровневого параллелизма от портативных компьютеров до суперкомпьютеров. Программное обеспечениеX 1-2 , 19-25 (2015).

ADS Статья Google Scholar

70.

Бусси, Д., Донадио, Д. и Парринелло, М. Каноническая выборка посредством масштабирования скорости. J. Chem. Phys. 126 , 014101, https: // doi.орг / 10.1063 / 1.2408420 (2007).

ADS Статья PubMed CAS Google Scholar

71.

Парринелло М. и Рахман А. Полиморфные переходы в монокристаллах: новый метод молекулярной динамики. J. Appl. Phys. 52 , 7182–7190 (1981).

ADS CAS Статья Google Scholar

72.

Essmann, U. и др. . Метод Эвальда с гладкой сеткой частиц. J. Chem. Phys. 103 , 8577–8593 (1995).

ADS CAS Статья Google Scholar

73.

Hess, B., Bekker, H., Berendsen, H. J. C. и Fraaije, J. G. E. M. LINCS: решатель линейных ограничений для молекулярного моделирования. J. Comput. Chem. 18 , 1463–1472 (1997).

CAS Статья Google Scholar

Быстрая интерпретация данных малоуглового рентгеновского рассеяния

Abstract

Основная цель структурного анализа в биофизике — выявить взаимосвязь между динамической структурой молекулы и ее физиологической функцией. Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей (SAXS) — это экспериментальный метод определения структурных характеристик макромолекул в растворе, который позволяет анализировать конформационные изменения в физиологических условиях с временным разрешением.Поскольку в таких экспериментах измеряются только пространственно усредненные интенсивности рассеяния с низким разрешением, полученной разреженной информации недостаточно для однозначного восстановления трехмерной атомистической модели. Здесь мы интегрируем информацию из SAXS в моделирование молекулярной динамики с использованием эффективных с вычислительной точки зрения моделей, основанных на нативной структуре. Динамически подгоняя исходную структуру к интенсивности рассеяния, такое моделирование создает атомистические модели, согласующиеся с целевыми данными. Таким образом, данные SAXS могут быть быстро интерпретированы, сохраняя при этом физико-химические знания и возможности выборки основного силового поля.Мы демонстрируем эффективность нашего метода на примере трех белковых систем. Моделирование более чем на два порядка быстрее, чем подходы полной молекулярной динамики, и неизменно обеспечивает сопоставимую точность. Требования к вычислениям снижаются в достаточной степени, чтобы моделирование можно было проводить на обычных настольных компьютерах вместо высокопроизводительных вычислительных систем. Эти результаты подчеркивают, что моделирование на основе структур с наведением на рассеяние обеспечивает подходящую основу для быстрого уточнения структур на ранних стадиях в соответствии с данными SAXS с особым упором на минимальные вычислительные ресурсы и время.

Информация об авторе

Белки — это молекулярные наномашины в биологических клетках, поэтому они жизненно важны для любой известной формы жизни. С эволюционной точки зрения жизнеспособная структура белка возникает на основе принципа «форма следует функции». Назначенная функция белка неразрывно связана с динамическими конформационными изменениями, которые можно наблюдать с помощью малоуглового рассеяния рентгеновских лучей. Интенсивности из SAXS содержат информацию с низким разрешением о форме белка на разных этапах его функционального цикла.Мы заинтересованы в получении непосредственно атомистической модели этой закодированной структуры. Один из эффективных подходов состоит в том, чтобы включить экспериментальные данные в компьютерное моделирование физических движений, связанных с функциями белка. Мы комбинируем интенсивности рассеяния с крупнозернистыми моделями на основе нативной структуры. Эти модели обладают высокой вычислительной эффективностью, но при этом реалистично описывают динамику системы. Здесь мы представляем наш метод быстрой интерпретации интенсивности рассеяния от МУРР для получения структурных моделей с использованием минимальных вычислительных ресурсов и времени.

Образец цитирования: Weiel M, Reinartz I, Schug A (2019) Быстрая интерпретация данных малоуглового рентгеновского рассеяния. PLoS Comput Biol 15 (3): e1006900. https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1006900

Редактор: Алексей Онуфриев, Технологический институт Вирджинии, США

Поступила: 15.08.2018; Одобрена в печать: 24 февраля 2019 г .; Опубликован: 22 марта 2019 г.

Авторские права: © 2019 Weiel et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все входные данные, включая руководство по запуску моделирования, включены в SI.

Финансирование: Эта работа поддержана Инициативой Ассоциации Гельмгольца и Сетевым фондом под номером проекта ZT-I-0003.Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Определение структуры белка является ключевой задачей современной биофизики и в конечном итоге направлено на выявление фундаментальной связи между биомолекулярной структурой и функцией. На сегодняшний день Банк данных по белкам [1] включает постоянно расширяющееся разнообразие почти 150 000 макромолекулярных структур, полученных на основе экспериментальных методов, таких как рентгеноструктурный анализ и спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР).В сочетании с биомолекулярным моделированием статические структурные модели могут быть расширены динамическими снимками даже для сложных наномашин, таких как рибосома [2, 3]. Одновременный прогресс в эксперименте и моделировании привел к объединению дополнительных методов в гибридные методы, что стало новой парадигмой для ускорения таких процедур и дальнейшего улучшения качества их результатов [4–8]. Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей (SAXS) — это экспериментальный метод для структурной характеристики биомолекул в растворе, дополняющий методы высокого разрешения, такие как рентгеновская кристаллография и ЯМР-спектроскопия.Исследования рассеяния рентгеновских лучей могут проводиться в различных условиях и предоставлять информацию как о стационарной структуре, так и о кинетике молекулярных реакций вплоть до пространственного разрешения от 50 до 10 Å [9]. Используя широкоугольное рассеяние рентгеновских лучей на основе синхротрона, временно заселенные конформации могут быть измерены в середине движения в масштабе времени 100 пс без ограничений по размеру, присущих исследованиям ЯМР и электронной микроскопии [9]. Рентгеновские лазеры на свободных электронах позволяют даже получать ультракороткие и чрезвычайно яркие импульсы рентгеновского излучения длительностью несколько десятков фемтосекунд [10].В биологическом МУРР разбавленный раствор макромолекул подвергается воздействию монохроматического рентгеновского луча. Срабатывает реакция, например путем связывания лиганда, и интенсивность упругого рассеяния регистрируется в малоугловом режиме в последующие моменты времени. Для пространственно изотропных распределений частиц эти профили интенсивности непосредственно дают информацию с низким разрешением об усредненном размере и форме молекул. Экспериментальные данные обычно обрабатываются в виде разностных кривых, где начальная интенсивность служит эталоном и вычитается из интенсивности в определенный момент времени.Такие кривые отражают различие в функциях распределения пар и, следовательно, структурные изменения во время молекулярной реакции. В профиле SAXS количество независимых точек данных обычно равно количеству независимых каналов Шеннона [9, 11]. При сферически усредненных интенсивностях рассеяния, содержащих только десятки таких точек, их информационного содержания недостаточно для определения всех степеней свободы и вывода трехмерной молекулярной модели без предварительных физических знаний. На сегодняшний день данные МУРР часто интерпретируются путем ab initio реконструкции огибающих с низким разрешением по одномерным интенсивностям рассеяния [12–14].Из-за фундаментальной неоднозначности обратной задачи МУРР уникальность получаемых моделей не может быть гарантирована. В частности, при больших структурных перестройках такие методы не дают надежных результатов. Другие подходы, такие как уточнение твердого тела [15, 16], имитация отжига коллекций фиктивных атомов [13, 17] и целевой выбор подходящих кадров из биомолекулярного моделирования [10, 18, 19], основаны на последовательном отборе образцов и сравнении с экспериментальными данными. путем создания структур-кандидатов и вычисления их соответствующих диаграмм рассеяния.Эти методы имеют немалый риск неспособности найти правильную структуру из-за присущей им неоднозначности и ограниченной выборки конформационного пространства.

Мощный подход к интерпретации малоинформативных экспериментальных данных состоит в том, чтобы интегрировать их в вычислительное описание физических движений молекулы. Здесь интенсивности рассеяния рентгеновских лучей включены в биомолекулярное моделирование через дифференцируемый член псевдоэнергетического смещения в пользу тех конфигураций, которые согласуются с данными.Данная начальная структура уточняется до кривых МУРР, в то время как лежащие в основе силовые поля обеспечивают необходимые физико-химические предварительные знания. Можно брать образцы тепловых ансамблей белков в растворе, одновременно принимая во внимание структурную информацию от SAXS. Это дает выбор физически разумных конформаций в соответствии с входной кривой рассеяния. С помощью дополнительной экспериментальной информации ускоряются структурные переходы и уменьшаются смещения потенциальных силовых полей.Подходы к включению данных SAXS в молекулярную динамику (MD) явного растворителя уже существуют, и недавние исследования подчеркивают большой потенциал объединения экспериментальных данных рассеяния с компьютерным моделированием для интерпретации динамики биомолекул в растворе [5, 20, 21]. Однако точное описание крупномасштабных конформационных движений остается технической проблемой в (предвзятой) MD из-за непомерно высоких вычислительных затрат.

Чтобы преодолеть эти проблемы, были предприняты многочисленные попытки уменьшить эффективные степени свободы системы с помощью грубого определения либо структурного разрешения, либо приложенного силового поля [22].В этой работе наше внимание уделяется моделям на основе собственной структуры (SBM) [23–26], которые исследуют динамику, возникающую из собственной геометрии системы. Согласно теории энергетического ландшафта [23, 27] и принципу минимального расстройства [28], белки обладают эволюционно сглаженной воронкой свободной энергии. SBM определяют нативное состояние как глобальный энергетический минимум воронки. В результате общий энергетический драйв к нативной структуре преодолевает кинетические ловушки, возникающие из неродных взаимодействий.Предоставляя доступ к биологически релевантным шкалам времени и длины, SBM предоставляют обширную информацию о сложных процессах, включая основные структурные изменения. Отбор проб можно улучшить, резко снизив сложность силового поля без потери основной информации о характеристиках системы. Таким образом, можно даже проводить поучительные атомистические симуляции [29, 30] на настольных ПК. Успешные применения охватывают широкий диапазон динамики белков, включая пути сворачивания [31–34] и кинетику [35].SBM также используются для предсказания структуры [36–38], интегративного структурного моделирования экспериментальных данных, например, из FRET [4] и крио-ЭМ [6], а также исследование ансамблей переходных состояний [39, 40]. Конформационные переходы, включающие несколько стабильных состояний, можно описать с помощью так называемых мульти-Gō моделей [41].

Мы систематически исследуем, как экспериментальные данные рассеяния могут быть включены в надежные теоретические модели, которые в то же время поддерживают полную молекулярную гибкость и точно описывают динамику сложных биомолекул.Моделирование SBM обеспечивает легко расширяемую основу для этого и позволяет эффективно интегрировать и интерпретировать профили интенсивности из экспериментов по рассеянию биологических растворов. Мы проверяем наш метод, исследуя структурные переходы, вызванные данными искусственного рассеяния в трех белковых системах с двумя состояниями. Достигнув результатов равного качества, мы обнаружили, что вычислительные затраты сокращаются более чем на два порядка по сравнению с методами на основе МД с явным растворителем.

Теория

Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей.

В МУРР раствор макромолекул подвергается воздействию рентгеновских лучей с длиной волны λ. Интегральная интенсивность рассеяния I регистрируется в малоугловом режиме как функция переданного импульса q = 4 π sin θ / λ, где 2 θ — угол между падающим и рассеянным излучением. Случайные положения и ориентации молекул растворенного вещества приводят к изотропному распределению интенсивности, которое для монодисперсных невзаимодействующих частиц пропорционально пространственно усредненному рассеянию от одной частицы [42, 43].Суммарное рассеяние частиц, в свою очередь, связано с контрастом, определяемым разницей электронной плотности растворенного вещества и растворителя.

Математически усредненное в пространстве рассеяние от молекулы, описываемой как дискретная сумма элементарных рассеивателей, может быть смоделировано уравнением Дебая [44]: (1) Здесь f _i — форм-фактор рассеивателя i и r _ij — расстояние между рассеивателями i и j .

Поскольку суммирование Дебая представляет собой проблему, быстрый метод повторной оценки профилей SAXS из атомистических структурных моделей является главным приоритетом для процедур динамического структурного уточнения. Вот почему в расчетах рассеяния в нашей работе используется крупнозернистое представление белка с эффективными форм-факторами на основе остатков, скорректированными на вытесненный растворитель [45–47]. В этой форме уравнение 1 не учитывает тот факт, что плотность растворителя в макромолекулярной гидратной оболочке обычно отличается от его объемного значения.Однако рассеяние гидратной оболочки обычно на несколько порядков меньше, чем рассеяние растворенных веществ и исключенных растворителей [48]. Кроме того, систематические ошибки и вклады сольватационного слоя эффективно нейтрализуются при снятии различий в интенсивности. Таким образом, менее сложная сольватационная обработка может использоваться для надежного моделирования разностных данных [20, 46]. Более подробное введение в теорию рассеяния рентгеновских лучей в молекулярных растворах можно найти в Приложении S1.

Модели на основе собственной структуры.

Структурные модели (SBM), также называемые моделями Gō-типа, обеспечивают минималистичное описание биомолекулярной динамики, возникающей из воронкообразных энергетических ландшафтов. В первом приближении дальнодействующие взаимодействия между удаленными остатками регулируются геометрией белка [24, 26]. Стабильная нативная структура в основном связана с минимальной свободной энергией. Теория энергетического ландшафта [23, 27] и принцип минимального разочарования [28] объясняют, что формирование устойчивой структуры вызвано минимально нарушенными естественными взаимодействиями, что приводит к типичной энергетической воронке [23].Результирующая динамика моделируется на основе предположения, что нативные взаимодействия обычно стабилизируются, тогда как нативные взаимодействия включаются только для сохранения надлежащего исключенного объема. Существенная часть SBM основана на ее контактном потенциале. Нативные контакты определяются парными взаимодействиями между пространственно близкими атомами остатков i и j в нативной структуре, где i > j + 3. Для стабилизации естественной складки исходной структуры каждому контакту назначается леннард -Подобный Джонсу потенциал, содержащий как привлекательный, так и отталкивающий термин.Другие нелокальные взаимодействия являются чисто отталкивающими [24]. Таким образом, основанный на полностью атомной структуре потенциал явно представляет атомную геометрию биомолекулы. С собственными длинами связки r ₀, валентными углами ϑ ₀, а также правильными и неправильными двугранными углами ϕ ₀ и χ ₀, он гласит [29]: (2) Энергетические веса связей, углов, неправильных двугранных углов и неродных контактов составляют K _b = 20000 ε / нм ², K _a = 40 ε / deg, K _i = 40 ε / град и K _nc = 0.01 ε соответственно. ε — единица приведенной энергии SBM, а градус — градус дуги. Веса для контактного потенциала K _c и потенциала собственного двугранного угла K _d получены, как в [49]. — собственное расстояние пары атомов ( i , j ) в контакте, r _ij фактическое расстояние между атомами i и j и исключенный объем для отталкивания Паули.Диэдрический потенциал позволяет занимать изомерные конформации рядом с нативным состоянием. Мы используем атомистические SBM, которые явно включают все неводородные атомы как единичные шарики с равными массами, радиусами и силовыми константами. Атомы растворителя и водорода рассматриваются неявно [29, 50].

SBM используются уменьшенные единицы измерения, то есть масштаб длины, временной масштаб, массовый масштаб и энергетический масштаб равны 1. GROMACS, естественно, использует шкалу длины в нанометрах, шкалу времени пс, шкалу а.е.м. и шкалу энергии кДж / моль.В то время как масштаб длины PDB Å можно легко преобразовать в нм, масштаб массы, масштаб времени и масштаб энергии остаются свободными. В принципе, по структуре и ее динамике можно определить общий масштаб энергии и массы для конкретной системы, а затем вывести временной масштаб. Поскольку энергетическая шероховатость, которая может замедлить динамику реальной системы, не рассматривается, это следует выполнять с большой осторожностью. В качестве альтернативы, масштабы времени можно извлечь, сравнив результаты моделирования с экспериментальными наблюдениями с использованием e.грамм. скорость сворачивания или время корреляции вращения [4]. Не существует стандартного метода расчета «реального» времени на основе моделирования конструкции. Поскольку для целей данной работы абсолютное время играет второстепенную роль, время моделирования указывается в условных единицах (усл. Ед.). В результате изначально ускоренной динамики системы, «реальная» единица времени в SBM, безусловно, длиннее, чем шкала времени ps, сообщаемая GROMACS [49]. Температура устанавливает шкалу энергии ε = k _B T и везде указывается в сокращенных единицах GROMACS.Подробное обсуждение блоков SBM см. В [49].

Расчет потенциала смещения и силы.

Для смещения моделирования в сторону конформаций, воспроизводящих определенную кривую рассеяния, потенциал SBM V _SB расширяется членом V _XS в зависимости от уравнения Дебая [20]: (3) I _calc ( q ) и I _ref ( q ) — это теоретическая интенсивность рассеяния текущей конформации моделирования и эталонная интенсивность, полученная из исходной структуры, соответственно.Δ I _exp ( q ) представляет собой разностную кривую рассеяния, измеренную экспериментально или рассчитанную с помощью теоретических кривых абсолютного рассеяния. k _χ, который задается в единицах приведенной энергии SBM ε , дает относительный весовой коэффициент смещения рассеяния V _XS относительно структурного потенциала V _SB. Веса σ _q отдельных точек q на кривой рассеяния вычисляются из экспериментальных ошибок.Здесь ошибки в разностных данных σ _Δ ( q ) предпочтительнее ошибок в эталонной кривой σ _ref ( q ), т.е. (4) соответственно. При отсутствии экспериментальных ошибок для всех σ _q установлено значение 1. Поскольку экспериментальные ошибки все больше и больше влияют на данные с увеличением угла рассеяния, данным широкоугольного рассеяния, естественно, придается меньший вес по сравнению с малоугловым. данные о рассеянии таким образом. α — это доля наблюдаемого образца, претерпевающая конформационные изменения, определяемая относительным выходом разностного эксперимента. Таким образом, × ² можно рассматривать как меру несходства рассеяния текущей конформации в моделировании по отношению к целевым данным.

Потенциал в уравнении 3 был недавно реализован в популярном пакете MD GROMACS 5 [20]. Он обеспечивает прочную основу для интерпретации данных SAXS в рамках моделирования SBM.Суммирование Дебая представляет собой проблему и, таким образом, становится дорогостоящим с точки зрения вычислений для больших биомолекул. Чтобы согласовать уровень структурной детализации с присущей низкому разрешению и крупнозернистой природой данных рассеяния в растворе, мы объединили SBM с расчетами дебаевских кривых рассеяния на основе остатков. Профили интенсивности текущих конформаций рассчитывались на лету с использованием коэффициентов рассеяния аминокислот с поправкой на вытесненный растворитель [20, 47]. Таким образом, вычислительные затраты могут быть сведены к минимуму.

Изучаемые системы

Мы исследовали структурные переходы в трех белковых системах с двумя состояниями, структура-мишень которых была изначально известна.

Головной убор Villin.

Базовый подход к выяснению механизмов сворачивания белков и конформационных переходов состоит в изучении коротких последовательностей с быстрой кинетикой сворачивания. Актин-связывающий белок виллин состоит из множества доменов, закрытых С-концевой головкой. В качестве доказательства принципа мы создали небольшую тест-систему, выделив субрегион из 21 аминокислоты между остатками 54 и 74 из ЯМР-структуры головного мозга ворсинок (VHP, код PDB 1VII [51]).Этот субдомен полипептида состоит из двух коротких спиралей, соединенных β-поворотом, и называется изогнутой конформацией. Удлиненная конформация была построена как идеальная α-спираль с идентичной последовательностью в PyMOL (вставка на рис. 1А) [52]. Среднеквадратичное отклонение (RMSD) на уровне C _α между изогнутым и вытянутым состояниями составляет 0,55 нм. Мы использовали эту систему с двумя состояниями, чтобы исследовать, как на конформационное распределение полипептида может влиять смещение биомолекулярного моделирования в сторону конфигураций, воспроизводящих теоретическую кривую рассеяния.Обратите внимание, что этот тестовый пример представляет собой очень сложный пример для SBM на основе геометрии из-за радикального изменения вторичной структуры.

Рис. 1. Моделирование концепции полипептидной системы на основе VHP.

Результаты показаны для параметров ( T , k _χ) = (90, 5 ⋅ 10 ⁻⁸ ε ). (A) Сквозное распределение расстояний C _α. Врезка: у изогнутой (светло-голубой) и вытянутой (темно-синий) конформации межконцевые расстояния равны 1.07 нм и 2,68 нм соответственно. « и обозначают средние расстояния от конца до конца для свободного изгиба (голубой), свободного удлинения (темно-синий), продольного изгиба с направлением рассеяния (пурпурный) и изогнутого к удлиненному с направлением рассеяния (фиолетовый ) SBM моделирования. (B) Данные искусственного разностного рассеяния для перехода от удлиненного к изогнутому. Были включены 50 равноотстоящих q точек между 0,1 нм ^-1 и 5 нм ^-1 (серые круги). Интенсивность дебаевских структур в эквидистантных временных точках моделирования (от синего до желтого) отображается с небольшими смещениями.(C) Начальное и целевое RMSD (вверху) и энергия смещения (внизу) в зависимости от моделируемого времени. Как исходное (удлиненное, темно-синее), так и целевое (изогнутое, светло-синее) RMSD протекало в непосредственной близости, происходили множественные структурные переходы (серые кружки) взад и вперед. V _XS первоначально значительно уменьшился, а затем демонстрировал мелкомасштабные колебания во время доработки. (D) Лучшие конструкции с точки зрения минимального целевого RMSD и энергии смещения. Структура (фиолетовый) и (бирюзовый) имеет целевые RMSD равные 0.15 нм и 0,27 нм соответственно.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1006900.g001

Аденилаткиназа.

Аденилаткиназа (AKE) — это передающий сигнал фермент фосфотрансфераза, катализирующий взаимное превращение нуклеотидов аденина АТФ + АМФ 2 АДФ. Этот трехдоменный белок, содержащий большой центральный домен CORE, фланкированный LID и доменом NMP, имеет два различных сайта связывания и играет ключевую роль в гомеостазе клеточной энергии. Обратимый переход между открытой (PDB код 4AKE [53]) и закрытой (PDB код 1AKE [54]) конформацией (рис. 2A) является типичным для его каталитической функции [55] и напрямую связан с конкурирующими нативными взаимодействиями соответствующих состояний.C _α RMSD между открытой и закрытой структурой составляет 0,71 нм. Моделирование на основе рассеяния начиналось с открытой и закрытой конформации и нацелено на закрытое и открытое состояние, соответственно.

Рис. 2. Проверка метода на примере перехода AKE от открытого к закрытому.

Результаты показаны для параметров ( T , k _χ) = (50, 8 ⋅ 10 ⁻⁹ ε ). (A) Тестовая система AKE. Открытые (зеленый) и закрытые (желтый) конформации с доменом CORE (серый) пространственно выровнены.(B) Искусственные целевые данные (серые кружки) были рассчитаны на основе абсолютных дебаевских интенсивностей. Теоретические кривые разности смоделированных структур (от синего до желтого) почти полностью совпадают с целевыми данными и построены с небольшими смещениями. (C) Начальное и целевое RMSD (вверху) и энергия смещения (внизу) в зависимости от моделируемого времени. (D) Лучшие структуры, измеренные по целевому среднеквадратичному среднему значению и энергии смещения. Структура (фиолетовый) и структура (бирюза) демонстрируют целевые RMSD 0,14 нм и 0,20 нм, соответственно.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pcbi.1006900.g002

Лизин-аргинин-орнитин-связывающий белок.

Лизин-аргинин-орнитин-связывающий белок (LAO) претерпевает крупномасштабные конформационные изменения при связывании лиганда. Как апо (код PDB 2LAO [56]), так и голо-форма (код PDB 1LST [56]) состоят из двух долей, соединенных двумя короткими нитями (рис. 3А). В то время как эти доли четко разделены в не связанном состоянии, они находятся в контакте при связывании лизина. Во время конформационного перехода один домен эффективно вращается вокруг оси шарнира, определяемой двумя точками на соседних концах β-цепи [56].Нелигандированная структура холо и апо демонстрирует RMSD C _α 0,47 нм. Моделирование, управляемое рассеянием, началось с голосостояния и направлено на апо-состояние, а затем наоборот.

Рис. 3. Проверка метода на примере перехода холо-апо белка LAO.

Результаты показаны для параметров ( T , k _χ) = (50, 9 ⋅ 10 ⁻¹¹ ε ). (A) Тест-система белка LAO. Белок LAO претерпевает крупномасштабный конформационный переход при связывании лиганда, это означает, что доли четко разделены в нелигандном состоянии (апоформа, красный цвет), тогда как во взаимном контакте со связанным лизиновым лигандом (голоформа, оранжевый).Конгруэнтные части в конформации holo и apo показаны серым цветом. (B) Искусственные целевые данные для перехода голо-апо (серые кружки). Было включено 20 q точек между 0,3 нм ^-1 и 4,6 нм ^-1. Теоретическая разность интенсивностей смоделированных структур (от синего до желтого) была нанесена с небольшими смещениями и в ходе моделирования приблизилась к целевой кривой. (C) Начальное и целевое RMSD (вверху) и энергия смещения (внизу) в зависимости от моделируемого времени. Уточнение включало один мгновенный переход от начального голографического состояния к целевому апо-состоянию с точки зрения пересечения кривых RMSD (серые точки).Когда симуляция приближается к назначенному целевому состоянию, потенциал смещения соответственно минимизируется. (D) Лучшие структуры, измеренные с помощью целевого RMSD и потенциала смещения. Структура (фиолетовый) и структура (бирюза) демонстрируют целевые RMSD 0,09 нм и 0,16 нм, соответственно.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1006900.g003

Результаты и обсуждение

Мы протестировали наш метод SBM-уточнения белковых структур в направлении данных рассеяния для трех систем с двумя состояниями.Данные искусственной разницы были получены из абсолютных интенсивностей путем вычитания исходного эталонного рассеяния из целевой кривой. Среднеквадратичное отклонение (RMSD) использовалось в качестве количественной меры для различения структурно различных конфигураций. Мы рассчитали зависящее от времени RMSD траектории относительно начальной и целевой структуры на уровне C _α, называемом начальным и целевым RMSD. Время расчета, связанное с приближением траектории к конструкции с целевой RMSD менее 0.2 нм было извлечено в качестве оценки эффективности. Энергия смещения V _XS была проанализирована как функция моделирования времени. Чтобы оценить его пригодность в качестве надежного идентификатора физически разумных структур, соответствующих целевым данным, мы исследовали его корреляцию Пирсона ρ с целевым среднеквадратичным отклонением. Результаты показаны для комбинаций параметров температуры и прочности связи, оптимизированных с помощью вариационных исследований с поиском по сетке. Минимальное целевое RMSD, средний потенциал смещения и среднее значение χ ² (см. Уравнение 3) были извлечены как функции веса смещения в диапазоне 10 ⁻¹¹ ε и 10 ⁻⁷ ε при температуры 50, 70, 90 и 110.Мы рассматривали минимальное целевое RMSD в качестве основного индикатора для оценки того, сходится ли симуляция достаточно близко к цели, чтобы предоставить реальный шанс наблюдать интересующие конформации, несмотря на сильную предвзятость SBM в сторону естественного состояния. Вместе с потенциалом смещения может использоваться для оценки степени структурной конвергенции в рамках одного моделирования. В дополнение к V _XS, мы проанализировали среднее отклонение χ ² кривых рассеяния, полученных при моделировании, по отношению к целевым данным.Этот параметр использовался для оценки степени конвергенции на уровне чистых данных между симуляциями с использованием различных комбинаций параметров.

Кроме того, мы провели аналогичное МД-моделирование явного растворителя на основе рассеяния для сравнительной проверки производительности. Чтобы гарантировать структурное соответствие между ансамблями, созданными с помощью SBM и МД с явным растворителем, мы рассчитали радиус инерции и асферичность как функции моделируемого времени (см. Приложение S2 и рис. S1, S2 и S3). Подробное описание схем моделирования приведено в разделе «Материалы и методы».

Головной убор Villin

Для полипептидной системы на основе VHP (вставка на рис. 1A) моделирование для подтверждения концепции было направлено на переходы от изогнутой к удлиненной и от удлиненной к изогнутой конформации. Данные по целевому рассеянию были рассчитаны с помощью уравнения Дебая (уравнение 1). Мы проанализировали удлиненность основной цепи путем извлечения расстояний между N-концевым и C-концевым атомами C _α как для свободного, так и для управляемого рассеяния SBM-моделирования. Распределение расстояний (рис. 1A) демонстрирует явный сдвиг в сторону сквозного расстояния целевой структуры.Это подтверждает, что, как и предполагалось, конформаций, которые не соответствуют целевой кривой, избегают при моделировании на основе рассеяния. Чтобы показать степень сходства между типичными картинами рассеяния рентгеновских лучей из уточненных и целевых данных, дебаевские интенсивности смоделированных структур проиллюстрированы на рис. 1B. Кривые до некоторой степени сходятся, но не показывают полного совпадения. Это связано с тем, что уточнение управляется не только смещением рассеяния, но и физико-геометрическим SBM, так что устанавливается равновесие между этими двумя составляющими.Время вычисления масштабируется от 1,4 до 1 для симуляций с управляемым рассеянием и свободным SBM-моделированием. Поскольку суммирование Дебая представляет собой проблему (см. Уравнение 1), соотношение времени вычислений с учетом рассеяния и времени свободных вычислений будет существенно увеличиваться с увеличением размера системы. В этом контексте быстрая оценка профилей SAXS из структурных моделей становится еще более важной для процедур динамического уточнения, таких как биомолекулярное моделирование на основе рассеяния.

Зависящие от времени кривые среднеквадратичного отклонения и потенциал смещения изображены на рис. 1С и панели А на рис. S4 для перехода от удлиненного к изогнутому и от изогнутого к удлиненному, соответственно.Направление моделирования к целевым данным рассеяния, очевидно, приводит к двунаправленному структурному переходу, происходящему взад и вперед. Минимальные целевые RMSD составляют 0,15 нм (рис. 1D) и 0,19 нм (панель B на рис. S4), соответственно. Это означает, что конформационные изменения, открывающие структуру, от довольно компактных к более обширным структурам труднее отследить, чем те, которые закрывают структуру. Свободное моделирование SBM изогнутой и вытянутой конформации дало средние значения RMSD для C _α 0,17 нм и 0.18 нм соответственно. В свете этого SBM-моделирование с наведением на рассеяние позволило воспроизвести каждую целевую структуру с присущей этому методу максимально возможной точностью. Несмотря на резкое изменение вторичной структуры, они могли правильно моделировать конформационный переход в обоих направлениях и постоянно отбирать физически разумные структуры вблизи целевой конформации. Параметры результатов сведены в Таблицу 1 вместе со значениями, полученными при аналогичном моделировании МД с явным растворителем. С учетом времени вычислений метод на основе структуры оказался на два порядка быстрее, чем подход полной МД в отношении времени настенных часов.Подробные результаты МД с явным растворителем можно найти на рис. S5 и S6. Энергия смещения анализировалась как функция RMSD цели траектории. Как показано на рис. 4A, низкий потенциал смещения в основном связан с низким целевым среднеквадратичным отклонением. Корреляция Пирсона ρ 0,44 указывает на то, что они фактически положительно коррелированы. Однако мы находим значительно разбросанный ансамбль различных структур при равных уровнях потенциала смещения. При потенциале смещения 0,88 ε минимальная целевая RMSD-структура не находится точно в энергетическом минимуме.Результаты для обратного перехода представлены на панелях C и D на рис. S4. Аналогичные результаты МД с явным растворителем можно найти на панелях C и D на рис. S5 и S6.

Рис. 4. Зависимость потенциала смещения от целевого среднеквадратичного отклонения для перехода от удлиненного к изогнутому.

(A) Потенциал смещения относительно целевого RMSD. (B) (фиолетовый) и (бирюзовый) структуры имеют среднеквадратичное отклонение C _α 0,25 нм относительно друг друга.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1006900.g004

Чтобы изучить влияние температуры и веса смещения, мы провели вариационные исследования с поиском по сетке.Результаты показаны на фиг. 5A и 5B для перехода от удлиненного к изогнутому и от изогнутого к удлиненному, соответственно. Как только первоначально возрастающий спад ( T = 50, 70) или плато ( T = 90, 110), сходится к среднему значению связанных бесплатных симуляций (см. Таблицу 1). Среднее значение χ ² Соответственно минимизируется несходство смоделированных кривых рассеяния с целевыми данными. Предполагается, что вблизи этих точек поворота, обозначенных ниже, структурный потенциал и смещение рассеяния полностью сбалансированы.Это способствует быстрым конформационным переходам в соответствии с целевыми данными с учетом физико-геометрической модели, но предотвращает переоснащение данных. В SBM потенциал смещения должен быть взвешен таким образом, чтобы внести отчетливый конкурирующий минимум в исходную энергетическую воронку с одним бассейном. Мы настроены так, чтобы обеспечить возникновение четкого перехода, при этом как можно меньше изменяя основной регулярный потенциал. Переход от удлиненного к изогнутому дает меньшие размеры (см. Рис. 5A) по сравнению со случаем перехода от изогнутого к удлиненному (см. Рис. 5B).Такое поведение подтверждает наш предыдущий вывод о том, что переходы, закрывающие структуру, предпочтительнее, чем переходы, открывающие структуру.

Рис. 5. Вариационное исследование для тестовой системы на основе VHP.

Минимальное целевое среднеквадратичное значение, средняя энергия смещения и среднее значение χ ² Несходство для перехода из вытянутого в изогнутое (A) и из изогнутого в удлиненное (B) в зависимости от силы связи k _χ при разных температурах T . Всего вариационный ряд составил 296 расчетов.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1006900.g005

Мы обнаружили, что для обоих переходов эффект постепенного увеличения константы связи менее выражен при более высоких температурах (рис. 5). Примечательно, что, независимо от k _χ, все моделирование при T = 110 могло — по крайней мере временно — определять конформации вблизи цели. Повышенная тепловая энергия позволяет преодолеть потенциальные барьеры в энергетическом ландшафте, что приводит к большей гибкости белка и мощности выборки.Однако эти тепловые структурные флуктуации сами по себе изотропны в конформационном пространстве и не направлены на какую-либо конкретную конформацию, как в случае с большим смещением рассеяния. Напротив, при более низких температурах T, = 50 и 70 значения почти удваиваются с увеличением k _χ до порядка 10 ⁻⁸ ε , прежде чем они также значительно уменьшатся. С меньшей доступной тепловой энергией и увеличенной связью моделирования с интенсивностями рассеяния, придающей большее значение структурной информации от SAXS, это соответствует ожиданиям.Помните, что глобальное изменение ориентации элементов вторичной структуры относительно друг друга существенно влияет на общую форму полипептида. Как следствие, эта система требовала большой температуры (и веса смещения) для обеспечения достаточной глобальной конформационной гибкости и стабильного достижения конформации вблизи цели.

Хотя основная тенденция должна быть сохранена, эти результаты не могут быть напрямую перенесены на другие белковые системы. Оптимальная комбинация температуры T и веса смещения k _χ зависит от отдельной системы и должна определяться с помощью поиска по сетке или других методов систематической оптимизации параметров.В SBM общая контактная и двугранная энергия устанавливается равной количеству атомов в системе [49]. Такой выбор дает температуру складывания, близкую к 1 в единицах сокращенной конструкции, что соответствует примерно 120 единицам пониженной температуры GROMACS, и обеспечивает согласованную параметризацию. Таким образом, присущие модели абсолютные энергии сильно зависят от системы и не сопоставимы между различными системами. Различаются не только биомолекулярные системы в целом и, следовательно, их соответствующие абсолютные энергии, но и природа их индивидуальных конформационных переходов, каждый из которых связан с определенным энергетическим барьером разной (неизвестной) высоты.Из-за большого разнообразия биомолекулярных систем для разных систем требуются разные веса смещения и температуры, чтобы подходящим образом воздействовать на основанный на основной структуре потенциал и обеспечивать достаточную тепловую энергию для индукции или ускорения интересующего конформационного перехода. Эти параметры не подлежат передаче и должны определяться отдельно для каждой системы.

Аденилаткиназа

Моделирование крупномасштабного структурного перехода между открытой и закрытой конформацией на основе данных искусственного различия дает теоретически построенный тестовый пример реального движения белка.Моделирование начиналось с открытого и закрытого состояния и нацелено на закрытое и открытое состояние соответственно. Мы вычислили искусственные данные о разнице целевых показателей (рис. 2В), используя уравнение Дебая на аминокислотном уровне. Кривые среднеквадратичного отклонения и энергии смещения для перехода «открыто-закрыто» и «закрыто-открыто» показаны на рис. 2C и панели A на рис. S7, соответственно, демонстрируя, как структурное сходство с начальным и целевым состояниями развивается в ходе моделирования. Оба уточнения показали один четкий переход от исходной конформации к целевой в форме немедленного пересечения кривых RMSD. V _XS мгновенно сворачивается соответственно. Впоследствии целевые кривые RMSD приближались к соответствующим средним значениям свободных RMSD. Лучшие структуры, измеренные целевым среднеквадратичным отклонением и энергией смещения, показаны на рис. 2D и панели B на рис. S7, соответственно. Минимальное целевое RMSD составляет 0,14 нм для обоих направлений конформационного перехода. Подробные результаты аналогичных МД моделирования явного растворителя можно найти на S8 и S9 рис. Все параметры результатов приведены в таблице 2.Учитывая время вычислений, уточнения на основе структур оказались быстрее почти на два порядка, чем подход полной MD, при этом были получены более точные структуры с точки зрения минимального целевого RMSD. Мы проанализировали энергию смещения как функцию целевого RMSD (Рис. 6A и Панель C на S7 Рис.), Которые выявили положительные корреляции Пирсона повсюду. В результате почти мгновенных структурных переходов возникло множество подобных конформаций с малой энергией смещения и целевым среднеквадратичным отклонением менее 0.2 нм действительно существуют, что дает плотный кластер колеблющихся точек (RMSD _target, V _XS) в этой области. Такое поведение нарушает потенциальную линейную связь между этими величинами, как предполагается в корреляционном анализе Пирсона, вызывая довольно небольшие, но определенно положительные значения для ρ . Мы провели вариационные исследования с поиском по сетке для перехода от открытого к закрытому (см. Рис. 7A) и от закрытого к открытому (см. Рис. 7B) перехода. Как указано в областях неопределенного потенциала смещения на рис. 7, моделирование с использованием веса смещения k _χ больше 10 ⁻⁸ ε явно провалилось.В зависимости от χ ² чрезмерный вес смещения может привести к очень большому потенциалу смещения. Это создает недопустимо большую силу, которая в конечном итоге приводит к отказу интегратора. Для обоих направлений конформационного перехода вес смещения поворота составляет порядка 10 ^-10 ε . В этот момент потенциал смещения явно демонстрирует свой глобальный минимум, и среднее различие χ ² значительно падает соответственно.В отличие от полипептида VHP, более низких температур было достаточно для стабильного отбора образцов конформаций вблизи целевой структуры. Это связано с тем, что структурный переход AKE не вызывает резкого общего изменения его молекулярной формы.

Рис. 6. Зависимость потенциала смещения от целевого RMSD для перехода AKE из открытого состояния в закрытое.

(A) Потенциал смещения относительно целевого RMSD. (B) (фиолетовый) и (бирюзовый) структуры имеют RMSD C _α 0,14 нм относительно друг друга.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1006900.g006

Рис. 7. Вариационное исследование AKE.

Минимальное целевое среднеквадратичное значение, средняя энергия смещения и среднее значение χ ² Несходство для перехода «открыто-закрыто» (A) и «закрыто-открыто» (B) как функция силы связи k _χ при разных температурах T . Всего вариационный ряд составил 296 расчетов.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pcbi.1006900.g007

Лизин-аргинин-орнитин-связывающий белок

После связывания лизина белок LAO (рис. 3A) претерпевает серьезные структурные изменения [56]. Моделирование движения этого домена на основе искусственных разностных данных дает еще один тестовый пример реального движения белка. Начиная с кристаллической структуры нелигандированного голосостояния, эти симуляции нацелены на несвязанное апо-состояние и наоборот. Эталонное и целевое рассеяние были рассчитаны на основе кристаллических структур с помощью CRYSOL [57] и, таким образом, неявно включают вклады гидратной оболочки.Мы сгенерировали искусственные разностные данные (рис. 3B) путем вычитания рассеяния исходного решения из рассеяния целевого решения. Зависящие от времени начальное и целевое RMSD, а также потенциал смещения показаны на рис. 3C и панели A на рис. S10 для имитаций голо-апо и апо-голо на основе структуры, соответственно. Смещение моделирования к теоретическим разностным данным привело к тому, что переходы стали происходить легко. Потенциал смещения минимизируется почти мгновенно в соответствии с приближением траектории к целевому состоянию.Конечная целевая RMSD прибл. 0,2 нм соответствовало соответствующему свободному моделированию. Для обоих направлений конформационного перехода лучшие структуры демонстрируют минимальное целевое RMSD 0,09 нм (рис. 3D и панель B на рис. S10). Уточнения на основе структур позволили создать структуры, полностью соответствующие заданному состоянию. При равных вычислительных ресурсах им требовалась лишь небольшая часть вычислительного времени по сравнению с аналогичными МД-симуляциями с явным растворителем. Подробные результаты полного МД можно найти на рис. S11 и S12.Учитывая переход голо-апо, уточнение явного растворителя ( t _sim = 10 нс) длилось 4 дня 15 часов 5 минут 35 секунд, тогда как цикл SBM ( t _sim = 2000 усл. Ед. ) длился 4 ч 11 мин 55 с. Судя по времени вычисления, относящемуся к траектории приближения к состоянию с целевым RMSD менее 0,2 нм, SBM оказался в десять раз быстрее с точки зрения времени настенных часов. Все параметры результатов приведены в Таблице 3.

Как и в других тестовых системах, энергия смещения и целевое RMSD демонстрируют положительную корреляцию Пирсона на всем протяжении.Согласно рис. 8A и панели C на рис. S11, структурное разнообразие при равных уровнях потенциала смещения одинаково для SBM и MD с явным растворителем. Хотя лучшая структура не может быть определенно определена по траектории на основе V _XS сама по себе, потенциал смещения может служить основным индикатором текущего состояния моделирования и возможного успеха или неудачи.

Рис. 8. Смещение потенциала по сравнению с целевым RMSD для перехода голо-апо белка LAO.

(A) Потенциал смещения относительно целевого RMSD.(B) (фиолетовый) и (бирюзовый) структуры имеют среднеквадратичное значение C _α RMSD 0,16 нм относительно друг друга.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1006900.g008

Вариационные исследования с поиском по сетке для переходов как от голо-апо, так и из апо-голо показали аналогичное поведение, что и для AKE. Как подчеркнуто областями неопределенного потенциала смещения на рис. 9, моделирование с применением веса смещения k _χ больше 6 ⋅ 10 ⁻⁸ ε не удалось из-за чрезмерно больших сил, связанных с рассеянием.Для обоих направлений структурного перехода вес смещения поворота составляет прибл. 10 ⁻¹⁰ ε . Среднее значение χ ² здесь явно минимизируется (рис. 9A и 9B, внизу), в то время как потенциал смещения не имеет четкого минимума, как в случае AKE, а начинает монотонно увеличиваться в зависимости от k _χ (рис. 9A и 9B, в центре). Опять же, эволюция минимального целевого RMSD указывает на то, что более низких температур достаточно для стабильного достижения целевой конформации (рис. 9A и 9B, вверху).Это связано с тем, что конформационный переход соответствует относительному перемещению субдоменов в структуре, так что молекулярная форма не претерпевает резких общих изменений. Чтобы оценить устойчивость метода к ошибкам в данных рассеяния, мы провели уточнение на основе структуры перехода холо-апо белка LAO в сторону зашумленных данных искусственного различия. Теоретические абсолютные кривые рассеяния эталонной и целевой структуры были размыты в соответствии со случайным гауссовым шумом.Для каждой точки q среднее и стандартное отклонение моделировались как соответствующее значение чистой интенсивности и его квадратный корень, соответственно. Подробности описаны в Приложении S3. Мы рассчитали данные о разнице зашумленных изображений путем вычитания размытой эталонной интенсивности из размытой целевой интенсивности (рис. 10). Используя обычное распространение ошибок, ошибки были рассчитаны как сумма абсолютных стандартных отклонений гауссианы и использованы для индивидуального взвешивания q точек в моделировании. Мы применили те же параметры, что и при уточнении для чистых данных.Хотя потенциал смещения выравнивается при значительно более высоком значении, чего и следовало ожидать, моделирование могло создать структуры равного качества и, таким образом, оказалось устойчивым к ошибкам, по крайней мере, для предполагаемого здесь уровня шума (см. S13 Fig). Еще раз отметим, что моделирование SBM на основе рассеяния обходится без дорогостоящих в вычислительном отношении эффектов растворителя. Ввиду этих результатов мы не обнаружили необходимости в явной сольватации в уточняющих моделях, включающих данные малоуглового рассеяния вплоть до максимального переданного импульса 5 нм ^-1.Тот факт, что моделирование SBM в сочетании с данными малоуглового разностного рассеяния может воспроизводить каждое целевое состояние с высокой точностью, указывает на то, что такие кривые содержат достаточно информации, чтобы направить моделирование к правильной конформации, по крайней мере, для систем, изучаемых здесь. Несмотря на меньший уровень сложности по сравнению с МД с явным растворителем, моделирование SBM на основе рассеяния давало результаты одинакового качества за небольшую долю времени вычислений.

Рис. 9. Вариационное исследование белка LAO.

Минимальное целевое RMSD, средняя энергия смещения и среднее значение χ ² несходство для перехода голо-апо (A) и апо-голо (B) как функция силы связи k _χ при разных температурах T . Всего вариационный ряд составил 296 расчетов.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1006900.g009

Рис. 10. Зашумленные данные искусственного различия для перехода холо-апо белка LAO.

(A) Размытые абсолютные интенсивности исходного голографического состояния (оранжевые кружки, слева) и целевого апо-состояния (красные кружки, справа) вместе с соответствующими четкими кривыми рассеяния (сплошные линии) и планками погрешностей. Для каждой точки q значение «размытой» интенсивности было случайным образом взято из распределения Гаусса с центром на соответствующей чистой интенсивности. Стандартное отклонение и ошибку интенсивности рассчитывали как квадратный корень из значения чистой интенсивности. (B) Разностные данные рассеяния с шумом (синие кружки) были получены путем вычитания размытой абсолютной начальной интенсивности (оранжевые кружки выше) из размытой абсолютной целевой интенсивности (красные кружки выше).Данные чистой разницы показаны сплошной линией с соответствующими полосами погрешностей. Ошибки были получены путем обычного распространения ошибок и использованы для индивидуального взвешивания различных точек q при моделировании.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1006900.g010

Выводы

Фундаментальная парадигма биофизики белков — это взаимозависимость структуры и функции макромолекул. В свете этого, малоугловое рассеяние рентгеновских лучей приобрело большое значение, особенно для структурного анализа растворенных макромолекул.Точная интерпретация результирующих интенсивностей рассеяния с помощью атомистических моделей все еще остается сложной задачей. Включая информацию из SAXS в структурные модели, мы стремились к эффективной интерпретации данных рассеяния в рамках компьютерного моделирования. Изучив три разные тестовые системы, мы доказали, что наш метод способен эффективно исследовать переходы реальных белков, основываясь только на данных рассеяния с низким разрешением. Получая результаты, эквивалентные результатам аналогичных методов полного МД [20], моделирование SBM с наведением на рассеяние может ускорить интерпретацию интенсивностей биологического МУРР примерно на два порядка.Такие симуляции выигрывают от обширной выборки в результате их внутренней ускоренной динамики. Они могут быстро создавать структурные ансамбли в соответствии с входными данными и обеспечивать ценную альтернативу для эффективного уточнения атомистических структур по данным SAXS. Таким образом, они особенно подходят для начального высокопроизводительного анализа и могут легко выполняться на обычном стандартном оборудовании. При желании полученной структуре все же можно придать окончательную полировку в пределах обычного силового поля MD.В результате технического прогресса в источниках света и детекторах широкоугольный режим, кодирующий локальные структурные флуктуации, становится все более доступным в эксперименте. Чтобы повысить разрешающую способность эксперимента, может быть показано более детальное моделирование за счет резко возросших требований к вычислениям [5, 21].

Наконец, важно отметить, что некоторые системы не могут быть проанализированы напрямую с помощью SAXS. Во всех тестовых системах структурные переходы могут быть смоделированы коллективным движением вдоль одной эффективной степени свободы, что существенно влияет на форму белка и, таким образом, на разностную кривую при q ≤ 2 нм ^-1.Как следствие, структурная подгонка была уникальной. Однако при более высоких значениях q несколько структур-кандидатов могут создавать мешающие элементы в профилях различия. Например, структурные изменения в цитоплазматической части протеина сенсорной гистидинкиназы (код PDB 2C2A [58]) вызывают сдвиг RMSD C _α на 1,25 нм. Этот конформационный переход можно эффективно описать как вращение одного субдомена вокруг спирального пучка, но влияет на общую молекулярную форму лишь незначительно.Несмотря на существенное снижение потенциала смещения, уточнения теоретических данных о разнице не совпали с целевой структурой. Это означает, что существуют структуры, которые адекватно воспроизводят разностные данные, но несовместимы со структурными моделями, полученными с помощью кристаллографических методов. Эти результаты согласуются с результатами, представленными в [20], и из-за недостатка информации в экспериментальных данных с низким разрешением, что приводит к недопустимо высоким требованиям к теоретической модели.

При этом протокол для интерпретации данных SAXS в SBM, установленный в этой работе, может служить подходящей отправной точкой для дальнейших разработок. К ним относятся, например, расширение SBM для одного бассейна до моделей с несколькими Gō с несколькими минимумами и тестирование других функциональных форм потенциала смещения. Кроме того, мы намерены напрямую связать структуру уточнения на основе структуры с методами оптимизации параметров, такими как байесовский вывод. Кроме того, мы видим несколько возможностей расширить нашу гибридную структуру, чтобы дополнительно учесть информацию, полученную с помощью других экспериментальных методов, помимо SAXS.Мы планируем расширить рамки, учитывая коэволюционную контактную информацию из данных биомолекулярных последовательностей [36], информацию о расстоянии и угле из ЯМР-спектроскопии и карты плотности крио-ЭМ [6]. В то время как информацию о коэволюции можно рассматривать с помощью дополнительных потенциальных терминов, подобных обычным нативным контактам SBM, информацию о расстоянии и угле ЯМР можно учесть, применяя подходящие пространственные ограничения. При наличии крио-электромагнитных данных можно ввести еще один энергетический термин для смещения структуры в сторону карты электронной плотности на основе пространственного перекрытия.Выполняя моделирование с таким гибридным структурным / смещенным / ограничивающим силовым полем, система может расслабиться до конфигураций, согласующихся со всеми этими факторами.

Материалы и методы

Все моделирование проводилось на стандартном настольном ПК с процессором Intel Core i7-6700, состоящим из восьми ядер с частотой 3,40 ГГц. Мы использовали версию GROMACS 5, модифицированную расширением MD с управляемым рассеянием [20, 59] и параметрами молекулярной динамики, перечисленными в Приложении S4.Моделирование различались только в отношении их связей k _χ с данными рассеяния и приведенными температурами GROMACS T . Поскольку информация о важнейших структурных особенностях, то есть о форме молекул и глобальных конформационных изменениях, содержится в малоугловом режиме, были включены только значения q вплоть до максимума 5 нм ^-1. Для валидации метода мы использовали теоретические данные рассеяния, рассчитанные для чистых начального и конечного состояний.В эксперименте SAXS измеренная картина интенсивности может отражать линейную комбинацию интенсивностей рассеяния от смеси конформаций в образце. Однако, начиная с чистого начального состояния, при моделировании предполагалось, что конформационные переходы происходят полностью. Это означает, что в соответствующем эксперименте все белковые молекулы претерпят интересующий структурный переход из начального состояния в конечное. Следовательно, α был установлен на 1 во всех симуляциях.

Схема моделирования SBM с наведением на рассеяние

В качестве отправной точки полностью атомные SBM были построены из исходной структуры рассматриваемой системы с помощью eSBMTools [30] для получения подходящих файлов координат и топологии.Члены дебаевского рассеяния кодируются как особый тип связанного взаимодействия в файле топологии [20]. Топология рассеяния, а также связанный с ней расширенный файл координат были созданы с помощью gmx genrestr. Эта команда создает половину матрицы пар виртуального узла типа 3, то есть терминов Дебая, для входного файла координат. Использовали аминокислотные рассеиватели, центрированные на виртуальных сайтах взаимодействия в центре масс соответствующего остатка. Учитывались все остатки. Результирующий включаемый файл топологии был добавлен в топологию системы сразу после раздела атомов.Соответствующий тип атома «MW» был вручную добавлен в таблицу типов атомов. Если в качестве цели использовались данные дебаевского рассеяния, начальное рассеяние рассчитывалось с использованием gmx warssdebye. Соответствующим образом скорректированные параметры прогона для уточнения SBM перечислены в Приложении S4. Температуры T и веса смещения k _χ были установлены, как описано в разделе «Результаты и обсуждение». Наконец, SBM были предварительно обработаны с помощью gmx grompp и запущены с помощью gmx mdrun.

Установка полного МД моделирования под контролем рассеяния

Настройка моделирования МД с явным растворителем следовала обычным шагам: добавление атомов водорода, выбор потенциала и модели воды, нейтрализация электрического заряда путем добавления соответствующего количества ионов, минимизация энергии и уравновешивание температуры и давления.Мы использовали силовое поле CHARMM27 [60], модель воды TIP3P [61], схему отсечки Верле и постоянную температуру 300 К. Электростатика обрабатывалась методом Эвальда с сеткой частиц. Были применены муфты давления Парринелло-Рахмана и температурные связи V-rescale. Для получения файла координат и топологии исходные модели были предварительно обработаны и протонированы с помощью gmx pdb2gmx. Периодический кубический ящик, превышающий вдвое наибольшее расстояние между белками, был построен с помощью gmx editconf. Первоначально структура была минимизирована с помощью препроцессора GROMACS gmx grompp и команды моделирования gmx mdrun.После сольватации и нейтрализации электрического заряда структура снова была минимизирована по энергии. Впоследствии системы были уравновешены в каноническом и изотермино-изобарическом ансамблях до тех пор, пока температура и давление не сойдутся. Позиционирование неводородных атомов было зафиксировано в их исходных положениях. Полуматрица членов Дебая была сконструирована с помощью gmx genrestr для NPT-уравновешенной структуры, включая все остатки и с использованием аминокислотных рассеивателей. Это создало топологию рассеяния, которая вручную была включена в топологию системы.Начальное эталонное рассеяние было произведено с помощью gmx warssdebye. После предварительной обработки с помощью gmx grompp, МД-моделирование на основе рассеяния было выполнено с помощью команды gmx mdrun. Результаты показаны для прочности связи k _χ, оптимизированных с помощью вариационных исследований с поиском по сетке, включающих в общей сложности 16 симуляций для каждой системы.

Дополнительная информация

S1 Рис. Радиус инерции и асферичность для полипептида VHP.

Параметры формы для перехода VHP из удлиненного в изогнутое и из изогнутого в удлиненное (A и B, соответственно).Радиус инерции (красный) и асферичность (синий) в зависимости от моделируемого времени показаны вверху и внизу каждой панели. Результаты слева и справа на каждой панели относятся к моделированию полного MD и SBM с наведением на рассеяние соответственно.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1006900.s006

(TIF)

S2 Рис. Радиус инерции и асферичность для AKE.

Параметры формы для AKE перехода «открыто-закрыто» и «закрыто-открыто» (A и B, соответственно). Радиус инерции (красный) и асферичность (синий) в зависимости от моделируемого времени показаны вверху и внизу каждой панели.Результаты слева и справа на каждой панели относятся к моделированию полного MD и SBM с наведением на рассеяние соответственно.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1006900.s007

(TIF)

S3 Рис. Радиус вращения и асферичность для белка LAO.

Параметры формы для перехода LAO holo-to-apo и apo-to-holo (A и B, соответственно). Радиус инерции (красный) и асферичность (синий) в зависимости от моделируемого времени показаны вверху и внизу каждой панели. Результаты слева и справа на каждой панели относятся к моделированию полного MD и SBM с наведением на рассеяние соответственно.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1006900.s008

(TIF)

S4 Рис. SBM-моделирование перехода VHP из изогнутого в удлиненный.

Результаты показаны для параметров ( T , k _χ) = (90, 5 ⋅ 10 ⁻⁸ ε ). (A) Начальное и целевое RMSD (вверху) и энергия смещения (внизу) в зависимости от моделируемого времени. (B) Лучшие структуры, измеренные по целевому среднеквадратичному среднему значению и энергии смещения. Структура (фиолетовый) и структура (бирюзовый) имеют целевые RMSD равные 0.19 нм и 0,37 нм соответственно. (C) потенциал смещения по сравнению с целевым среднеквадратичным отклонением. (D) (фиолетовый) и (бирюзовый) структуры показывают среднеквадратичное отклонение 0,31 нм относительно друг друга.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1006900.s009

(TIF)

S5 Рис. МД-моделирование в явном растворителе перехода VHP от удлиненного к изогнутому.

Результаты показаны для параметров ( T , k _χ) = (330 K, 5 ⋅ 10 ⁻⁹ кДж / моль). (A) Начальное и целевое RMSD (вверху) и энергия смещения (внизу) в зависимости от моделируемого времени.(B) Лучшие структуры, измеренные по целевому среднеквадратичному среднему значению и энергии смещения. Структура (фиолетовый) и структура (бирюза) имеют целевые RMSD 0,08 нм и 0,24 нм соответственно. (C) потенциал смещения по сравнению с целевым среднеквадратичным отклонением. (D) (фиолетовый) и (бирюзовый) структуры показывают RMSD 0,21 нм относительно друг друга.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1006900.s010

(TIF)

S6 Рис. МД-моделирование в явном растворителе перехода VHP изогнутого в удлиненное состояние.

Результаты показаны для параметров ( T , k _χ) = (330 K, 5 ⋅ 10 ⁻⁹ кДж / моль).(A) Начальное и целевое RMSD (вверху) и энергия смещения (внизу) в зависимости от моделируемого времени. По-видимому, моделирование могло только выборочно отбирать конформации вблизи целевой структуры. (B) Лучшие структуры, измеренные по целевому среднеквадратичному среднему значению и энергии смещения. Структура (фиолетовый) и структура (бирюза) имеют целевые RMSD 0,25 нм и 0,39 нм соответственно. (C) потенциал смещения по сравнению с целевым среднеквадратичным отклонением. (D) (фиолетовый) и (бирюзовый) структуры показывают RMSD 0,28 нм относительно друг друга.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pcbi.1006900.s011

(TIF)

S7 Рис. SBM-моделирование перехода AKE «закрыто-открыто».

Результаты показаны для параметров ( T , k _χ) = (50, 8 ⋅ 10 ⁻⁹ ε ). (A) Начальное и целевое RMSD (вверху) и энергия смещения (внизу) в зависимости от моделируемого времени. (B) Лучшие структуры, измеренные по целевому среднеквадратичному среднему значению и энергии смещения. структура (фиолетовый) и структура (бирюзовый) имеют целевые RMSD равные 0.14 нм и 0,24 нм соответственно. (C) потенциал смещения по сравнению с целевым среднеквадратичным отклонением. (D) (фиолетовый) и (бирюзовый) структуры показывают RMSD 0,22 нм относительно друг друга.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1006900.s012

(TIF)

S8 Рис. МД-моделирование явного растворителя перехода AKE из открытого состояния в закрытое.

Результаты показаны для параметров ( T , k _χ) = (300 K, 5 ⋅ 10 ⁻¹⁰ кДж / моль). (A) Начальное и целевое RMSD (вверху) и энергия смещения (внизу) в зависимости от моделируемого времени.(B) Лучшие структуры, измеренные по целевому среднеквадратичному среднему значению и энергии смещения. Структура (фиолетовый) и структура (бирюза) имеют целевые RMSD 0,18 нм и 0,21 нм соответственно. (C) потенциал смещения по сравнению с целевым среднеквадратичным отклонением. (D) (фиолетовый) и (бирюзовый) структуры показывают RMSD 0,11 нм относительно друг друга.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1006900.s013

(TIF)

S9 Рис. МД-моделирование с явным растворителем перехода AKE из закрытого в открытый.

Результаты показаны для параметров ( T , k _χ) = (300 K, 5 ⋅ 10 ⁻¹⁰ кДж / моль).(A) Начальное и целевое RMSD (вверху) и энергия смещения (внизу) в зависимости от моделируемого времени. (B) Лучшие структуры, измеренные по целевому среднеквадратичному среднему значению и энергии смещения. структура (фиолетовый) и структура (бирюза) имеют целевые RMSD 0,16 нм и 0,26 нм соответственно. (C) потенциал смещения по сравнению с целевым среднеквадратичным отклонением. (D) (фиолетовый) и (бирюзовый) структуры показывают RMSD 0,29 нм относительно друг друга.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1006900.s014

(TIF)

S10 Рис. SBM-моделирование апо-голографического перехода LAO.

Результаты показаны для параметров ( T , k _χ) = (50, 9 ⋅ 10 ⁻¹¹ ε ). (A) Начальное и целевое RMSD (вверху) и энергия смещения (внизу) в зависимости от моделируемого времени. (B) Лучшие структуры, измеренные по целевому среднеквадратичному среднему значению и энергии смещения. структура (фиолетовый) и структура (бирюза) имеют целевые RMSD 0,09 нм и 0,14 нм соответственно. (C) потенциал смещения по сравнению с целевым среднеквадратичным отклонением. (D) (фиолетовый) и (бирюзовый) структуры показывают RMSD 0.13 нм относительно друг друга.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1006900.s015

(TIF)

S11 Рис. МД-моделирование с явным растворителем холо-апо-перехода LAO.

Результаты показаны для параметров ( T , k _χ) = (300 K, 1 ⋅ 10 ⁻⁹ кДж / моль). (A) Начальное и целевое RMSD (вверху) и энергия смещения (внизу) в зависимости от моделируемого времени. (B) Лучшие структуры, измеренные по целевому среднеквадратичному среднему значению и энергии смещения. структура (фиолетовый) и структура (бирюзовый) имеют целевые RMSD равные 0.09 нм и 0,16 нм соответственно. (C) потенциал смещения по сравнению с целевым среднеквадратичным отклонением. (D) (фиолетовый) и (бирюзовый) структуры показывают RMSD 0,14 нм относительно друг друга.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1006900.s016

(TIF)

S12 Рис. МД-моделирование явного растворителя LAO перехода апо-голо.

Результаты показаны для параметров ( T , k _χ) = (300 K, 1 ⋅ 10 ⁻⁹ кДж / моль). (A) Начальное и целевое RMSD (вверху) и энергия смещения (внизу) в зависимости от моделируемого времени.(B) Лучшие структуры, измеренные по целевому среднеквадратичному среднему значению и энергии смещения. структура (фиолетовый) и структура (бирюза) имеют целевые RMSD 0,07 нм и 0,12 нм, соответственно. (C) потенциал смещения по сравнению с целевым среднеквадратичным отклонением. (D) (фиолетовый) и (бирюзовый) структуры показывают RMSD 0,11 нм относительно друг друга.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1006900.s017

(TIF)

S13 Рис. Моделирование SBM holo-to-apo LAO с использованием зашумленных данных.

(A) Начальное и целевое RMSD (вверху) и энергия смещения (внизу) в зависимости от времени моделирования.(B) Лучшие структуры, измеренные по целевому среднеквадратичному среднему значению и энергии смещения. структура (фиолетовый) и структура (бирюза) имеют целевые RMSD 0,09 нм и 0,25 нм соответственно. (C) потенциал смещения по сравнению с целевым среднеквадратичным отклонением. (D) (фиолетовый) и (бирюзовый) структуры показывают RMSD 0,25 нм относительно друг друга.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1006900.s018

(TIF)

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Александра Бьёрлинга за полезные советы и ценную поддержку в работе с программным пакетом для МД с наведением на рассеяние.

Ссылки

1. Berman HM, Westbrook J, Feng Z, Gilliland G, Bhat TN, Weissig H, et al. Банк данных о белках. Nucleic Acids Res. 2000. 28 (1): 235–242. pmid: 105
2. Whitford PC, Geggier P, Altman RB, Blanchard SC, Onuchic JN, Sanbonmatsu KY. Аккомодация аминоацил-тРНК в рибосому включает обратимые экскурсии по множеству путей. РНК. 2010. 16 (6): 1196–1204. pmid: 20427512
3. Бок Л.В., Блау С., Шредер Г.Ф., Давыдов И.И., Фишер Н., Старк Х. и др.Энергетические барьеры и движущие силы в транслокации тРНК через рибосому. Nat Struct Mol Biol. 2013. 20 (12): 1390–1396. pmid: 24186064
4. Reinartz I, Sinner C, Nettels D, Stucki-Buchli B, Stockmar F, Panek PT и др. Моделирование красителей FRET позволяет количественно сравнивать с экспериментальными данными. J Chem Phys. 2018; 148 (123321). pmid: 29604831
5. Чен ПК, Hub JS. Интерпретация рассеяния рентгеновских лучей в растворе методом явной молекулярной динамики растворителя.Биофиз Дж. 2015; 108 (10): 2573–2584. pmid: 259
6. Whitford PC, Ahmed A, Yu Y, Hennelly SP, Tama F, Spahn CMT и др. Возбужденные состояния транслокации рибосом выявлены с помощью интегративного молекулярного моделирования. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2011; 108 (47): 18943–18948. pmid: 22080606
7. Trabuco LG, Villa E, Schreiner E, Harrison CB, Schulten K. Гибкая подгонка молекулярной динамики: практическое руководство по объединению криоэлектронной микроскопии и рентгеновской кристаллографии.Методы. 2009; 49: 174–180. pmid: 19398010
8. Брюнгер А.Т., Куриян Дж., Карплюс М. Уточнение кристаллографического фактора R методом молекулярной динамики. Наука. 1987. 235 (4787): 458–460. pmid: 17810339
9. Putnam CD, Hammel M, Hura GL, Tainer JA. Рассеяние рентгеновских лучей в растворе (SAXS) в сочетании с кристаллографией и вычислениями: определение точных макромолекулярных структур, конформаций и сборок в растворе. Q Rev Biophys. 2007. 40 (3): 191–285. pmid: 18078545
10.Arnlund D, Johansson LC, Wickstrand C, Barty A, Williams GJ, Malmerberg E, et al. Визуализация белкового землетрясения с помощью рассеяния рентгеновских лучей с временным разрешением на лазере на свободных электронах. Нат методы. 2014; 11 (9): 923–926. pmid: 25108686
11. Шеннон CE. Математическая теория коммуникации. Белл Syst Tech J. 1948; 27 (3): 379–423.
12. Волков В.В., Свергун Д.И. Уникальность ab initio определения формы в малоугловом рассеянии. J Appl Crystallogr.2003. 36: 860–864.
13. Franke D, Svergun DI. DAMMIF, программа для быстрого ab-initio определения формы при малоугловом рассеянии. J Appl Crystallogr. 2009. 42: 342–346. pmid: 27630371
14. Гупта А.А., Рейнарц I, Карунанити Г., Спилотрос А., Йонна В.Р., Хофер А. и др. Формирование белкового комплекса, отвечающего за секрецию, с помощью механизма динамического циклического связывания. J Mol Biol. 2018
15. Ан С., Ким К. Х., Ким И., Ким Дж., Ихи Х. Третичные структурные изменения белка, визуализированные с помощью рассеяния рентгеновских лучей с временным разрешением.J. Phys Chem B. 2009; 113 (40): 13131–13133. pmid: 19757799
16. Андерссон М., Малмерберг Э., Вестенхофф С., Катона Г., Каммарата М., Вёри А.Б. и др. Структурная динамика легких протонных насосов. Состав. 2009; 17: 1265–1275. pmid: 19748347
17. Свергун Д.И. Восстановление структуры низкого разрешения биологических макромолекул по рассеянию раствора с помощью моделирования отжига. Биофиз Дж. 1999; 76: 2879–2886. pmid: 10354416
18. Такала Х., Бьёрлинг А., Бернтссон О., Лехтивуори Х., Ниблинг С., Хёрнке М. и др.Усиление и преобразование сигналов в фитохромных фотосенсорах. Природа. 2014; 509: 245–248. pmid: 24776794
19. Бернтссон О., Динстхубер Р.П., Панман М.Р., Бьёрлинг А., Густавссон Э., Хёрнке М. и др. Последовательные конформационные переходы и α -спиральная суперспирализация регулируют сенсорную гистидинкиназу. Nat Commun. 2017; 8 (284): 1–8.
20. Бьёрлинг А., Ниблинг С., Марчеллини М., Ван дер Споэль Д., Вестенхофф С. Расшифровка данных рассеяния решения с помощью экспериментально управляемого моделирования молекулярной динамики.J Chem Theory Comput. 2015; 11: 780–787. pmid: 25688181
21. Шевчук Р., Hub JS. Байесовское уточнение белковых структур и ансамблей по данным SAXS с использованием молекулярной динамики. PLoS Comput Biol. 2017; 13 (10): 1–27.
22. Schug A, Hyeon C, Onuchic J. Моделирование белков и РНК на основе крупнозернистой структуры. В: Voth G, редактор. Крупнозернистые конденсаты. Phase Biomol. Syst. 1-е изд. Бока-Ратон: CRC Press Taylor & Francis; 2008. с. 123–140.
23. Онучич JN, Wolynes PG. Теория сворачивания белков. Curr Opin Struct Biol. 2004; 14: 70–75. pmid: 15102452
24. Ноэль JK, Whitford PC, Onuchic JN. Карта теней: общее определение контакта для фиксации динамики биомолекулярного сворачивания и функции. J. Phys Chem B. 2012; 116: 8692–8702. pmid: 22536820
25. Whitford PC, Sanbonmatsu KY, Onuchic JN. Биомолекулярная динамика: переходы порядок-беспорядок и энергетические ландшафты.Отчеты Prog Phys. 2012; 75.
26. Щуг А, Онучич Дж. От сворачивания белка до функции белка и биомолекулярного связывания по теории энергетического ландшафта. Curr Opin Pharmacol. 2010. 10: 709–714. pmid: 20951644
27. Брингельсон Дж. Д., Онучич Дж. Н., Соци Н. Д., Волинс П. Г.. Воронки, пути и энергетический ландшафт сворачивания белков: синтез. БЕЛКИ Struct Funct Genet. 1995; 21: 167–195. pmid: 7784423
28. Брюнгельсон Дж. Д., Волинс П. Г..Спиновые очки и статистическая механика сворачивания белков. Proc Natl Acad Sci. 1987. 84: 7524–7528. pmid: 3478708
29. Whitford PC, Noel JK, Gosavi S, Schug A, Sanbonmatsu KY, Onuchic JN. Потенциал для белков на основе полностью атомной структуры: мосты между минимальными моделями с эмпирическими силовыми полями для всех атомов. Белки. 2009. 75 (2): 430–441. pmid: 18837035
30. Лутц Б., Синнер С., Божич С., Кондов И., Шуг А. Моделирование биомолекулярных систем на основе естественных структур и симуляция биомолекулярных систем одним щелчком мыши.BMC Bioinformatics. 2014; 15 (292): 1–12.
31. Клементи С, Нимейер Х, Онучич Дж. Топологические и энергетические факторы: что определяет структурные детали ансамбля переходного состояния и промежуточных звеньев «на пути» для сворачивания белка? Исследование малых глобулярных белков. J Mol Biol. 2000; 298: 937–953. pmid: 10801360
32. Рей-Столле М., Энцисо М., Рей А. Модели на основе топологии и структуры ЯМР в моделировании сворачивания белков. J. Comput Chem.2009. 30 (8): 1212–1219. pmid: 18988253
33. Лутц Б., Фабер М., Верма А., Клумпп С., Шуг А. Различия между котранскрипционным и свободным сворачиванием рибопереключателей. Nucleic Acids Res. 2014. 42 (4): 2687–2696. pmid: 24275497
34. Синнер С., Лутц Б., Джон С., Рейнарц И., Верма А., Шуг А. Моделирование биомолекулярного складывания и функционирования с помощью моделей, основанных на нативной структуре / Go-Type. Isr J Chem. 2014; 54: 1165–1175.
35. Чавес Л.Л., Онучич Дж., Клементи С., Онучич Н.Количественная оценка шероховатости ландшафта свободной энергии: узкие места энтропии и скорость сворачивания белков. J Am Chem Soc. 2004; 126: 8426–8432. pmid: 15237999
36. Schug A, Weigt M, Onuchic JN, Hwa T., Szurmant H. Белковые комплексы высокого разрешения на основе интеграции геномной информации с молекулярным моделированием. Proc Natl Acad Sci. 2009. 106 (52): 22124–22129. pmid: 20018738
37. Dago AE, Schug A, Procaccini A, Hoch JA, Weigt M, Szurmant H. Структурная основа аутофосфорилирования гистидинкиназы, выведенная путем интеграции геномики, молекулярной динамики и мутагенеза.Proc Natl Acad Sci. 2012; 109 (26): E1733 – E1742. pmid: 22670053
38. Де Леонардис Э., Лутц Б., Ратц С., Коко С., Монассон Р., Шуг А. и др. Анализ совместной эволюции нуклеотидов методом прямого связывания облегчает предсказание вторичной и третичной структуры РНК. Nucleic Acids Res. 2015. 43 (21): 10444–10455. pmid: 26420827
39. Клементи С., Дженнингс П.А., Онучич Дж. Н. Прогнозирование механизма сворачивания циркулярно-пермутированных белков. J Mol Biol. 2001. 311 (4): 879–890. pmid: 11518537
40.Щуг А., Уитфорд П.К., Леви Ю., Онучич Дж. Мутации как лазейки для двух конкурирующих нативных конформаций Rop-димера. Proc Natl Acad Sci. 2007. 104 (45): 17674–17679. pmid: 17968016
41. Ламмерт Х., Шуг А, Онучич Й. Устойчивость и обобщение структурных моделей сворачивания и функции белков. Proteins Struct Funct Bioinforma. 2009. 77 (4): 881–891.
42. Свергун Д.И. Определение параметра регуляризации в методах косвенного преобразования с использованием критериев восприятия.J Appl Crystallogr. 1992; 25: 495–503.
43. Свергун Д.И., Кох MHJ. Исследования методом малоуглового рассеяния биологических макромолекул в растворах. Отчеты Prog Phys. 2003; 66: 1735–1782.
44. Дебай П. Zerstreuung von Röntgenstrahlen. Ann Phys. 1915; 351 (6): 809–823.
45. Fraser RDB, MacRae TP, Suzuki E. Улучшенный метод расчета вклада растворителя в картину дифракции рентгеновских лучей биологических молекул. J Appl Crystallogr.1978; 11: 693–694.
46. Ниблинг С., Бьёрлинг А., Вестенхофф С. Форм-факторы гранул MARTINI для анализа рассеяния рентгеновских лучей белков с временным разрешением. J Appl Crystallogr. 2014; 47: 1190–1198. pmid: 25242909
47. Ян С., Парк С., Маковски Л., Ру Б. Быстрый метод расчета на основе остатков для характеристики рассеяния рентгеновских лучей белковых складок и множественных конформационных состояний больших белковых комплексов. Biophys J. 2009; 96 (11): 4449–4463.pmid: 19486669
48. Schneidman-Duhovny D, Hammel M, Tainer JA, Sali A. Точное вычисление профиля SAXS и его оценка с помощью экспериментов по изменению контраста. Биофиз Дж. 2013; 105 (4): 962–974. pmid: 23972848
49. Ноэль Дж. К., Уитфорд ПК, Санбонмацу К. Ю., Онучич Дж. Н.. SMOG @ ctbp: упрощенное развертывание структурных моделей в GROMACS. Nucleic Acids Res. 2010; 38: W657 – W661.
50. Лутц Б., Синнер С., Хойерманн Г., Верма А., Шуг А.eSBMTools 1.0: улучшенные собственные инструменты моделирования на основе структур. Биоинформатика. 2013. 29 (21): 2795–2796. pmid: 24021379
51. Макнайт CJ, Мацудаира PT, Ким PS. ЯМР-структура субдомена головного ворса, состоящего из 35 остатков. Nat Struct Biol. 1997. 4 (3): 180–184. pmid: 55
52. Система молекулярной графики PyMOL, версия 1.7.2.1, Schrödinger, LLC; 2014.
53. Мюллер К. В., Шлаудерер Г. Дж., Рейнштейн Дж., Шульц Г. Е.. Движение аденилаткиназы во время катализа: энергетический противовес, уравновешивающий связывание субстрата.Состав. 1996. 4 (2): 147–156. pmid: 8805521
54. Мюллер CW, Schulz GE. Структура комплекса между аденилаткиназой из Escherichia coli и ингибитором Ap ₅ A с разрешением 1,9 Å: модель каталитического переходного состояния. J Mol Biol. 1992; 224: 159–177. pmid: 1548697
55. Whitford PC, Miyashita O, Levy Y, Onuchic JN. Конформационные переходы аденилаткиназы: переключение путем крекинга. J Mol Biol. 2007. 366 (5): 1661–1671.pmid: 17217965
56. О Б. Х., Пандит Дж., Канг Ч., Никайдо К., Гёкчен С., Эймс Г. Ф. и др. Трехмерные структуры периплазматического лизин / аргинин / орнитин-связывающего белка с лигандом и без него. J Biol Chem. 1993. 268 (15): 11348–11355. pmid: 8496186
57. Свергун Д.И., Барберато С., Кох MHJ. CRYSOL — программа для оценки рассеяния рентгеновских лучей биологических макромолекул в растворе по атомным координатам. J Appl Cryst. 1995; 28: 768–773.
58.Марина A, Waldburger CD, Hendrickson Wa. Структура всей цитоплазматической части сенсорного гистидинкиназного белка. EMBO J. 2005; 24 (24): 4247–4259. pmid: 16319927
59. Abraham MJ, Murtola T, Schulz R, Szilárd P, Smith JC, Hess B., Lindahl E. Gromacs: Высокопроизводительное молекулярное моделирование за счет многоуровневого параллелизма от портативных компьютеров до суперкомпьютеров. SoftwareX 2015; 1-2: 19-25.
60. Маккерелл А.Д., Башфорд Д., Беллотт М., Данбрак Р.Л., Эвансек Д.Д., Филд М.Дж. и др.Полностью атомный эмпирический потенциал для молекулярного моделирования и изучения динамики белков. J. Phys Chem B. 1998; 102 (18): 3586–3616. pmid: 24889800
61. Йоргенсен В.Л., Чандрасекхар Дж., Мадура Д.Д., Импей Р.В., Кляйн М.Л. Сравнение простых потенциальных функций для моделирования жидкой воды. J Chem Phys. 1983; 79 (2): 926–935.
62. Хомуз Д., Перхам М., Самиотакис А., Чунг М.С., Виттунг-Стафшеде П. Переполненная клеточно-подобная среда вызывает изменения формы асферического белка.Proc Natl Acad Sci. 2008; 105: 11754–11759. pmid: 18697933
63. Хамфри В., Далке А., Шультен К. VMD — Визуальная молекулярная динамика. J Molec Graphics. 1996. 14: 33–38.

Оценка степени молекулярного контакта между поверхностями целлюлозных волокон с помощью микроскопии FRET

Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET)

Следующее краткое введение в теорию Фёрстера было взято из книги Б.В. Ван дер Меер (Meer 2013) и частично основан на оригинальных статьях Фёрстера.Эффективность передачи энергии между донорным и акцепторным красителем зависит от расстояния между двумя молекулами и, в принципе, определяется радиусом Ферстера (\ (\ text {R} _0 \)). Радиус Ферстера можно рассчитать для любой комбинации донорных и акцепторных молекул, как показано в дополнительной информации (Таблица S1). \ (\ text {R} _0 \) специфичен для каждой пары донор-акцептор в конкретной системе. Эффективность передачи энергии (\ (\ eta _ {eff} \)) между донором и акцептором дается уравнением.6} \ end {align} $$

(1)

где r обозначает расстояние между донором и акцептором, а \ (\ text {R} _0 \) обозначает радиус Ферстера пары донор-акцептор. На практике эффективность FRET может быть измерена различными методами, которые могут быть реализованы либо в установках микроскопии, либо измерены с помощью спектрофотометрии, оба из которых были использованы в этой статье.

Независимо от метода измерения, процесс FRET может быть обнаружен по различным аспектам эффекта.FRET изменяет интенсивность излучения донора (гашение донора), интенсивность излучения акцептора (чувствительность акцептора), время жизни флуоресценции донора (измерения времени жизни) и поляризацию света (измерения анизотропии). Здесь мы использовали два из наиболее распространенных метода измерения FRET, а именно тушение донора (DQ) и акцепторную чувствительность (AS). Тушение донора измеряет уменьшение флуоресценции донора из-за FRET. Чувствительность акцептора измеряет увеличение флуоресценции акцептора из-за FRET.Хотя DQ является показателем для FRET, нельзя быть уверенным в этом, поскольку существуют другие механизмы, такие как гашение концентрации, которые могут дезактивировать возбужденный донор. AS, с другой стороны, предоставляет убедительные доказательства для FRET, поскольку флуоресценция акцептора может быть увеличена только за счет некоторого рода передачи энергии (Meer 2013). Отличный обзор реализации и подводных камней метода предоставлен Broussard et al. (2013). Здесь следует упомянуть одну важную часть использования FRET — это тщательно проверять, действительно ли сигнал действителен, особенно когда спектроскопические данные недоступны.Это можно сделать, используя отрицательные контроли, динамический FRET или применяя более одного метода FRET.

Материалы

Красители 7- (диэтиламино) кумарин-3-карбогидразид (DCCH, Purity \ (95 {\%} \), CAS: 100343-98-4) и флуоресцеин-5-тиосемикарбазид (FTSC, Purity \ (99 {\%} \), CAS: 76863-28-0) были куплены у Santacruz Biotechnology. Растворители N, N-диметилформамид (DMF), тетрагидрофуран (THF) и ацетонитрил были приобретены в VWR. Все химические вещества использовались без дополнительной очистки.Поли (2-гидроксиэтилметакрилат) (pHEMA) для производства тонких пленок был приобретен у Sigma Aldrich. Модельные пленки наносились на фольгу из ПЭТФ. Используемая целлюлоза представляла собой небеленую крафт-целлюлозу из мягкой древесины промышленного производства.

Подготовка образца

Для исследования волокон целлюлозы [беленая крафт-древесина, соотношение ель / сосна (90/10)] образцы готовили, как описано Thomson et al. (2007). Волокна окрашивали в 15 мл раствора любого из красителей в ДМФА (1 ммоль / л и 0.2 ммоль / л) в течение ночи при pH 5, регулируемом добавлением HCl. Красители образуют метастабильную связь с восстанавливающим концом молекулы целлюлозы, и при добавлении HCl это равновесие смещается в сторону метастабильных видов связи. После окрашивания к раствору немедленно добавляли боргидрат натрия \ (\ hbox {NaBH} _4 \) (0,02 ммоль \ (\ text {NaBH} _4 \) на 0,5 г волокон) и давали ему прореагировать в течение 1 часа. Боргидрат натрия приводит к восстановительному аминированию красителей с целлюлозой, что приводит к ковалентной связи между реагентами.После этого восстановительного аминирования образцы сначала промывали в ДМФ и снова промывали экстракцией Сокслета ацетонитрилом в течение не менее 4 часов для удаления любого нековалентно связанного красителя. Впоследствии окрашенные волокна хранили в водном буферном растворе с pH 9 с использованием буры 0,4 г / л. Волокнистые связки были приготовлены путем скрещивания одного окрашенного DCCH волокна и одного окрашенного FTSC волокна в капле воды (pH 9) и последующей их сушки в листообразователе Rapid Köthen. Затем для микроскопии связки волокон переносили на предметные стекла.Перекрестки волокон (отрицательный контроль для FRET) получали путем простого пересечения двух волокон и покрытия их покровным стеклом для микроскопии.

Модельные пленки были приготовлены методом докторблейдинга \ (500 \, {\ upmu} \ hbox {L} \) \ (10 {\%} \) pHema в растворе 95/5 EtOH / h3O, смешанном с растворенными красителями. в THF на полиэтиленовую пленку. Это привело к ок. \ (1.5 \, {\ upmu} \ hbox {m} \) толстая пленка. Для обеспечения щелочных условий к раствору добавляли объем \ (12 \, {\ upmu} \ hbox {L} \) триэтиламина. Фольга ПЭТ была очищена ацетоном перед нанесением лака.\ circ \ hbox {C} \) для \ (3 \, \ hbox {h} \) для установления контакта. Концентрации и применяемые методы измерения для образцов можно увидеть в Таблице 1.

Таблица 1 Концентрации и параметры для измерений FRET

FRET из спектрофотометрии

Спектры флуоресценции были записаны на RF-5301PC, спектрофлуорофотометре от Shimadzu. Эксперименты FRET проводились с концентрациями молекул, указанными в таблице 1. Также были приняты меры для минимизации воздействия окружающего света на любой из образцов, чтобы избежать фотообесцвечивания.Модельные пленки, с одной стороны, были исследованы с использованием этой установки флуорометрии, а с другой стороны, они были исследованы с помощью широкоугольного микроскопа с наборами фильтров, показанными в таблице 2. Спектры пленок pHema были записаны с использованием установки, показанной на рис. 3. Образцы исследовали под углом, который позволяет избежать обнаружения прямо отраженного света и измеряет только флуоресценцию, исходящую от образца.

Рис. 3

Установка для измерения пленок pHema во флуорометрии.В и настройка объясняется более подробно. Он был выбран таким образом, чтобы отраженный (REFL) луч, следующий за возбуждением (EX) образца, не попадал на детектор, и регистрировался только сигнал флуоресценции, испускаемый (EM) непосредственно от образца. a — c Образцы донора, акцептора и донора-акцептора в том виде, в каком они были исследованы

Эффективность передачи энергии FRET рассчитывается по измеренным спектрам и поясняется на рис.4. За счет передачи энергии излучение донора гасится (\ (\ text {I} _ {DA} \)) относительно нормального излучения донора (\ (\ text {I} _ {D} \) ). Энергия, не испускаемая донором, затем передается акцептору и увеличивает (или сенсибилизирует) излучение (\ (\ text {I} _ {AD} \)) по сравнению с нормальной чувствительностью акцептора (\ (\ text {I}) _ {A} \)). Спектральное перекрытие, показанное на рис. 4, является необходимым требованием для FRET и в значительной степени определяет диапазон расстояний эффекта, как можно увидеть в уравнении.{1/6} $$

(2)

\ (\ text {R} _0 \) — радиус Ферстера, k — фактор ориентации, n — показатель преломления, (\ (\ text {Q} _ {D} \)) — квантовый выход донора и J интеграл перекрытия. Радиус Ферстера определяет расстояние передачи энергии, поскольку известно, что количественное определение FRET возможно только в пределах расстояний от \ ((\ frac {1} {2} — 2) \ text {R} _0 \), как также показано на рис. 2. Подробное описание того, как определить радиус Ферстера, можно найти в FRET — Förster Resonance Energy Transfer Мединца и Хильдебрандта (Meer 2013).

Рис. 4

Спектры возбуждения и излучения типичной донорно-акцепторной пары. FRET влияет на интенсивность излучения донора (тушение донора) и интенсивность излучения акцептора (чувствительность акцептора). Также показано спектральное перекрытие донорного излучения и спектра возбуждения акцептора.

Спектры флуоресцентного излучения DCCH и FTSC частично перекрываются, как показано на рис. 7. Следовательно, для получения точного измерения эффективности FRET спектры должны быть спектрально несмешанными.Для этого в спектрометре мы подгоняли пики излучения и использовали площадь под пиками как интенсивность подобранного сигнала. Практически это было сделано путем подгонки гауссовых пиков к зарегистрированным спектрам излучения чистого донорного образца (в результате получилось \ (\ text {I} _ {D} \)), чистого акцепторного образца (в результате \ (\ text {I}) _ {A} \)) и образец, представляющий интерес (в результате были \ (\ text {I} _ {DA} \) и \ (\ text {I} _ {AD} \)), как на рис. 11. Полные параметры подгонки можно найти в дополнительной информации (рисунок S3 и таблица S2).Полученная информация об интенсивности использовалась с уравнениями. 3 и 4, чтобы получить эффективность FRET. Для тушения донора (уравнение 3) и акцепторной чувствительности (уравнение 4) использовались следующие уравнения.

$$ \ begin {выровнен} \ eta _ {FRET} = 1 — \ frac {I_ {DA}} {I_D} \ end {выравнивается} $$

(3)

$$ \ begin {align} \ eta _ {FRET} = \ left (\ frac {I_ {AD}} {I_A} — 1 \ right) \ frac {\ epsilon _A} {\ epsilon _D} \ end { выровнено} $$

(4)

\ (\ epsilon _ {A} \) и \ (\ epsilon _ {D} \) — коэффициенты экстинкции акцептора и донора на длине волны возбуждения (Meer 2013; Clegg 1992, 1995).Отношение \ (\ frac {\ epsilon _ {A}} {\ epsilon _ {D}} \) было определено равным 0,02, и его можно найти в дополнительной информации (Таблица S1). Чувствительность акцептора и эмиссия донора схематически показаны на рис. 4.

FRET из оптической микроскопии

Бумажные волокна были исследованы с использованием установки для широкопольной микроскопии (WM), оснащенной наборами фильтров, показанными в таблице 2. WM работал с Галогенная лампа 50 Вт и КМОП-детектор от QI Imaging (Optimos).

Таблица 2 Наборы фильтров, используемые для флуоресцентной микроскопии

Как интенсивность лампы, так и чувствительность детектора показывают зависимость от длины волны и были скорректированы путем расчета поправочных коэффициентов из спектра излучения лампы, сложенного с фильтрами возбуждения и коэффициентом экстинкции. и чувствительность детектора, сложенная с фильтрами излучения и спектрами излучения.Эти поправочные коэффициенты были применены к записанным изображениям, чтобы получить истинное представление об измеренной интенсивности.

Схематическое изображение окрашенных волокон и пленок pHema можно увидеть на рис. 5. Изображения имеют ложный цвет, чтобы подчеркнуть различия в волокнах / пленках. Образцы исследовались при увеличении в \ (400 \ раз \) для волокон и \ (50 \ раз \) в случае пленок. Чтобы минимизировать фоновый шум, микроскоп использовался в коробке, окруженной черной тканью.

Рис. 5

Ложные цветные изображения a, , волоконной связи и b, , пересечения pHema, измеренные с помощью широкоугольного флуоресцентного микроскопа. В b также показаны типичные области интереса для алгоритмов Xia. Области выбраны так, чтобы минимизировать свет, рассеянный другим волокном / пленкой.

При использовании микроскопа спектральный диапазон заменяется пространственной информацией, а преимущество применения этого простого метода подбора, описанного выше, теряется.Здесь Гордон и др. Разработали сложный алгоритм, который приводит к полностью скорректированной оценке эффективности FRET. (1998). В методе используются изображения, записанные с помощью трех различных наборов фильтров из Таблицы 2 трех разных образцов. Обычно это приводит к получению всего девяти изображений, но с расположением, показанным на рис.5, можно получить ту же информацию только из трех изображений вместо этого, поскольку на каждом изображении автоматически присутствует чистый донор, чистый акцептор и область FRET. включены.Подробное описание алгоритма см. В исходной статье (Gordon et al. 1998). Вкратце, этот метод вычисляет интенсивность FRET, скорректированную для всех возможных сценариев спектрального просвечивания, в соответствии со следующими уравнениями.

$$ \ begin {align} {\ overline {Afa}} = \ frac {Af — \ left (\ frac {Ad} {Fd} \ right) Ff} {1 — \ left (\ frac {Fa} { Aa} \ right) \ left (\ frac {Ad} {Fd} \ right)} \ end {align} $$

(5)

$$ \ begin {align} FRET1 = \ frac {\ left (Ff — \ left (\ frac {Fd} {Dd} \ right) Df — {\ overline {Afa}} \ left [\ left (\ frac {Fa} {Aa} \ right) — \ left (\ frac {Fd} {Dd} \ right) \ left (\ frac {Da} {Aa} \ right) \ right] \ right)} {G \ left [ 1 — \ left (\ frac {Da} {Fa} \ right) \ left (\ frac {Fd} {Dd} \ right) \ right]} \ end {выравнивается} $$

(6)

$$ \ begin {align} {\ overline {Dfd}} = Df + FRET1 \ left [1 — G \ left (\ frac {Da} {Aa} \ right) \ right] — {\ overline {Afa} } \ left (\ frac {Da} {Aa} \ right) \ end {выравнивается} $$

(7)

$$ \ begin {align} FRETN = \ frac {FRET1} {{\ overline {Afa}} * {\ overline {Dfd}}} \ end {выравнивается} $$

(8)

Уравнения состоят из переменных, состоящих из двух букв.Первая буква обозначает использованный набор фильтров, как показано в таблице 2, вторая буква — исследуемый образец (d = только донор, a = только акцептор, f = область FRET). Например. Следовательно, Af означает область FRET (связанная область), исследованная с помощью набора акцепторных фильтров. Переменные представляют собой измеренные значения интенсивности света из вышеупомянутых изображений микроскопа, записанные как 16-битные значения серого. \ ({\ overline {Afa}} \) относится к сигналу акцептора, который был бы, если бы не присутствовал донор и, следовательно, не возникла FRET.Аналогично, \ ({\ overline {Dfd}} \) относится к донорскому сигналу, который был бы, если бы не присутствовал акцептор и, следовательно, не было бы FRET. На изображениях были выбраны интересующие области, как показано на рис. 5b. Оценка производилась по пикселям. G — фактор, связывающий потерю донорного сигнала с увеличением сигнала акцептора (см. Дополнительную информацию в таблице S3). В этой работе мы использовали несколько иной алгоритм Xia et al. который отличается только нормализацией значения \ (\ text {N} _ {\ text {FRET}} \), но в остальном эквивалентен алгоритму Гордона (Xia and Liu 2001).

$$ \ begin {выровнено} N_ {FRET} = \ frac {FRET1} {\ sqrt {{\ overline {Afa}} * {\ overline {Dfd}}}} [-] \ end {выровнено} $$

(9)

Рис. 6

Демонстрация анализа FRET пересечения волокон a, a и b a. В и можно увидеть две типичные проблемы с анализом. Сначала высокий сигнал FRET часто обнаруживался на краях как области склеивания, так и волокон. Во-вторых, сильный ложный положительный сигнал FRET можно увидеть в области, которая явно не может показать FRET.На микроскопическом изображении можно увидеть метод эрозии, использованный для анализа.

Для возможности воспроизведения области молекулярного контакта был разработан метод, позволяющий всегда выбирать подходящую область. Метод состоял в том, чтобы вручную нарисовать ROI (интересующую область), захватив «оптически связанную» область на рис. 6. Затем мы применили эрозию изображения, чтобы избежать краев и, таким образом, получить размытую область интереса (рис. 6, нижние изображения), которая затем использовали для оценки интенсивности FRET. Избегать краев было необходимо, потому что области экстремальной интенсивности дают ложноположительный сигнал FRET.Кроме того, ложные срабатывания также были обнаружены в областях, на которых невозможно отобразить FRET, таких как область, показанная на фиг. 6a, которая не находится в связанной области.

Другие эксперименты FRET

Здесь следует упомянуть, что другие эксперименты FRET также использовались. Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп (CLSM, Leica TCS SPE) с фотоумножителем от Hamamatsu был использован для исследования фотообесцвечивания акцептора и сенсибилизированного излучения акцептора в связях волокно-волокно. Идея заключалась в том, что благодаря превосходной настройке будет достигнуто лучшее соотношение сигнал / шум.

Как читать табуляцию и блоки аккордов

Вы собираетесь читать блоки аккордов на самом первом этапе, так что вам нужно будет записать это сейчас. Некоторое время вам не нужно читать вкладку, но мы дадим вам краткое изложение ее здесь, чтобы вы хотя бы поняли основы этого. Я не рекомендую новичкам читать ноты, потому что это очень медленный прогресс.

Ящики для чтения аккордов

Первое, что вам нужно знать, это как читать коробки аккордов.Они покажут вам, где положить пальцы на гриф, чтобы играть аккорды. Шесть вертикальных линий представляют шесть струн. Крайняя левая струна — самая толстая струна (E). Две линии вверху коробки представляют гайку (пластиковую, костяную или металлическую деталь, через которую проходят струны на грифе), а остальные горизонтальные линии представляют лады.

Точки обозначают места, куда вы кладете пальцы левой руки, и они пронумерованы, чтобы показать, какой палец использовать.Номер 1 — указательный палец, 2 — средний палец, 3 — безымянный палец, а 4 — ваш мизинец. Если вы играли на пианино, убедитесь, что вы не запутались; нумерация пальцев фортепиано совершенно другая (гитаристы обычно не используют большой палец левой руки).

Обратите внимание на X или O над каждой строкой. Они показывают, следует ли вам играть на струне для этого аккорда. Буква O означает, что вы играете на струне «в открытую» — пальцы не удерживают ее, а X означает, что вы не должны играть на этой струне.

Чтение ВКЛАДКИ

Guitar TAB (или гитарная табулатура) — это способ написания музыки специально для гитары. Он идеально подходит для тех, кто не читает нот, и во многих случаях предлагает больше информации, чем письменные записи!

TAB имеет шесть горизонтальных линий, которые представляют шесть струн на гитаре. Верхняя линия — это самая тонкая струна (первая), а самая низкая линия — самая толстая (шестая) струна. Цифры, расположенные на линиях, говорят вам, на каком ладу играть ноту.Вы будете играть только на струнах с цифрами; Если у струны нет номера, не играйте ее. 0 означает, что струна играется открытой, пальцы не прижимают струну к ладу.

Я объясню больше о TAB, когда мы будем его использовать!

LiGa5O8: тераностические наночастицы на основе хрома для рентгеновской фотодинамической терапии глубоко расположенных опухолей под визуальным контролем

* Соответствующие авторы

^а Исследовательский центр молекулярной визуализации (MIRC), TOF-PET / CT / MR Center, Четвертая больница Харбинского медицинского университета, Харбинский медицинский университет, Харбин, Хэйлунцзян, 150028, Китай
Эл. Почта: шенбж @ vip.sina.com

^б Кафедра химии, Университет Джорджии, Афины, Джорджия 30602, США
Эл. Почта: jinxie @ uga.edu

^с Центр молекулярной визуализации и трансляционной медицины, Государственная ключевая лаборатория молекулярной вакцинологии и молекулярной диагностики, Школа общественного здравоохранения, Сямэньский университет, Сямынь 361102, Китай

^д Колледж ветеринарной медицины, Университет Джорджии, Афины, GA 30602, США

^e Отделение гематологии и онкологии, Онкологический центр Джорджии, Медицинский колледж Джорджии, Университет Августы, Огаста, Джорджия 30912, США

^f Отделение радиационной онкологии, Комплексный онкологический центр Линебергера, Университет Северной Каролины в Чапел-Хилл, Чапел-Хилл, США

^г Отделение радиологии и биомедицинского исследовательского центра визуализации, Университет Северной Каролины в Чапел-Хилл, Чапел-Хилл, Северная Каролина, США

публикаций | Публикации Pollack Lab

| Pollack Lab

Уточнение плотности электронов in vitro по рассеянию рентгеновских лучей в растворе в широкоугольном режиме
Y.Л. Чен, Л. Поллак
arXiv (2020). arXiv: 2012.13370
Прямое наблюдение механизма устойчивости к антибиотикам путем смешивания и инъекции на Европейском XFEL
С. Панди, Г. Д. Калви, А. М. Кац, Т. Н. Малла, FHM Koua, JM Martin-Garcia, I. Poudyal, J. Yang , М. Вакили, О. Ефанов, К. А. Зелински, С. Байт, С. Авель, К. Дорнер, М. Франк, Л. Гелизио, Р. Джерниган, Х. Кирквуд, М. Клоос, Дж. Колияду, В. Мариани, М.Д. Миллер, Г. Миллс, Г. Нельсон, Дж. Л. Олмос-младший, А.Садри, Т. Сато, А. Толстикова, В. Сю, А. Урмазд, JHC Spence, P. Schwander, A. Barty, HN Chapman, P. Fromme, AP Mancuso, GN Phillips Jr, R. Bean, L. Pollack , М. Шмидт
bioRxiv (2020). https://doi.org/10.1101/2020.11.24.396689
Выяснение роли микропроцессорного белка DGCR8 в изгибе структур РНК
С. А. Пабит, Ю. Л. Чен, Е. Т. Ашер, Е. К. Кук, Л. Поллак, С. А. Шоуолтер
Biophys. J. 119 (12), 2524-2536 (2020). https://doi.org/10.1016 / j.bpj.2020.10.038
Визуализация вирусного генома с вариацией контраста малоугловое рассеяние рентгеновских лучей
J. San Emeterio, L. Pollack
J. Biol. Chem. 295 (47), 15923-15932 (2020). https://doi.org/10.1074/jbc.RA120.013961
Характеристика ферментативных реакций в микрокристаллах для эффективных экспериментов по смешиванию и введению с использованием рентгеновских лазеров на свободных электронах
Г. Д. Калви, А. М. Кац, К. А. Зелински, Б. Дзиковски, Л. Поллак
Аналитическая химия.92 (20), 13864-13870 (2020). https://doi.org/10.1021/acs.analchem.0c02569
Машинное обучение расшифровывает структурные особенности дуплексов РНК, измеренные с помощью рассеяния рентгеновских лучей в растворе.
Ю. Л. Чен, Л. Поллак
IUCrJ. 7 (5). 870-880 (2020). https://doi.org/10.1107/S2052252520008830
Структурно-функциональная консервация запрограммирована? 1 рибосомный сигнал сдвига рамки считывания коронавируса SARS 2 (SARS-CoV-2)
J. A. Kelly, A. N. Olson, K. Neupane, S.Munshi, J. San Emeterio, L. Pollack, M. T. Woodside, J. D. Dinman
J. Biol. Chem. 295 (31), 10741-10748 (2020). https://doi.org/10.1074/jbc.AC120.013449
Рибосомный белок L11 селективно стабилизирует третичную структуру домена рРНК центра GTPase
R. Welty, M. Rau, S.A. Pabit, M. S. Dunstan, G.L. Conn, L. Pollack, K. B. Hall
J. Mol. Биол. 432 (4), 991-1007 (2020). https://doi.org/10.1016/j.jmb.2019.12.010
Визуализация неупорядоченной одноцепочечной РНК: соединительная последовательность, структура и электростатика
A.Пламридж, К. Андресен, Л. Поллак
J. Am. Chem. Soc. 142 (1). 109-119 (2019). https://doi.org/10.1021/jacs.9b04461
Солевая зависимость дуплексов РНК А-формы: структуры и значение
Y. L. Chen, L. Pollack
J Phys. Chem. Б. 123 (46), 9773-9785 (2019). https://doi.org/10.1021/acs.jpcb.9b07502
Держатель микрожидкостного инжектора для микрожидкостного смешивания позволяет проводить рутинные структурные энзимологические измерения с последовательной кристаллографией смешивания и впрыска с использованием рентгеновских лазеров на свободных электронах
G.Д. Калви, А. М. Кац, Л. Поллак
Аналитическая химия 91 (11): 7139-7144 (2019). https://doi.org/10.1021/acs.analchem.9b00311
Конформации конструкции РНК-спираль-соединение-спираль, выявленные с помощью SAXS-уточнения МД-моделирования.
Y. L. Chen, T. Lee, R. Elber, L. Pollack
Biophys. J. 116 (1): 19-30 (2019). https://doi.org/10.1016/j.bpj.2018.11.020
Двухвалентные ионы регулируют кинетику перехода фолдинга рРНК бактериального центра GTPase от вторичной к третичной структуре.
Р. Велти, С. А. Пабит, А. М. Кац, Г. Д. Калви, Л. Поллак, К. Б. Холл
РНК 24 (12): 1828-1838 (2018). https://doi.org/10.1261/rna.068361.118
Промежуточные продукты фермента улавливаются «на лету» с помощью последовательной кристаллографии методом смешивания и инъекции.
JL Olmos, S. Pandey, JM Martin-Garcia, G. Calvey, A. Katz, J. Knoska, C. Kupitz, MS Hunter, M. Liang, D. Oberthuer, O. Yefanov, M. Wiedorn, M Хейман, М. Холл, К. Панде, А. Барти, М. Д. Миллер, С. Стерн, С. Рой-Чоудхури, Дж.Коу, Н. Нагаратнам, Дж. Зук, Дж. Вербургт, Т. Норвуд, И. Поудьял, Д. Сю, Дж. Коглин, М. Х. Сиберг, Ю. Чжао, С. Байт, Т. Грант, В. Мариани, Г. Нельсон, Г. Субраманиан, Э. Бэ, Р. Фромм, Р. Фунг, П. Швандер, М. Франк, Т. А. Уайт, У. Вейерштолл, Н. Зацепин, Дж. Спенс, П. Фромм, Х. Н. Чепмен, Л. Поллак, Л. Тремблей, А. Уурмазд, Г. Н. Филлипс, М. Шмидт
Биология BMC 16:59 (2018). https://doi.org/10.1186/s12915-018-0524-5
Как конформации внутреннего соединения способствуют складыванию домена РНК.
Y. L. Chen, J. L. Sutton, L. Pollack
J. Phys. Chem. Б. 122 (49), 11363-11372 (2018). https://doi.org/10.1021/acs.jpcb.8b07262
Локальная последовательность ДНК контролирует асимметрию разворачивания ДНК из ядер нуклеосомных частиц.
А. В. Мани, Дж. М. Токуда, Л. М. Глосс, О. Гонсалес, Л. Поллак
Biophys. J. 115 (5): 773-781 (2018). https://doi.org/10.1016/j.bpj.2018.07.009
Выявление различных фаз сворачивания трехспирального соединения РНК.
А. Пламридж, А. М. Кац, Г. Д. Калви, Р. Элбер, С. Кирмизиалтин, Л. Поллак
Исследование нуклеиновых кислот 46 (14): 7354-7365 (2018). https://doi.org/10.1093/nar/gky363
Аппаратура и методы низкотемпературного малоуглового рассеяния рентгеновских лучей.
С. П. Мейсбергер, М. А. Варкентин, Дж. Б. Хопкинс, А. М. Кац, Л. Поллак, Р. Э. Торн
Патент США 9
6 (2018)
АТФазный мотор ремоделера хроматина Chd1 стимулирует разворачивание ДНК из нуклеосомы.
Дж. М. Токуда, Р. Рен, Р. Ф. Левендоски, Р. Дж. Тай, М. Ян, Л. Поллак, Г. Д. Боуман
Исследование нуклеиновых кислот 46 (10): 4978-4990 (2018). https://doi.org/10.1093/nar/gky206
Структурные изменения бесхвостого бактериофага? X174 при проникновении через стенки бактериальных клеток.
Ю. Сан, А. П. Розновски, Дж. М. Токуда, Т. Клозе, А. Мани, Л. Поллак, Б. А. Фейн, М. Г. Россманн
Proc. Natl. Акад. Sci. США. 114 (52): 13708-13713 (2017). https://doi.org/10.1073/pnas.1716614114
Руководство по публикации 2017 г. по структурному моделированию данных малоуглового рассеяния биомолекул в растворе: обновление.
Дж. Тревелла, А. П. Дафф, Д. Дюран, Ф. Габель, Дж. М. Гусс, В. А. Хендриксон, Г. Л. Хура, Д. А. Жак, Н. М. Кирби, А. Х. Кван, Дж. Перес, Л. Поллак, Т. М. Райан, А. Сали, Д. Шнайдман-Духовны, Т. Шведе, Д. И. Свергун, М. Сугияма, Дж. А. Тайнер, П. Вачетт, Дж. Вестбрук, А. Э. Уиттен
Acta Crystallographica D73 (9): 710-728 https: // doi.org / 10.1107 / S2059798317011597
Двухпоточный инжектор сфокусированной жидкости для эффективной последовательной фемтосекундной кристаллографии.
Д. Обертюр, Я. Кношка, М.О. Видорн, К.Р. Байерлейн, Д.А. Бушнелл, Е.Г. Ковалёва, М. Хейманн, Л. Гумпрехт, Р.А. Кириан, А. Барти, В. Мариани, А. Толстикова, Л. Адриано, С. Авель, М. Бартельмесс, К. Дорнер, П. Л. Ксавьер, О. Ефанов, Д. Р. Джеймс, Г. Нельсон, Д. Ван, Г. Калви, Ю. Чен, А. Шмидт, М. Щепек, С. Фрилингсдорф, О. Ленц, Э. Снелл, П.Дж. Робинсон, Б. Шарлер, Г. Бельшак, М. Мачек, Ф. Уайлд, А. Акила, С. Буте, М. Лян, М. С. Хантер, П. Шерер, Дж. Д. Липскомб, У. Вейершталь, Р. Д. Корнберг , JCH Spence, L. Pollack, HN Chapman, S. Bajt
Научные отчеты 7: 44628 (2017). https://doi.org/10.1038/srep44628
Влияние укладки оснований на конформации и электростатику одноцепочечной ДНК.
А. Пламридж, С. П. Мейсбургер, К. Андресен, Л. Поллак.
Nucleic Acids Research 45 (7): 3932–3943 (2017).[Аннотация]
Структурная энзимология с использованием рентгеновских лазеров на свободных электронах.
К. Купиц, Дж. Л. Олмос-младший, М. Холл, Л. Тремблей, К. Панде, С. Панди, Д. Обертюр, М. Хантер, М. Лян, А. Аквила, Дж. Тенбоер, Г. Калви, А.М. Кац, Я. Чен, М.О. Видорн, Дж. Кноска, А. Минц, В. Майриани, Т. Норвуд, И. Поудьял, Т. Грант, М.Д. Миллер, В. Сю, А. Толстикова, А. Морган, М. Мец, Дж. М. Мартин-Гарсия, Дж. Д. Зук, С. Рой-Чоудхури, Дж. Коу, Н. Нагаратнам, Д. Меза, Р. Фромм, С. Басу, М.Франк, Т. Уайт, А. Барти, С. Байт, О. Ефанов, Х. Н. Чепмен, Н. Зацепин, Г. Нельсон, У. Вейерштолл, Дж. Спенс, П. Швандер, Л. Поллак, П. Фромм, А. Уурмазд, Г. Н. Филлипс-младший, М. Шмидт.
Struct. Дин. 4 (4): 044003 (2017). [Аннотация]
Спермин конденсирует дуплексы ДНК, но не РНК.
А. М. Кац, И. С. Толох, С. А. Пабит, А. В. Онуфриев, Л. Поллак
Biophys. J. 112 (1): 22-30 (2017). [Аннотация]
Визуализация одноцепочечных нуклеиновых кислот в растворе.
A. Plumridge, S. P. Meisburger, L. Pollack
Nucleic Acids Research (2016). [Аннотация]
Асимметричное разворачивание нуклеосомной ДНК способствует асимметричному открытию и диссоциации ядра гистона.
Ю. Чен, Дж. М. Токуда, Т. Топпинг, С. П. Мейсбургер, С. А. Пабит, Л. М. Глосс, Л. Поллак
Proc. Natl. Акад. Sci. США. 114 (2): 334-339 (2016). [Аннотация]
Смесительный инжектор обеспечивает кристаллографию с временным разрешением и высокой частотой попаданий в рентгеновских лазерах на свободных электронах.
Г. Д. Калви, А. М. Кац, К. Б. Шаффер, Л. Поллак
Struct. Дин. 3 (5): 054301 (2016). [Аннотация]
SAICAR активирует PKM2 в его димерной форме.
М. Ян, С. Чакраварти, Дж. М. Токуда, Л. Поллак, Г. Д. Боуман, Ю.-С. Ли
Биохимия. 55 (33): 4731-4736 (2016). [Аннотация]
Противоположные эффекты многовалентных ионов на гибкость ДНК и РНК.
А. В. Дроздецкий, И. С. Толох, Л. Поллак, Н. А. Бейкер, А. В. Онуфриев
Phys.Rev. Lett. 117 (2): 028101 (2016). [Аннотация]
Многооболочечная модель ионно-индуцированной конденсации нуклеиновых кислот.
И. С. Толох, А. В. Дроздецкий, Л. Поллак, Н. А. Бейкер, А. В. Онуфриев
J. Chem. Phys. 144 (15): 115101 (2016). [Аннотация]
Извлечение воды и распределения ионов из экспериментов по рассеянию рентгеновских лучей.
Х. Т. Нгуен, С. А. Пабит, Л. Поллак, Д. А. Дело
J. Chem. Phys. 144 (21): 214105 (2016). [Аннотация]
Понимание структурных изменений нуклеиновых кислот путем сравнения экспериментов по широкоугольному рассеянию рентгеновских лучей (WAXS) с моделированием молекулярной динамики.
С. А. Пабит, А. М. Кац, И. С. Толох, А. Дроздецкий, Н. Бейкер, А. В. Онуфриев, Л. Поллак
J. Chem. Phys. 144 (20): 205102 (2016). [Аннотация]
SAXS-исследования РНК: структуры, динамика и взаимодействия с партнерами.
Y. Chen, L. Pollack
Wiley Interdisp Rev RNA. 2016 12 апреля [Аннотация]
Взаимодействия белок-ДНК и ион-ДНК выявлены с помощью вариации контраста SAXS.
Дж. М. Токуда, С. А. Пабит, Л. Поллак
Biophys.Ред. 8 (2): 139-149 (2016). [Аннотация]
Роль корреляции и сольватации в ионных взаимодействиях с B-ДНК.
М. Л. Сушко, Д. Г. Томас, С. А. Пабит, Л. Поллак, А. В. Онуфриев, Н. А. Бейкер
Biophys. J. 110 (2): 315-26 (2016). [Аннотация]
Настройка гибкости РНК с помощью длины спирали и последовательности соединений.
J. L. Sutton, L. Pollack
Biophys. J. 109 (12): 2644-53 (2015). [Аннотация]
Микро-изготовленный силиконовый держатель образца с фиксированной длиной оптического пути улучшает вычитание фона для cryoSAXS.
Дж. Б. Хопкинс, А. М. Кац, С. П. Мейсбургер, М. А. Варкентин, Р. Э. Торн, Л. Поллак
J. Appl. Cryst. 48: 227-237 (2015). [Аннотация]
Определение местоположения ионов и воды вокруг ДНК по измерениям рассеяния рентгеновских лучей.
С. П. Мейсбургер, С. А. Пабит, Л. Поллак
Biophys. J. 108 (12): 2886-95 (2015). [Аннотация]
Создание водорастворимых интегральных мембранных белков in vivo с использованием стратегии слияния амфипатических белков.
Д.Mizrachi, Y. Chen, J. Liu, H. M. Peng, A. Ke, L. Pollack, R. J. Turner, R. J. Auchus, M. P. DeLisa
Nat. Commun. 6: 6826 (2015). [Аннотация]
Точные профили мало- и широкоугольного рассеяния рентгеновских лучей от атомных моделей белков и нуклеиновых кислот.
Х. Т. Нгуен, С. А. Пабит, С. П. Мейсбургер, Л. Поллак, Д. А. Дело
J. Chem. Phys. 141 (22) (2014). [Аннотация]
Смесительная струя с двойной фокусировкой для исследования химической кинетики методом XFEL.
Д.Wang, U. Weierstall, L. Pollack, J. Spence
J. Synch. Рад. 21 (6): 1364-6 (2014). [Аннотация]
Почему двухцепочечная РНК сопротивляется конденсации.
И. С. Толох, С. А. Пабит, А. М. Кац, Ю. Чен, А. Дроздецкий, Н. Бейкер, Л. Поллак, А. В. Онуфриев
Nucleic Acids Research 42 (16): 10823-31 (2014). [Аннотация]
Выявление временных структур нуклеосом по мере раскручивания ДНК.
Я. Чен, Дж. М. Токуда, Т. Топпинг, Дж. Л. Саттон, С. П. Мейсбургер, С.А. Пабит, Л. М. Глосс, Л. Поллак Исследование нуклеиновых кислот
42 (13): 8767-76 (2014). [Аннотация]
Восстановление флавинов активирует криптохром дрозофилы.
A. T. Vaidya, D. Top, C. C. Manahan, J. M. Tokuda, S. Zhang, L. Pollack, M. W. Young, B.R. Crane
Proc. Natl. Акад. Sci. США 110 (51): 20455-60 (2013). [Аннотация]
Полиэлектролитные свойства одноцепочечной ДНК, измеренные с использованием SAXS и одномолекулярного FRET: за пределами модели червеобразной цепи.
С.П. Мейсбургер, Дж. Л. Саттон, Х. Чен, С. А. Пабит, С. Кирмизиалтин, Р. Элбер, Л. Поллак
Биополимеры. 99 (12): 1032-1045 (2013). [Аннотация]
Т-бокс РНК декодирует как информационное содержание, так и геометрию тРНК, чтобы влиять на экспрессию генов.
J. C. Grigg, Y. Chen, F. J. Grundy, T. M. Henkin, L. Pollack, A. Ke
Proc. Natl. Акад. Sci. США 110 (18): 7240-5 (2013). [Аннотация]
Роль ионной валентности в субмиллисекундном коллапсе и сворачивании малого домена РНК.
С. А. Пабит, Дж. Л. Саттон, Х. Чен, Л. Поллак
Биохимия. 52 (9): 1539-46 (2013). [Аннотация]
Преодоление предела радиационного повреждения с помощью Cryo-SAXS.
С. П. Мейсбергер, М. Варкентин, Х. Чен, Дж. Б. Хопкинс, Р. Э. Гиллилан, Л. Поллак, Р. Э. Торн
Biophys. J. 104 (1): 227-36 (2012). [Аннотация]
Специфичность двухцепочечного РНК-связывающего домена из активированной РНК протеинкиназы PKR для двухцепочечной РНК: выводы из термодинамики и малоуглового рассеяния рентгеновских лучей.
S. Patel, J. M. Blose, J. E. Solowski, L. Pollack, P. C. Bevilacqua
Biochemistry. 51 (46): 9312-22 (2012). [Аннотация]
Слияние вируса гриппа с мембраной, вызванное расщеплением протонов для изучения кинетики слияния с отдельными частицами.
Д. А. Костелло, Д. В. Ли, Дж. Древес, К. А. Васкес, К. Кислер, У. Вайснер, Л. Поллак, Г. Р. Уиттакер, С. Дэниел
Anal. Chem. 84 (20): 8480-9 (2012). [Аннотация]
Пиритовый след РНК.
Дж.К. Шлаттерер, М. С. Видер, К. Д. Джонс, Л. Поллак, М. Бреновиц
Biochem. Биофиз. Res. Commun. 425 (2): 374-8 (2012). [Аннотация]
РНК и ее ионное облако: эксперименты по рассеянию раствора и детальное моделирование с атомарной точки зрения.
С. Кирмизиалтин, С. А. Пабит, С. П. Мейсбургер, Л. Поллак, Р. Элбер
Biophys. J. 102 (4): 819-28 (2012). [Аннотация]
Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей и FRET-спектроскопия одиночных молекул дают сильно различающиеся представления о низкоденатурантном развернутом состоянии.
T. Y. Yoo, S. P. Meisburger, J. Hinshaw, L. Pollack, G. Haran, T. R. Sosnick, K. Plaxco
J. Mol. Биол. 418 (3-4): 226-36 (2012). [Аннотация]
Зависимая от ионной силы персистентная длина одноцепочечной РНК и ДНК.
H. Chen, S. P. Meisburger, S. A. Pabit, J. L. Sutton, W. W. Webb, L. Pollack
Proc. Natl. Акад. Sci. США 109 (3): 799-804 (2012). [Аннотация]
Двухцепочечная РНК сопротивляется конденсации.
Л. Ли, С. А. Пабит, С.Meisburger, L. Pollack
Phys. Rev. Lett., 106, 108101 (2011). [Аннотация]
Влияние защитного осмолита на ионную атмосферу, окружающую дуплексы ДНК.
Дж. М. Блоуз, С. А. Пабит, С. П. Мейсбургер, Л. Ли, К. Д. Джонс, Л. Поллак
Биохимия. 50 (40): 8540-7 (2011). [Аннотация]
Микрожидкостное устройство, которое генерирует гидроксильные радикалы для исследования доступной для растворителя поверхности нуклеиновых кислот.
К. Д. Джонс, Дж. К. Шлаттерер, М.Бреновиц, Л. Поллак
Lab Chip. 11 (20): 3458-64 (2011). [Аннотация]
Исследования ионно-нуклеиновой кислоты с помощью SAXS.
L. Pollack
Annu. Rev. Biophys. 40: 225-42 (2011). [Аннотация]
SAXS и сворачивание РНК с временным разрешением.
L. Pollack
Biopolymers, 95, 54 (2011). [Аннотация]
Подсчет ионов вокруг ДНК с помощью ASAXS.
С. А. Пабит, С. П. Мейсбургер, Л. Ли, Дж. М. Блоуз, К. Д. Джонс, Л. Поллак
Л.Являюсь. Chem Soc. 132 (46), стр 16336 (2010). [Аннотация]
Электростатика сильно заряженных биологических полимеров: ионно-опосредованные взаимодействия и самоорганизация в нуклеиновых кислотах и белках.
Джерард К.Л. Вонг, Лоис Поллак,
, Ежегодный обзор физической химии, том 61 (2010 г.). [Аннотация]
Световые отклики раствора белка LOV-домена с фотосвязным малоугловым рассеянием рентгеновских лучей.
Дж. С. Лэмб, Б. Золтовски, С. Пабит, Л. Ли, Б.Крейн и Л. Поллак.
Журнал молекулярной биологии 393, 909-919 (2009). [Аннотация]
Восстановление трехмерных огибающих формы по данным малоуглового рассеяния рентгеновских лучей с временным разрешением.
J.S. Lamb, L. Kwok, X. Qiu, K. Andresen, H. Park и L. Pollack
J. App. Cryst. 41, 1046 (2008). [Аннотация]
Закрытие крышки на взаимодействиях ДНК в стопке «конец-в-конец».
L. Li, S.A. Pabit, J.S. Lamb, H.Y. Park and L. Pollack
Appl. Phys.Lett. 92, 223901 (2008). [Аннотация]
Как спиральная топология, так и распределение противоионов способствуют более эффективному экранированию заряда в дцРНК по сравнению с дцДНК.
S.A. Pabit, X. Qiu, J.S. Lamb, L. Li, S.P. Meisburger и L. Pollack
Nucleic Acids Research 37 (12): 3887-96 (2009). [Аннотация]
Использование аномального малоуглового рассеяния рентгеновских лучей для исследования ионной атмосферы вокруг нуклеиновых кислот.
S. A. Pabit, K.D. Финкельштейн и Л. Поллак
Методы в энзимологии, Том 469: Биофизические, химические и функциональные исследования структуры, взаимодействий и складывания РНК, Часть B Том: 469 Страницы: 391-410 (2009).[Аннотация]
Рассеяние рентгеновских лучей с временным разрешением и сворачивание РНК.
Л. Поллак и С. Дониах
Методы в энзимологии, Том 469: Биофизические, химические и функциональные исследования структуры, взаимодействий и складывания РНК, Часть B Том: 469 Страниц: 253-268 (2009). [Аннотация]
Резкий переход от свободной отталкивающей к конденсированной и притягивающей фазе ДНК, индуцированный поливалентными катионами полиаминов.
X. Qiu, K. Andresen, J.S. Lamb, L.W. Kwok, L. Pollack
Phys.Rev. Lett. 101, 228101 (2008). [Аннотация]
Димеризация с временным разрешением белка PAS-LOV, измеренная с помощью фотосвязанного малоуглового рентгеновского рассеяния.
J.S. Lamb, B. Zoltowski, S.A. Pabit, B.R. Crane и L. Pollack
J. Amer. Chem. Soc. 130, 12226 (2008). [Аннотация]
Жесткость шарнира препятствует сворачиванию РНК.
J. Schlatterer, L.W. Квок, Дж. Lamb, H.Y. Парк, К. Андресен, М. Бреновиц и Л. Поллак
J. Mol. Биол. 379, 859 (2008).[Аннотация]
Моно- и трехвалентные ионы вокруг ДНК: исследование конкуренции и взаимодействий методом малоуглового рассеяния.
К. Андресен, Х. Цю, С. А. Пабит, Дж. С. Лэмб, H.Y. Парк, Л. Квок и Л. Поллак
Biophys. J., 95, 287 (2008). [Аннотация] [PDF]
Конформационные изменения кальмодулина при связывании Ca2 + изучены с помощью микрожидкостного миксера.
H.Y. Park, S.A. Kim, J. Korlach, E. Rhoades, L. W. Kwok, W. R. Zipfel, M. N. Waxham, W. W. Webb и L.Pollack
Proc. Национальная академия наук США, 105 (2), 542 (2008). [Аннотация]
Притяжение между ДНК, опосредованное двухвалентными противоионами.
X. Qiu, K. Andresen, L.W. Квок, Дж. Lamb, H.Y. Park, and L. Pollack
Phys. Rev. Lett., 99 038104 (2007). [Аннотация]
Фокусирующая капиллярная оптика для использования в растворе SAXS.
J.S. Лэмб, С. Корнаби, К. Андресен, Л.В. Квок, Х. Парк, X. Qiu, D.M. Smilgies, D.H. Bilderback, L. Pollack,
J. Appl. Cryst.2007, 40, 193. [Аннотация]
Достижение равномерного перемешивания в микрофлюидном устройстве: гидродинамическое фокусирование перед перемешиванием.
H.Y. Park, X. Qiu, E. Rhoades, J. Korlach, L.W. Квок, W.R. Zipfel, W.W. Уэбб и Л. Поллак
Анал. Chem., 78, 4465 (2006). [Аннотация]
Измерение потенциалов между ДНК в растворе.
X. Qiu, L.W. Квок, Х. Парк, Дж. Лэмб, К. Андресен, Л. Поллак
Phys. Rev. Lett., 96, 138101 (2007). [Аннотация]
Согласованные измерения кинетики складывания с локальной и глобальной точки зрения.
Л.В. Квок, И.Щербакова, Ю.С. Lamb, H.Y. Парк, К. Андресен, Х. Смит, М. Бреновиц и Л. Поллак
J. Mol. Биол., 355, 282 (2006). [Аннотация]
Пространственное распределение конкурирующих ионов вокруг ДНК.
К. Андресен, Р. Дас, Х.Ю. Парк, Л. Квок, Дж. Lamb, H. Smith, D. Herschlag, K.D. Финкельштейн, Л. Поллак
Phys. Rev. Lett., 93, 248103, (2004). [Аннотация]
Распределение противоионов вокруг ДНК, исследованное с помощью рассеяния рентгеновских лучей.
р.Das, T. T. Mills, L. W. Kwok, G. S. Maskel, I.S. Millett, D. Doniach, K. D. Finkelstein, D. Herschlag, L. Pollack
Phys. Rev. Lett., 90, 188103 (2003). [Аннотация]
Самые быстрые глобальные события в сворачивании РНК.
R. Das, L.W. Квок, И. Миллетт, Й. Бай, Т.Т. Миллс, Дж. Джейкоб, Г.С. Маскель, С. Зайферт, С.Г.Дж. Mochrie, P. Thiyagarajan, S. Doniach, L. Pollack и D. Herschlag
J. Mol. Биол., 332, 311 (2003). [Аннотация]
Быстрое уплотнение во время сворачивания РНК.
R. Russell, I. S. Mil.ett, M. W. Tate, L. W. Kwok, B. Nakatani, S. M. Gruner, S. G. J. Mochrine, V. Pande, S. Doniach, D. Herschlag and L. Pollack
Proc. Natl. Акад. Sci. 99, стр. 4266 (2002). [Аннотация]
Коллапс сворачивающегося белка с временным разрешением, наблюдаемый с помощью малоуглового рассеяния рентгеновских лучей.
Л. Поллак, М. В. Тейт, А. К. Финнефрок, К. Калидас, С. Троттер, Н. К. Дарнтон, Л. Лурио, Р. Х. Остин, К. А. Батт, С. М. Грюнер и С. Г. Дж. Мохрин
Phys.Rev. Lett. 86, стр. 4692 (2001). [Аннотация]
Компактность денатурированного состояния быстро сворачивающегося белка, измеренная с помощью субмиллисекундного малоуглового рассеяния рентгеновских лучей.
Л. Поллак, М. В. Тейт, Н. К. Дарнтон, Дж. Б. Найт, С. М. Грюнер, В. А. Итон и Р. Х. Остин
Proc. Natl. Акад. Sci. USA 96, 10115-10117 (1999). [Аннотация]