Лада x рей: LADA XRAY кроссовер от 602 910 руб. – Цены и комплектации – Официальный сайт LADA

Содержание

LADA XRAY Cross 2021 года: фото, цены, комплектации, характеристики

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• LED-дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов.

Цвет черный
• Обивка сидений ткань. Цвет черный
• Розетка 12V на центральной консоли

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте и по вылету рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Аудиоподготовка

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• Рейлинги
• Декоративная насадка выпускной трубы
• 16'' легкосплавные диски (только для 1.6 МТ)
• Запасное стальное колесо временного использования 15''

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении

• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• LED-дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет черный
• Обивка сидений ткань. Цвет черный
• Розетка 12V на центральной консоли

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте и по вылету рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол

• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Кондиционер
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Аудиосистема (2DIN, FM/AM с функцией RDS, USB, AUX, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• Рейлинги
• Декоративная насадка выпускной трубы
• 16'' легкосплавные диски (только для 1.6 МТ)
• Запасное стальное колесо временного использования 15''

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• LED-дневные ходовые огни

• Противотуманные фары
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Центральный подлокотник с боксом
• Складная спинка переднего пассажирского сиденья
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет черный
• Обивка сидений ткань. Цвет черный
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетки 12V на центральной консоли, для задних пассажиров и в багажном отделении
• Двойной пол багажного отделения

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте и по вылету рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте

• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений 3х уровневый
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Датчики парковки задние
• Кондиционер
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Аудиосистема (2DIN, FM/AM с функцией RDS, USB, AUX, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• Рейлинги
• Декоративная насадка выпускной трубы
• 16'' легкосплавные диски (только для 1. 6 МТ)
• Запасное стальное колесо временного использования 15''

• LADA Ride Select (селектор выбора режима движения) (только для МТ)
• Электронная блокировка дифференциала (EDL) (только для МТ)

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения

• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• LED-дневные ходовые огни
• Противотуманные фары
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Дисковые тормоза задних колес (только для 1.8 МТ и АТ)
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Центральный подлокотник с боксом
• Складная спинка переднего пассажирского сиденья
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40

• Обивка потолка черного цвета
• Панель приборов. Цвет черный
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет черный
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетки 12V на центральной консоли, для задних пассажиров и в багажном отделении
• Двойной пол багажного отделения

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте и по вылету рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений 3х уровневый
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Датчики парковки задние
• Камера заднего вида
• Кондиционер
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Мультимедийная система с навигацией на платформе Яндекс.Авто (8'' емкостной сенсорный экран, USB, Bluetooth, голосовое управление), 6 динамиков

• Крыша кузова черного цвета
• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота черного цвета
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• Рейлинги
• Декоративная насадка выпускной трубы
• 17'' легкосплавные диски Proton
• Запасное стальное колесо временного использования 15''

• LADA Ride Select (селектор выбора режима движения) (только для МТ)
• Электронная блокировка дифференциала (EDL) (только для МТ)

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• LED-дневные ходовые огни
• Противотуманные фары с функцией освещения поворота

• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Дисковые тормоза задних колес (только для 1.8 МТ и АТ)
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Центральный подлокотник с боксом
• Складная спинка переднего пассажирского сиденья
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет (по выбору) оранжевый/черный
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Отделка руля и чехла селектора КПП кожей
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетки 12V на центральной консоли, для задних пассажиров и в багажном отделении
• Розетка USB для задних пассажиров

• Выдвижной ящик под сиденьем переднего пассажира
• Двойной пол багажного отделения
• Подсветка мест входа-выхода в передних дверях

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте и по вылету рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев рулевого колеса
• Подогрев передних сидений 3х уровневый
• Подогрев задних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Датчики дождя и света
• Климат-контроль
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Круиз-контроль и ограничитель скорости
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Аудиосистема (2DIN, FM/AM с функцией RDS, USB, AUX, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• Рейлинги
• Декоративная насадка выпускной трубы

• 17'' легкосплавные диски Proton
• Запасное стальное колесо временного использования 15''

• LADA Ride Select (селектор выбора режима движения) (только для МТ)
• Электронная блокировка дифференциала (EDL) (только для МТ)

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• LED-дневные ходовые огни
• Противотуманные фары с функцией освещения поворота
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Дисковые тормоза задних колес (только для 1.8 МТ и АТ)
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Центральный подлокотник с боксом
• Складная спинка переднего пассажирского сиденья
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет (по выбору) оранжевый/черный
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Отделка руля и чехла селектора КПП кожей
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетки 12V на центральной консоли, для задних пассажиров и в багажном отделении
• Розетка USB для задних пассажиров
• Выдвижной ящик под сиденьем переднего пассажира
• Двойной пол багажного отделения
• Атмосферная подсветка салона
• Подсветка мест входа-выхода в передних дверях

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте и по вылету рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Усиленная тонировка задних стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев рулевого колеса
• Подогрев передних сидений 3х уровневый
• Подогрев задних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Камера заднего вида
• Датчики дождя и света
• Климат-контроль
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Круиз-контроль и ограничитель скорости
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Мультимедийная система с навигацией (7'' цветной дисплей с TouchScreen, FM/AM с функцией RDS, USB, AUX, Bluetooth, Hands free, Android Auto, Apple Car Play), 6 динамиков

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• Рейлинги
• Декоративная насадка выпускной трубы
• 17'' легкосплавные диски Proton
• Запасное стальное колесо временного использования 15''

• LADA Ride Select (селектор выбора режима движения) (только для МТ)
• Электронная блокировка дифференциала (EDL) (только для МТ)

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• LED-дневные ходовые огни
• Противотуманные фары с функцией освещения поворота
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Дисковые тормоза задних колес (только для 1.8 МТ и АТ)
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Центральный подлокотник с боксом
• Складная спинка переднего пассажирского сиденья
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет (по выбору) оранжевый/черный
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Отделка руля и чехла селектора КПП кожей
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетки 12V на центральной консоли, для задних пассажиров и в багажном отделении
• Розетка USB для задних пассажиров
• Выдвижной ящик под сиденьем переднего пассажира
• Двойной пол багажного отделения
• Атмосферная подсветка салона
• Подсветка мест входа-выхода в передних дверях

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте и по вылету рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Усиленная тонировка задних стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев рулевого колеса
• Подогрев передних сидений 3х уровневый
• Подогрев задних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Камера заднего вида
• Датчики дождя и света
• Климат-контроль
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Круиз-контроль и ограничитель скорости
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Мультимедийная система с навигацией на платформе Яндекс. Авто (8'' емкостной сенсорный экран, USB, Bluetooth, голосовое управление), 6 динамиков

• Крыша кузова черного цвета
• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота черного цвета
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• Рейлинги
• Декоративная насадка выпускной трубы
• 17'' легкосплавные диски Proton
• Запасное стальное колесо временного использования 15''

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• LED-дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Дисковые тормоза задних колес (только для 1. 8 МТ и АТ)
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет черный
• Обивка сидений ткань. Цвет черный
• Розетка 12V на центральной консоли

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте и по вылету рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Кондиционер
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Аудиосистема (2DIN, FM/AM с функцией RDS, USB, AUX, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• Рейлинги
• Декоративная насадка выпускной трубы
• 16'' легкосплавные диски (только для 1. 6 МТ)
• 17'' легкосплавные диски Proton
• Запасное стальное колесо временного использования 15''

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• LED-дневные ходовые огни
• Противотуманные фары
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Дисковые тормоза задних колес (только для 1.8 МТ и АТ)
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Центральный подлокотник с боксом
• Складная спинка переднего пассажирского сиденья
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет черный
• Обивка сидений ткань. Цвет черный
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетки 12V на центральной консоли, для задних пассажиров и в багажном отделении
• Двойной пол багажного отделения

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте и по вылету рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений 3х уровневый
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Датчики парковки задние
• Кондиционер
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Аудиосистема (2DIN, FM/AM с функцией RDS, USB, AUX, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• Рейлинги
• Декоративная насадка выпускной трубы
• 16'' легкосплавные диски (только для 1. 6 МТ)
• 17'' легкосплавные диски Proton
• Запасное стальное колесо временного использования 15''

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• LED-дневные ходовые огни
• Противотуманные фары
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Дисковые тормоза задних колес (только для 1.8 МТ и АТ)
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Центральный подлокотник с боксом
• Складная спинка переднего пассажирского сиденья
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Обивка потолка черного цвета
• Панель приборов. Цвет черный
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет черный
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетки 12V на центральной консоли, для задних пассажиров и в багажном отделении
• Двойной пол багажного отделения

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте и по вылету рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений 3х уровневый
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Датчики парковки задние
• Камера заднего вида
• Кондиционер
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Мультимедийная система с навигацией на платформе Яндекс.Авто (8'' емкостной сенсорный экран, USB, Bluetooth, голосовое управление), 6 динамиков

• Крыша кузова черного цвета
• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота черного цвета
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• Рейлинги
• Декоративная насадка выпускной трубы
• 17'' легкосплавные диски Proton
• Запасное стальное колесо временного использования 15''

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• LED-дневные ходовые огни
• Противотуманные фары с функцией освещения поворота
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Дисковые тормоза задних колес (только для 1.8 МТ и АТ)
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Центральный подлокотник с боксом
• Складная спинка переднего пассажирского сиденья
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет (по выбору) оранжевый/черный
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Отделка руля и чехла селектора КПП кожей
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетки 12V на центральной консоли, для задних пассажиров и в багажном отделении
• Розетка USB для задних пассажиров
• Выдвижной ящик под сиденьем переднего пассажира
• Двойной пол багажного отделения
• Подсветка мест входа-выхода в передних дверях

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте и по вылету рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев рулевого колеса
• Подогрев передних сидений 3х уровневый
• Подогрев задних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Датчики дождя и света
• Климат-контроль
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Круиз-контроль и ограничитель скорости
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Аудиосистема (2DIN, FM/AM с функцией RDS, USB, AUX, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• Рейлинги
• Декоративная насадка выпускной трубы
• 17'' легкосплавные диски Proton
• Запасное стальное колесо временного использования 15''

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• LED-дневные ходовые огни
• Противотуманные фары с функцией освещения поворота
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Дисковые тормоза задних колес (только для 1.8 МТ и АТ)
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Центральный подлокотник с боксом
• Складная спинка переднего пассажирского сиденья
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет (по выбору) оранжевый/черный
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Отделка руля и чехла селектора КПП кожей
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетки 12V на центральной консоли, для задних пассажиров и в багажном отделении
• Розетка USB для задних пассажиров
• Выдвижной ящик под сиденьем переднего пассажира
• Двойной пол багажного отделения
• Атмосферная подсветка салона
• Подсветка мест входа-выхода в передних дверях

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте и по вылету рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Усиленная тонировка задних стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев рулевого колеса
• Подогрев передних сидений 3х уровневый
• Подогрев задних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Камера заднего вида
• Датчики дождя и света
• Климат-контроль
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Круиз-контроль и ограничитель скорости
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Мультимедийная система с навигацией (7'' цветной дисплей с TouchScreen, FM/AM с функцией RDS, USB, AUX, Bluetooth, Hands free, Android Auto, Apple Car Play), 6 динамиков

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• Рейлинги
• Декоративная насадка выпускной трубы
• 17'' легкосплавные диски Proton
• Запасное стальное колесо временного использования 15''

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• LED-дневные ходовые огни
• Противотуманные фары с функцией освещения поворота
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Дисковые тормоза задних колес (только для 1.8 МТ и АТ)
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Центральный подлокотник с боксом
• Складная спинка переднего пассажирского сиденья
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет (по выбору) оранжевый/черный
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Отделка руля и чехла селектора КПП кожей
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетки 12V на центральной консоли, для задних пассажиров и в багажном отделении
• Розетка USB для задних пассажиров
• Выдвижной ящик под сиденьем переднего пассажира
• Двойной пол багажного отделения
• Атмосферная подсветка салона
• Подсветка мест входа-выхода в передних дверях

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте и по вылету рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Усиленная тонировка задних стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев рулевого колеса
• Подогрев передних сидений 3х уровневый
• Подогрев задних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Камера заднего вида
• Датчики дождя и света
• Климат-контроль
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Круиз-контроль и ограничитель скорости
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Мультимедийная система с навигацией на платформе Яндекс. Авто (8'' емкостной сенсорный экран, USB, Bluetooth, голосовое управление), 6 динамиков

• Крыша кузова черного цвета
• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота черного цвета
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• Рейлинги
• Декоративная насадка выпускной трубы
• 17'' легкосплавные диски Proton
• Запасное стальное колесо временного использования 15''

Подбор сигнализации на Lada X-Ray – установка, цены, автозапуск. Защита от угона для автомобиля Лада Х-рей

Защита Лада Х-рей от угона

Lada X-Ray может быть защищена от угона с помощью как электронных, так и механических систем – рассмотрим все доступные варианты.

Купить автосигнализацию на Лада Х-Рей можно не выходя из дома – в нашем интернет-магазине вы можете заказать доставку в любое удобное для вас место и время. 

Однако мы рекомендуем не ограничиваться только электронной защитой и рассмотреть возможность установки механических блокираторов: они значительно увеличивают время, необходимое на угон, что делает последний совершенно нецелесообразным.  

Например, электромеханический замок капота не дает злоумышленнику получить доступ к агрегатам и проводке под капотом, управляет замком сигнализация – вам не придется ничего делать дополнительно. Замок на руль не даст поворачивать рулевое колесо, что исключит возможность угона своим ходом; такая же функция и у блокиратора коробки передач – угонщик просто не сможет включить никакую передачу.

Цены

Ниже приведены сигнализации, которые мы рекомендуем для данного автомобиля. Цена напрямую зависит от функционала - дешевле всего будет стоить простая модель с обратной связью на ЖК-брелок, а более продвинутые модели предложат управление сигнализацией со смартфона по GSM и Bluetooth, определение GPS-координат и другие возможности.

Все цены на сайте актуальны - уже сейчас вы можете выбрать модель охранной системы, ориентируясь на бюджет, которым располагаете.

Автозапуск

Так как для Лада Х-рей сигнализация Пандора поддерживает бесключевой обход штатного иммобилайзера, при подключении автозапуска все ключи от автомобиля останутся у владельца – никаких лишних хлопот и неудобств.

Блокировка двигателя по CAN добавит дополнительный рубеж защиты: она скрыта в штатной проводке авто, поэтому найти и деактивировать ее практически невозможно.

Установка сигнализации на Лада Х-рей

Благодаря наличию в автомобиле цифровой CAN-шины, установка сигнализации на Лада Х-Рей производится с ее использованием - это позволяет получить обширный охранный и сервисный функционал даже с самыми базовыми охранными системами.

В частности, будут доступны следующие функции:

  • Бесключевой автозапуск
  • Блокировка двигателя по CAN
  • Кодовый иммобилайзер
  • Отображение уровня топлива
  • Отображение температуры двигателя

Шины, диски на Лада икс рей (Lada Xray)

Параметры дисков и шин необходимо знать всем владельцам автомобиля Lada Xray для того, чтобы не столкнуться с негативными последствиями замены заводских колес. Есть несколько причин, по которым производится замена колес: сезонность, износ прежних покрышек или желание водителя изменить внешний вид автомобиля. Опытные автолюбители знают, что при желании изменить внешний вид машины, водитель, скорее всего, задумается о замене дисков и диаметра колес. Но для того, чтобы замена положительно сказалась еще и на технических характеристиках транспортного средства, нужно изучить рекомендации по этому вопросу.

Какие типоразмеры шин и дисков компания KOLOBOX рекомендует для Lada Xray?

Размер колес, рекомендуемый для средства передвижения, зависит от года его выпуска и модификации.

Согласно таблице, размеры автошин Лада Икс Рей находятся в следующих интервалах: ширина колес составляет от 195 до 205 мм, профиль, т.е. отношение ширины к высоте, от 50 до 65%, а диаметр покрышек от 15 до 17 дюймов.

Какая резина подходит для автомобиля Lada Xray в зимнее время года?

Покупка качественной, подходящей зимней резины - важный вопрос для автомобиля Лада Икс Рей, т. к. шины необходимой мягкости, рисунка протектора обеспечат безопасность, которая подвергается опасности в зимний гололед.

Рынок шинной продукции переполнен моделями как бюджетных марок, так и премиальными шинами известных брендов. В выборе покрышек важно мировое имя, свидетельствующее о долголетнем качестве и множестве последователей. Но нужно понимать, что важно и полное соответствие покупаемых шин требуемым характеристикам.

В таблице представлены возможные варианты зимней резины для этого автомобиля.

Зимние автошины Lada Xray
Кama 505 IRBIS
Nokian WR D4
Nokian Hakkaptliitta 8
Hankook Winter I*CEPT EVO
Bridgestoe Blizzak VRX
Goodyear Ultragrip Performance

Какие шины подходят для автомобиля Lada Xray в летнее время года?

При желании замены летних шин на автомобиль Лада Икс Рей возможны различные вариации как диаметра шин, так и дизайна дисков. Возможна установка низкопрофильных колес. Это придаст автомобилю более современный, динамичный и агрессивный вид, отняв у водителя комфорт во время езды. К сожалению, тонкие, широкие шины с большой прытью передают все недостатки дорожного покрытия. Одной из первых на себе это ощущает подвеска машины, износ которой возрастет.

В таблице представлены возможные варианты летних покрышек.

Летние автошины Лада Икс Рей Pirelli Cinturato P7 91V
Maxxis HP5 Premitra5 91V
Kama Euro-129 91V
Laufenn S-Fit EQ (LK01) 93W
Goodyear Efficientgrip 93H
Continental PremiumContact 6 89V (FR)
Bridgestone Potenza Adrenalin RE003 93W (XL)

Какие диски рекомендуются для автомобиля Lada Xray?

Лада, в зависимости от комплектации, поставляется с разными колесными дисками: штампованными диаметра 15 и 16 дюймов и легкосплавными дисками диаметра 16 дюймов. От завода-производителя поступала информация о выпуске этого авто с дисками 17-го диаметра, но пока этого не произошло.

Разболтовка колес Лада Икс Рей схожа с Рено Логан и имеет такие значения: четыре отверстия для крепления, которые находятся на окружности диаметром 100 мм.

Какое давление рекомендуется для шин автомобиля Lada Xray?

Рекомендуемое давление для колес Лады Икс Рей при частичной (не более трех человек с учетом отсутствия груза в багажнике авто) и полной загрузке (три и более человека в салоне и более 50 кг груза в багажном отделении) для передних колес 2,2 Атм, для задних колес 2,0 Атм.

Каково влияние размера шин и дисков на характеристики автомобиля?

Рассмотрим влияние в таблице ниже:

Большой тест: Kia Rio X-Line, Renault Sandero Stepway, Lada X-Ray Cross | Тест-драйвы

Способ переделки обычного хетчбека в кросс-хетч довольно прост: пару сантиметров к дорожному просвету, за счет удлиненных пружин и штоков амортизаторов, плюс пластиковый обвес по нижнему периметру кузова. По такому рецепту сделаны Kia Rio X-Line и Renault Sandero Stepway. У Лады X-Ray Cross отличий от донорского Иксрея на два порядка больше. Кроме новых упругих элементов – «по кругу», тут оригинальный передний подрамник в купе с рычагами и поворотными кулаками. А так же новый электроусилитель руля калужского завода «Автоэлектроника».


От обычного Иксрея, Cross отличается не только обвесом и колесами, но и бамперами с продолжением х-образных подштамповок

Передняя колея X-Ray Cross шире на 19 мм, а задняя на все 54 мм. Любопытно, но инициаторами широкой колеи были не инженеры, а главный вазовский художник Стив Маттин. Англичанин настоял на том, что бы колеса кросс-хетча стояли ближе к аркам, так по мнению мэтра, автомобиль выглядит цельно сбитым и основательным. Кто бы спорил! Кроме того Маттин хотел установить на Cross 18-дюймовые колеса, но после обсуждения заводчане сошлись на компромиссной обувке R17. Что для компактной машинки В-класса тоже не мало. К примеру, Kia и Renault укомплектованы колесами на размер меньше.


Угловатый дизайн передней панели Лады – на любителя. Однако в отличии от Renault рулевая колонка регулируется по углу наклона и вылету, что обеспечивает водителю более удобную посадку


Среди участников теста, только у вазовского паркетника есть внедорожный ассистент. Система Lada Ride Select попутно отвечает и за активацию спорт-режима. Кроме того тут новые передние кресла и регулируемая по вылету рулевая колонка. Пусть диапазон перемещения телескопического механизма всего 42 мм, но это именно те миллиметры, которые позволяют распрямить конечности и найти более удобную посадку, чем в соплатфоменном Sandero.


Система Lada Ride Select не заменит механический полный привод, но и считать оную бесполезной безделушкой тоже не стоит. Мы проверили – на бездорожье ассистент реально помогает

Среди мелких изменений интерьера: именные накладки на порогах, комбинация приборов с оранжевой подложкой, а так же обогревы руля и сидений. Причем передние грелки – трехрежимные, с автоматическим снижением интенсивности нагрева. У обычного Иксрея таких нет. Наконец у «Кросса» улучшена шумоизоляция салона. Кроме снижения шума как такового, это положительно повлияло и на звучание штатной аудиосистемы. При тех же компонентах, что и у Renault «музыка» в Ладе играет детальней и глубже.

Недавний рестайлинг освежил внешность Степвея добавив недорогому хетчбеку лоска

У Sandero Stepway, построенного на той же несовершенной платформе В0, что и X-Ray Cross регулируемой по вылету рулевой колонки как не было так и нет. Посадку водителя усугубляет кресло неоптимальной формы: подушка тут уж очень короткая, спинка плохо фиксирует тело, а подголовник не обеспечивает опоры затылку. Нет тут и камеры заднего вида, которая присутствует в дорогих версиях Лады и Kia, а так же обогревов руля и заднего дивана. Зато на втором ряду места чуть больше, чем в соплатформенном Иксрее, а сама «сидушка» с мягким наполнителем более удобна.


В интерьере Stepway не найти отличий от обычного Sandero. Пластик жесткий, но качество материалов вполне приличное


Но комфортней всего пассажирам будет в Kia. По запасу пространства на втором ряду Rio X-Line – рекордсмен. Да и водителю грех жаловаться, под ним отлично спрофилированное кресло. Перед глазами читабельная комбинация приборов с крупными шкалами, эргономика продумана до мелочей: все крутилки-кнопочки на своих местах, искать ничего не приходится. Жаль дисплей мультимедийной системы мелковат и расположен почти вертикально. На солнце экранчик нещадно бликует. Впрочем, за Renault и Ладой водится тот же грешок.

Обычный хетчбек Rio в России не представлен, альтернатива седану предлагается с псевдовнедорожным пакетом X-Line

Еще отметим, что в Kia самая легковая посадка, как в обычном Rio – привыкать и переучиваться не придется. Водители соплатформенных Sandero Stepway и X-Ray Cross восседают над дорогой заметно выше. С одной стороны капитанская посадка обеспечивает лучшую обзорность, с другой – присутствует некое ощущение отстраненности от автомобиля. Со временем к этой особенности привыкаешь, но на первых порах подсознательно тянешься рукой к домкратику регулировки кресла, что бы опуститься пониже.


Эргономика продумана почти до мелочей, но искать мягкий пластик в салоне Rio X-Line бесполезно


Наиболее широкий выбор силовых агрегатов у Renault. Кроме старых моторов К4М (1.6 л., 82 л.с. и 1.6 л., 102 л.с.), в гамме присутствует ниссановский движок того же объема (113 л.с.). И трансмиссии, что называется в ассортименте: «механика», «автомат», вариатор. У Kia два мотора (1.4 л., 100 л.с. и 1.6 л., 123 л.с.) и две шестиступенчатых коробки: «механика» и «автомат». А вот у Лады альтернативы «атмосфернику» 1.8 л. (122 л.с.) агрегатированным с пятиступенчатой механической трансмиссией нет. «Робот» АМТ, как и двигатель 1.6 – в перспективе.

Renault Sandero Stepway

Kia Rio X-Line

Lada X-Ray Cross

С маркетинговой точки зрения отсутствие двухпедальной модификации – серьезный «косяк». Но и физически X-Ray Cross с «механикой» далек от совершенства. Что бы тронуться с места без рывка приходится ювелирно работать совершенно неинформативным акселератором и длинноходным сцеплением. Чуть ошибся и Lada прыгает с места. Легковесная педаль газа усложняет движение в пробках, а также на грунтовке, когда нужно проехать неровный участок черепашьим шагом.

Управляемость с перчинкой. В повороте задняя ось доворачивает кросс-хетч по вертикальной оси. Однако заноса можно не опасаться, благодаря толково настроенной системе стабилизации

Двигатель 1.8 тоже – вещь в себе. На холостом ходу он не только нагружает вибрациями органы управления, но и заполняет салон громким и не слишком приятным уху урчанием. До 2000 об/мин движок с индексом 21179 спит крепким сном, лишая возможности двигаться в натяг. Зато преодолев трехтысячную отметку тахометра, просыпается активным подхватом, который не скисает вплоть до электронной отсечки. В общем, гонять на X-Ray Cross куда проще и интересней, чем двигаться в рамках законопослушных скоростей.


В движении превалирует голос мотора, который перекрывает шум шин и завывания ветра

К механической коробке вопросов считай нет. Ходы невелики, избирательность рычага на твердую «четверку». Жаль передач тут всего пять, причем довольно коротких. Разогнавшись, так и хочется подоткнуть несуществующую, шестую ступень, что бы приглушить навязчивый шум мотора и снизить его аппетит. Все таки девять литров «на сотню» в смешанном цикле, многовато, для столь компактного автомобиля.

На газ Renault реагирует с ощутимыми задержками. Разгонная динамика самая скромная из участников теста

Однако 113-сильный Sandero Stepway при том же темпе движения потребляет еще где-то на 0,3 литра больше. А если на полдня застрять в глухой пробке, на дисплейчике комбинации приборов и вовсе высветится «десятка». При этом какой то выдающейся динамикой Renault не отличается: не густо, но и не пусто, в общем – середнячок.

А вот ниссановский вариатор, который начали ставить на Степвэи после рестайлинга порой заслуживает крепкого словца. Нет, сам агрегат в принципе не плох: умело имитирует смены передач, не размазывает сопли по шкивам при интенсивных разгонах и даже тормозит двигателем при снижении скорости. Однако из-за неудачных настроек электронного софта, реагирует на подачу топлива с неприличной задумчивостью, что бы добиться сколь ни будь заметного ускорения, педаль газа приходится прожимать аж на половину хода. Но и после этого приходится ждать: сначала повышаются обороты мотора и только после этого автомобиль начинает нехотя ускоряться.


Подвеска Renault дает меньше комфорта, нежели Lada и тем более Kia, Но при этом его салон лучше других изолирован от внешних шумов

Rio X-Line жертвоприношений не требует. Переводишь селектор классического «автомата» в драйв, добавляешь тягу точным акселератом и корейский «кроссовок» мягко отчаливает с места. Хочешь ускоряйся плавно, хочешь – жги резину в пробуксовке колес, Kia с легкостью принимает любые правила игры. Причем всегда выполняет команды, так как ожидает водитель. Ну почти всегда.

Связь силового агрегата с ведущими колесами хотелось бы все же покрепче. Ну или хотя бы наличие обостряющего отклики режима Sport, что бы самому влиять на взаимосвязь с мотором. «Автомат» в плавности переключений не упрекнуть – тут все гладко, но вот их частота порой раздражает. Понижающие смены происходят при каждой мало-мальской подаче топлива, то есть коробка не позволяет мотору раскручиваться в пределах одной передачи. Меж тем силенок корейскому «атмосфернику» 1.6 вполне хватает. И зверским аппетитом тот не страдает – 8,6 л на 100 км пути.

В поворотах Rio X-Line демонстрирует завидную стабильность и нейтральные повадки. Обратная связь на руле возрастает равномерно углу поворота рулевого колеса

Управляется Kia надежно. Руль на малых скоростях почти невесом, но с ростом скорости тяжелеет, позволяя вести автомобиль по прямой без вихляний и подруливаний. При отклонениях баранки появляется и обратная связь. Крены кузова в поворотах не пугают, достигнув предела по сцеплению шин Rio X-Line безопасно смещается наружу поворота в сносе передних колес. Одним словом – отличник.


В движении салон Rio X-Line наполняется шинным гулом

Sandero Stepway едет иначе. Руль неоправданно тяжел во всех режимах, вместо обратной связи – густое фоновое усилие. Да и крены в поворотах самые ощутимые из всей троицы. Зажигать на Renault как-то не тянет. А вот X-Ray Cross будто сам подначивает водителя промчать по извилистой дорожке. Пусть руль Лады отличается слишком высоким возвратным усилием, но при этом выдает самую честную информацию о положении управляемых колес. В быстрых поворотах задняя ось немного доворачивает кроссовер, смещая баланс управляемости в сторону избыточности. Но от скольжений ее страхует строгая система стабилизации.

Самый скромный дорожный просвет у Kia – 190 мм. У Renault под днищем всего на 5 мм больше, но по факту Stepway лучше приспособлен для бездорожья. Клиренсу Лады позавидуют иные внедорожники – 215 мм. При этом у «Кросса» самая короткоходная задняя подвеска

А кто самый комфортный в нашей троице? Вновь – Kia! Подвеска чуть жестче, чем у седана Rio, что особенно заметно на неровностях с острыми краями, но с остальным дорожным браком она расправляется вполне уверенно. Правда по энергоемкости упругих элементов Renault и Lada превосходят «корейца», крупные ямы эта парочка утюжит без пробоев и ударов. Особенно преуспевает в этом X-Ray Cross, который отлично расправляется как глубокими рытвинами, так и с лежачими полицейскими. И это на «семнадцатых» колесах!

Kia Rio X-Line

Багажный отсек Kia с простенькой отделкой вмещает 390-1075 л поклажи. Под полом полноразмерное запасное колесо

Renault Sandero Stepway

Багажник Renault объемом 320 л отделан опрятней чем в Kia, но лишен фурнитуры в виде крючков и кармашков. В нише лежит полноразмерное запасное колесо

Lada X-Ray Cross

Только в багажнике Лады есть двухуровневый пол. Но даже если удалить перегородку, объем отсека составит скромные 361 л. Запасное колесо – полноценное

Подвеска Sandero Stepway менее всеядна. При попадании колеса в яму комфорт в салоне почти не страдает, но если на пути бугорок или тот же лежачий полицейский, тряханет так, что можно и язык прикусить. Судя по всему, из-за лифтинга кузова, амортизаторы Renault по разному работают при отбое и сжатии. Но вот, что интересно, стоит выехать на Степвэе на неровный проселок и от рассогласованности не остается и следа. По колдобинам можно мчать на всех парах. X-Ray Cross в тех же условиях ни чуть не хуже, а вот Rio X-Line отстает. Из-за меньшего дорожного просвета и внушительного переднего свеса за рулем Kia приходится тщательнее выбирать маршруты, а иногда и искать пути объезда.

Запчасти ВАЗ в Самаре по низким ценам

Свою деятельность на рынке реализации запчастей к автомобилям ВАЗ компания «АВТОЛЮКС» начала в 1997 году. Изначально фирма входила в состав крупного предприятия, специализирующегося на оптовых поставках автокомплектующих.

Сегодня же магазин автозапчастей «АВТОЛЮКС» оправданно считается одним из лидеров на самарском рынке запчастей ВАЗ, а наш ассортимент насчитывает около 9000 различных наименований для автомобилей ЛАДА. Кроме того, мы следим за всеми тенденциями и регулярно пополняем наш каталог новыми позициями. Предлагаемая продукция обладает сертификатами качества, предоставляется гарантия.

Наши сотрудники обладают большим опытом и могут помочь не только в подборе необходимой детали, но и дать дельный совет в ремонте вашей LADA. Также расскажем, чем отличаются детали разных заводов- производителей, предоставляя варианты разных ценовых категорий. Детали двигателя и трансмиссии, детали ходовой части и рулевого управления, системы впрыска и системы газораспределения, электрооборудование, детали кузова и салона, автостекла, расходные материалы, масла, различная автохимия, аккумуляторы, автокрепеж, инструмент и приспособления для ремонта, полезные аксессуары для Вашего автомобиля - все это доступно в «АВТОЛЮКС» в широком ассортименте.

Автозапчасти ВАЗ являются основной специализацией нашей компании и мы по-настоящему заботимся о своей репутации. Поэтому в ассортимент магазина запчастей включена продукция только тех производителей, которые зарекомендовали себя как производители товаров стабильно высокого качества.

При заказе товаров «АВТОЛЮКС» не использует "лишних" посредников. Именно поэтому мы предлагаем самые демократичные и доступные цены на автозапчасти ВАЗ в Самаре.

На настоящий момент с магазином запчастей «АВТОЛЮКС» сотрудничает множество автомобильных предприятий, что, на наш взгляд, является лучшим подтверждением компетентности.

Магазин автозапчастей «АВТОЛЮКС» ценит каждого своего покупателя и старается соответствовать его потребностям, будь то крупный оптовый клиент или обычный покупатель.

Мы будем рады видеть Вас среди наших клиентов!

С уважением, коллектив магазина АВТОЛЮКС

Автомобили LADA в лизинг - СОАО Минск-Лада

СОАО «Минск-Лада» предлагает автомобили LADA в лизинг от своих лизинговых партнеров. Данное предложение будет актуально для тех, кто хочет получить в собственность транспортное средство с небольшой предоплатой. Все, что от вас требуется, - это собрать минимальный пакет документов и передать их в выбранную лизинговую компанию. При совершении сделки с использованием одной из ниже перечисленных лизинговых программ автомобили приобретаются по стандартной цене, указанной в прайс-листе, скидки не действуют.

ООО "Интеллект-Лизинг"


СПЕЦИАЛЬНЫЕ ПРОГРАММЫ ЛИЗИНГА ДЛЯ ЮРИДИЧЕСКИХ ЛИЦ

Аванс
Валюта Ставка
удорожания
Срок
лизинга

20-40% BYN 0,5% 1 год
20-40% BYN 1,5% 2 года
20-40% BYN 3,8% 3 года
СПЕЦИАЛЬНЫЕ ПРОГРАММЫ ЛИЗИНГА ДЛЯ ФИЗИЧЕСКИХ ЛИЦ
Аванс
Валюта Ставка
удорожания
Срок
лизинга

20-40% BYN от 6% 3-5 лет
20-40% USD
от 0,41% 2-5 лет
40% USD
от 2,1% 4-5 лет

Необходимо оформление страховки КАСКО. Более подробную информацию можно уточнить на сайте лизинговой компании.

ООО "Активлизинг"

СПЕЦИАЛЬНЫЕ ПРОГРАММЫ ЛИЗИНГА ДЛЯ ЮРИДИЧЕСКИХ ЛИЦ

Аванс
Валюта Ставка
удорожания
Срок
лизинга

20% BYN 12,03% 48 месяцев
25% BYN 10,82% 36 месяцев
30% BYN 9,28% 24 месяца
35% BYN 6,47% 12 месяцев
20% USD 4,25% 84 месяца
40% USD 0,001% 18 месяцев

ООО "Актив-Рент"
СПЕЦИАЛЬНЫЕ ПРОГРАММЫ ЛИЗИНГА ДЛЯ ФИЗИЧЕСКИХ ЛИЦ

Аванс
Валюта Ставка
удорожания
Срок
лизинга

30% BYN 5,89% 24 месяца
30% BYN 6,91% 36 месяцев
20% BYN 8,73% 48 месяцев
25% BYN 4,12% 12 месяцев
20% USD 3,49% 84 месяца
40% USD 0,001% 18 месяцев

Более подробную информацию можно уточнить на сайте лизинговой компании.

ЗАО "МТБанк"

СПЕЦИАЛЬНЫЕ ПРОГРАММЫ ЛИЗИНГА ДЛЯ ЮРИДИЧЕСКИХ ЛИЦ

Аванс
Валюта Лизинговая
ставка
Срок
лизинга

20-30% BYN 0,0001% 13 месяцев
20% BYN 5% 18 месяцев
30% BYN 3% 18 месяцев
40% BYN 0,001% 18 месяцев
20% BYN 9% 24 месяца
50% BYN 0,0001% 24 месяца
20% BYN 14% 36 месяцев
20% BYN 17% 48 месяцев

Необходимо оформление страховки КАСКО. Более подробную информацию можно уточнить на сайте лизинговой компании.


ООО "А-Лизинг"

СПЕЦИАЛЬНЫЕ ПРОГРАММЫ ЛИЗИНГА ДЛЯ ЮРИДИЧЕСКИХ И ФИЗИЧЕСКИХ ЛИЦ

Аванс
Валюта Лизинговая
ставка
Срок
лизинга

от 20% USD / EUR 0,01% 1 год
от 40% USD / EUR
0,01% 2 года
от 50% USD / EUR
3% 3 года
от 30% USD / EUR
7,5% 3 года
от 30% USD / EUR
9,5% 5 лет

Необходимо оформление страховки КАСКО. Более подробную информацию можно уточнить на сайте лизинговой компании.

СООО "Ресо-БелЛизинг"

СПЕЦИАЛЬНЫЕ ПРОГРАММЫ ЛИЗИНГА ДЛЯ ЮРИДИЧЕСКИХ ЛИЦ

Вариант 1

  • Аванс 40% от стоимости авто
  • Ставка удорожания 0,01% в год
  • Срок лизинга - 1 год
  • Валюта лизинга - EUR, USD
Вариант 2
  • Без аванса
  • Срок лизинга - 2 года
  • Валюта лизинга - EUR, USD, RUB
Более подробную информацию можно уточнить на сайте лизинговой компании.

ООО «Автопромлизинг»

СПЕЦИАЛЬНАЯ ПРОГРАММА ЛИЗИНГА НА АВТОМОБИЛИ LADA

  • Аванс от 20%
  • Валюта - BYN
  • Срок лизинга от 1 года до 4 лет
  • Выгодное АВТОКАСКО

Более подробную информацию можно уточнить на сайте лизинговой компании.

БЛІЦ АВТО автоцентр - Офіційний дилер KIA, Chery, Lada

«Бліц Авто» — один з лідерів на автомобільному ринку України і є автосалоном і сервісним центром мережі Корпорації «УкрАВТО».
Основні види діяльності:
— продажу автомобілів.
— гарантійне і післягарантійне технічне обслуговування і ремонт автомобілів.
— установка додаткового і газобалонного обладнання зі збереженням заводської гарантії на автомобіль.
— продаж запасних частин і аксесуарів.

Продаж автомобілів:

У сучасному просторому автосалоні Бліц Авто широко представлена продукція таких брендів як KIA, Chery, Lada.
Відвідувачі можуть отримати інформацію про автомобілі, отримати кваліфіковану консультацію, здійснити тест-драйв бажаного автомобіля, а також оформити замовлення.
Ви можете здійснити вибір комплектації обраної моделі і кольору зі складу підприємства чи дистриб’юторської мережі.
З метою задоволення потреб покупців на підприємстві діють різні форми продажу автомобілів під замовлення, в кредит, лізинг.
Модельний ряд в автосалоні Бліц Авто представлений такими марками і моделями:

KIA: Picanto, Rio, Rio X-Line, Stonic, Ceed, Soul, Niro, Sportage, Sorento. 

Chery: Tiggo 2, Tiggo 3, Tiggo 4, Tiggo 5, Tiggo 7, Tiggo 8.

Lada: Granta New, 4x4 Niva, Largus, Vesta, X-Ray.

Кваліфіковані консультанти, які допоможуть Вам правильно вибрати автомобіль, виходячи з Ваших завдань і вимог до машини.

Кредитування:

Фахівці кредитного відділу допоможуть Вам вибрати найбільш зручну схему покупки автомобіля в кредит. Система «Експрес Кредит» пропонує не тільки привабливі умови автокредитування, але і зручне оформлення.

Робота з корпоративними клієнтами:

це — один з найважливіших напрямків діяльності АФ «Бліц Авто». Ми розробили спеціальні умови продажу і післяпродажного обслуговування автомобілів. Враховані побажання і потреби наших корпоративних клієнтів.
Умови передбачають гнучку систему знижок при покупці автомобілів, технічному обслуговуванні, ремонті, придбанні запасних частин і аксесуарів:

  • спеціальні умови обслуговування.
  • попередній запис на зручний для Клієнта час.
  • першочерговість виконання робіт.

Наші Клієнти отримують не тільки автомобілі, але і ряд послуг, починаючи з оптимального вибору авто, закінчуючи професійним сервісним обслуговуванням і гарантією на всі види виконаних робіт і встановлені при цьому запасні частини.

Ремонт та Обслуговування автомобілів:

З першого року роботи «Бліц Авто» асоціюється у покупців не тільки як «мультибрендовий» салон, але і сервісна станція з великими можливостями. Було встановлено сучасне сервісне обладнання. Купуючи автомобіль, Ви можете бути впевнені в якості гарантійного і післягарантійного обслуговування.

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или уточнить у системного администратора.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файлах cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Динамическая настройка FRET в биосенсоре зеленого флуоресцентного белка

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Кристаллическая структура Twitch-2B

Мы расшифровали структуру с разрешением 2,5 Å (таблица S1A). Асимметричный блок состоит из двух мономеров (рис. S1A). Они представляют идентичные конформации отдельных доменов [среднеквадратичные отклонения (RMSDs) ниже 0,2 Å] и несколько иную междоменную конформацию (RMSD 0,992 Å), но, по-видимому, не собираются как симметричный гомодимер.Их интерфейс (рис. S1B), покрывающий 630 Å 2 ( 11 ), на самом деле значительно меньше, чем интерфейс стабильного димера ( 12 ). Кроме того, данные малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР) показывают, что в растворе Twitch-2B является мономерным (рис. S2). Поэтому мы сосредоточим наше описание здесь на мономере A. Кристаллическая структура показывает расположение донора и акцептора относительно минимального кальций-связывающего домена TnC, а также структуру оптимизированных линкеров (рис.1). Структура кальций-связывающего домена очень похожа на C-концевой глобулярный домен куриного TnC (RMSD 0,84 Å) ( 13 ), на структуру ЯМР, решенную ранее ( 8 ), и на структуру кальмодулина. (RMSD 1,08 Å) ( 14 ). Главные оси двух бочкообразных β-доменов флуоресцентного белка ориентированы почти под перпендикулярным углом друг к другу. Стволы β практически не контактируют друг с другом (рис. 2A) с очень маленькой общей границей раздела (150 Å 2 ).Интерфейсы минимального кальций-связывающего домена с mCerulean3 и cpVenus cd также относительно малы, покрывая только 257 и 351 Å 2 соответственно (см. Ниже). Взаимодействия в основном носят гидрофильный характер (рис. 2А).

Рис. 2 Структурные детали Twitch-2B.

( A ) Полярные взаимодействия между остатками минимального домена TnC, mCerulean3, и cpVenus cd изображены пунктирными линиями. Остатки показаны в виде палочек.( B ) Полярные взаимодействия, опосредованные остатками (показаны в виде стержней) от линкеров между mCerulean3 и кальций-связывающим доменом (у лосося), а также взаимодействия между cpVenus cd и кальций-связывающим доменом (пурпурный) . ( C ) Гидрофобные взаимодействия между остатками (показаны в виде стержней) линкеров между mCerulean3 и кальций-связывающим доменом (у лосося), а также линкером между cpVenus cd и кальций-связывающим доменом (пурпурный) с остатками (серым цветом) из ядра минимального домена TnC.( D и E ) Крупный план области вокруг N532 Twitch-2B и мутанта N532F Twitch-2B (Twitch-6).

Линкер между mCerulean3 и кальций-связывающим доменом (V 232 ADA) образует спираль 3 10 , которая прочно удерживается на месте водородными связями основной цепи от V232 и S236 в mCerulean3 до E301 и E239 кальция. -связывающий домен (рис. 2Б). Далее линкер между кальций-связывающим доменом и cpVenus cd (P 305 IYPEL) образует полтора α-спиральных витка (рис.2, B и C), карбонилы основной цепи E309 и L310 образуют водородные связи с боковой цепью R551 (рис. 2B) cpVenus cd . Боковая цепь E309 также образует водородную связь с Y152 mCerulean3, плотно связывая три домена вместе. Остатки I306, Y307 и L310 этой короткой спирали участвуют в сети гидрофобных контактов (рис. 2C). Очевидно, что скрининг оптимальных линкеров ( 8 ) привел к последовательностям со спиральными особенностями, очень хорошо интегрирующимися в структуру минимального TnC-домена, в то время как эти линкеры удерживают на месте донорный и акцепторный домены в основном за счет полярных взаимодействий.

Расчет эффективности FRET на основе структуры

Структура предоставила важную информацию для расчетов FRET. Во-первых, расстояние между центрами масс флуорофоров составляет 3,65 нм (рис. 1B). Затем внутри структуры флуорофоры mCerulean3 и cpVenus cd выровнены в конфигурации «голова к голове». Таким образом, мы могли точно определить относительную ориентацию дипольных моментов флуорофоров (рис. 1C; см. Материалы и методы), которые доступны из расчетов теории функционала плотности ( 15 ).Используя эту объединенную информацию, мы рассчитали фактор ориентации κ 2 , равный 1,98 (уравнение 1; Материалы и методы), и расстояние Ферстера, R 0 , 6,9 нм для mCerulean3 / cpVenus cd Пара FRET (уравнение 3; материалы и методы). С этими параметрами, используя уравнение Фёрстера, E = R06 / (R06 + r6), теоретическая эффективность FRET, E , Twitch-2B была определена как 0,98. Эффективность FRET, экспериментально определенная с помощью декушинга донора, равна 0.78 (рис. S3A), что значительно ниже, чем полученное из кристаллической структуры.

Два мономера Twitch-2B в асимметричном блоке (рис. S1A) не только имеют очень схожую конформацию (RMSD основной цепи 0,992 Å), но также образуют очень похожие контакты упаковки кристаллов (рис. S1C). Таким образом, мы делаем вывод, что ориентация доменов в мономере сама по себе не ограничивается кристаллической упаковкой, а в основном внутримономерными взаимодействиями, описанными выше (рис. 2А), и, скорее всего, выбрана из пула уже существующих конформаций в растворе.Поскольку междоменные интерфейсы в мономере Twitch-2B относительно малы (рис. 2A), высокая гибкость решения может быть причиной наблюдаемого снижения эффективности FRET. Чтобы исследовать эту гипотезу, мы затем обратили внимание на передовые методы ЯМР.

ЯМР-исследование динамики биосенсора

Чтобы получить представление о возможной динамике, мы использовали парамагнитный ЯМР ( 16 ) с образцом Twitch-2B, где два сайта связывания кальция TnC были загружены диспрозием (Dy).Анизотропная магнитная восприимчивость комплекса TnC-Dy 2 индуцирует тензор парамагнитного выравнивания, который может быть определен из структуры ( 17 ) (см. Материалы и методы). Мы использовали спектрометры на частотах 900 МГц и 1,1 ГГц, поскольку тензор юстировки зависит от магнитного поля квадратично. Если данный флуоресцентный белок является жестким по отношению к TnC, то тензор выравнивания, который он испытывает, идентичен TnC. Однако, если флуоресцентный белок является динамичным по отношению к TnC, то это движение уменьшит тензор выравнивания первого ( 16 , 18 ).Это позволяет количественно оценить динамику флуоресцентных белков по отношению к TnC. В то время как диполярные связи усредняются в изотропном растворе из-за случайного изотропного переворачивания, парамагнитно-индуцированные тензоры выравнивания приводят к анизотропному распределению ориентации TnC и, следовательно, прикрепленных зеленых флуоресцентных белков в растворе, что приводит к неполному усреднению диполярного муфты, позволяющие наблюдать остаточные диполярные связи (RDC). Мы определили RDC метильных групп парамагнитно выровненного Twitch-2B ( 19 ) (см. Материалы и методы).Наблюдаемый диапазон RDC достаточен для измерения размера тензора выравнивания ( 20 ), так что отнесение метильных групп не было необходимым.

Мы обнаружили, что диапазон значений RDC и, таким образом, тензор выравнивания, испытываемый флуоресцентными белками, в 10 раз меньше, чем рассчитанные на основе жесткой рентгеновской структуры (рис. 3; см. Материалы и методы). Таким образом, динамика должна быть причиной несоответствия между расчетной и экспериментальной эффективностями FRET.Кристаллическая структура может быть только частью динамического конформационного ансамбля в растворе.

Рис. 3 Гистограммы парамагнитных данных RDC.

Прогнозирование RDC метильных групп в двух доменах флуоресцентного белка и TnC с использованием рентгеновской структуры (выделено фиолетовым цветом). Тензор выравнивания, индуцированный двумя ионами диспрозия, связанными с TnC, является результатом трансляции тензора, полученного из кальмодулина (см. Материалы и методы). Экспериментальные КРД парамагнитного ЯМР Twitch-2B (зеленый) и Twitch-6 (пурпурный).Дальность действия сокращена в 10 и 5 раз для Twitch-2B и Twitch-6 соответственно.

Структурный дизайн мутанта с повышенной эффективностью FRET

Предполагая структурную целостность отдельных доменов, мы предположили, что линкерные области являются стержнем этой динамики. На границах раздела между доменом TnC и донорным и акцепторным доменами преобладают полярные взаимодействия (рис. 2А). Мы предположили, что замена этих взаимодействий гидрофобными контактами сделает линкеры жесткими и увеличит экспериментальную эффективность FRET.С этой целью мы разработали мутацию N532F (рис. 2, D и E) на поверхности cpVenus cd , создавая новое взаимодействие с F249 кальций-связывающего домена (рис. 2D). Как и ожидалось, эта мутация вызвала существенное увеличение максимального изменения отношения FRET с 800 до 1100% in vitro (рис. S4). В кристаллической структуре этого мутанта (Twitch-6; таблица S2) боковая цепь F532 действительно связывается в гидрофобный карман, образованный боковыми цепями F249, Asp262 и Y338 (рис. 2E).В остальном структуры Twitch-6 и Twitch-2B очень похожи (RMSD 0,25 Å), что приводит к почти идентичной теоретической эффективности FRET (см. Дополнительные материалы). Благодаря этой конструкции экспериментальная эффективность FRET Twitch-6 увеличилась до 0,90, с 0,78 для Twitch-2B (рис. S3B), а диапазон RDC, измеренных с Twitch-6, удвоился по сравнению с Twitch-2B (рис. 3). . Это указывает на сужение интерфейса между доменом TnC и cpVenus cd , и, таким образом, снижение динамики между доменами является причиной увеличения FRET.

Конформационные ансамбли в решении

Определив динамику как причину снижения эффективности FRET в Twitch-2B в решении, мы хотели получить представление о конформационном пространстве, возникающем в результате этой динамики. Для этой цели мы выбрали конформационные ансамбли, исследующие динамику скелета исключительно на динамических линкерных областях между доменами флуоресцентного белка и доменом TnC (см. Материалы и методы), оценивая более 1 миллиона шестичленных ансамблей против наблюдаемых RDC и эффективности FRET (Таблица 1, рис.4, а также материалы и методы). Среди всех возможных ансамблей мы выбрали тот, который лучше всего воспроизводит как экспериментальную эффективность FRET, так и диапазон RDC (таблица 1). Этот ансамбль полностью объясняет, как гибкость неупорядоченных остатков линкерных областей приводит к наблюдаемому снижению эффективности FRET и диапазона RDC.

Таблица 1 Результаты выбора ансамбля. Рис. 4 Ансамбли белков Twitch, согласующиеся с измеренными эффективностями RDC и FRET.

Ансамбли для Twitch-2B (слева) и Twitch-6 (справа) содержат по шесть структур каждый, причем самые большие отклоняющиеся структуры показаны зеленым и красным.Состояния, не являющиеся этими крайними конформациями, прозрачны.

Влияние на усовершенствованную конструкцию датчика FRET

Таким образом, мы получили кристаллическую структуру флуоресцентного кальциевого биосенсора Twitch-2B, и вместе с динамикой линкеров, определенной с помощью парамагнитного ЯМР, мы количественно оценили эффективность FRET. Поскольку динамика ограничивала эффективность FRET, мы успешно сконструировали ригидифицированный мутант с увеличенным FRET. Таким образом, структурные и динамические характеристики ратиометрических датчиков FRET обеспечили принципы проектирования, которые могут быть применимы к другим системам, в которых эффекты FRET используются для восприятия сигналов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клонирование, экспрессия и очистка Twitch-2B и Twitch-6

Конструкция Twitch-2B была описана ранее ( 8 ). Для настоящего исследования кодирующую последовательность трехдоменного слитого белка клонировали в модифицированный вектор pET16b, кодирующий слитый белок с N-концевой меткой His 7 и расщепляющей последовательностью, распознающей вирус травления табака (TEV). Мутант Twitch-2B N532F (Twitch-6) был создан с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза QuikChange (Agilent).Экспрессионные конструкции pET16bTEV-Twitch-2B и pET16bTEV-Twitch-6 трансформировали в штамм Escherichia coli BL21 (DE3). Экспрессию белка проводили при 303 К индукцией 0,5 мМ изопропил-β-d-1-тиогалактопиранозидом. Клетки собирали через 7 часов после индукции. Меченный селенометионином белок Twitch-2B был сверхэкспрессирован в метионин-ауксотрофном штамме В834 E. coli в минимальной среде с добавлением (+) - l-селенометионина в соответствии с группой по экспрессии белка EMBL (Европейская лаборатория молекулярной биологии) (www. embl.de).

Осадок клеток из 1 литра встряхиваемой культуры ресуспендировали в 60 мл лизисного буфера [20 мМ трис-HCl (pH 7,9), 300 мМ NaCl, 20 мМ имидазол, 0,5 мМ фенилметилсульфонилфторид, с одной таблеткой полного количества ЭДТА- свободных ингибиторов (Roche) на 100 мл лизисного буфера]. Клетки лизировали ультразвуком с последующим центрифугированием при 27000 g, и 277 К. Из супернатанта рекомбинантный белок очищали с помощью аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом на 3 мл агарозной смолы Ni-нитрилотриуксусной кислоты (NTA) (Qiagen).Тег слияния His 7 отщепляли протеазой TEV и удаляли инкубацией с 1 мл Ni-NTA агарозной смолы. Белок диализовали против 20 мМ трис (pH 7,0) и 150 мМ NaCl. После доведения концентрации сульфата аммония в растворе белка до 1 М, белок дополнительно очищали хроматографией на гидрофобном взаимодействии на колонке с фенилсефарозой (GE Healthcare) объемом 10 мл. Белок элюировали из этой колонки градиентом 50 мл от 1 до 0 М сульфата аммония. Фракции, содержащие белок, объединяли и концентрировали до объема 2,5 мл с помощью концентратора для ультрафильтрации с MWCO 30 кДа (отсечение молекулярной массы) (Vivascience). Наконец, белок очищали эксклюзионной хроматографией на гель-фильтрационной колонке HiLoad 26/60 Superdex 200 пг. Пиковые фракции объединяли, диализовали против 20 мМ трис-HCl (pH 7,0), 100 мМ NaCl и 5 мМ CaCl 2 , и концентрацию белка доводили до 20 мг / мл.

Флуоресцентная спектроскопия

Для спектроскопии рекомбинантного Twitch-2B in vitro белок был очищен от E.coli с использованием смолы Ni-NTA, как описано ( 6 ). Спектроскопию выполняли на спектрофотометре Cary Eclipse (Varian). Донорское расщепление Twitch-2B проводили путем переваривания Twitch-2B в связанном с кальцием состоянии в течение ночи при комнатной температуре с химотрипсином (70 Ед / мл; Sigma-Aldrich) во время записи FRET. Небольшое оставшееся излучение cpVenus cd после переваривания химотрипсина было избирательно фотообесцвечено (5 мин) с помощью массива из шести светодиодов Luxeon Lumiled с пиком на длине волны 530 нм, с общей рассеиваемой мощностью 14. 7 Вт и 870 люмен. Для защиты mCerulean3 от обесцвечивания использовали LP (длиннопроходный) фильтр с длиной волны 500 нм. Связанный с кальцием Twitch-6 был очень устойчив к перевариванию протеазой. Следовательно, EGTA (конечная концентрация 5 мМ) добавляли во время переваривания химотрипсина, чтобы получить спектр деквенированного mCerulean3.

Кристаллизация, сбор данных и определение структуры

Кристаллы Twitch-2B и Twitch-6 были получены путем диффузионного смешивания паров 1 мкл раствора белка с 1 мкл раствора для лунок [0.2 M Na-формиат (pH 7,0), 5 мМ CaCl 2 и от 18 до 20% полиэтиленгликоля 3350]. Кристаллы были подвергнуты криозащите, перенеся их в лунку с добавлением 16-18% глицерина на 1 мин и быстро охладив, погрузив в жидкий азот.

Сбор данных был выполнен в PXII, SLS, Швейцария, с использованием детектора PILATUS 6M (Dectris). Собственные данные собирали при 100 К на длине волны 1 Å. Данные по производному селенометионина были измерены при 0,98 Å. Все данные были обработаны с помощью программного обеспечения для детектора рентгеновского излучения (XDS) ( 21 ) и масштабированы с помощью SADABS (Bruker AXS).Определение пространственной группы и статистический анализ выполняли с использованием XPREP (Bruker AXS). Фазирование выполнялось с помощью AutoSol ( 22 ).

Первоначальная модель была построена с помощью AutoBuild и дважды доработана с помощью phenix.refine ( 23 ) с промежуточным созданием модели вручную с помощью Coot ( 24 ). Окончательная модель была получена путем комбинированного ручного отслеживания (Coot) и уточнения с использованием Refmac5 ( 25 ). На графике Рамачандрана 96,69% ​​остатков располагались в предпочтительной области 2.72% в разрешенной области и 0,58% остатков были выбросами. Кристаллическая структура Twitch-6 была решена с помощью PHASER ( 26 ) с использованием PDB (Protein Data Bank) запись 6GEL в качестве модели поиска. Построение и уточнение модели выполнялись, как описано для Twitch-2B. Для этого мутанта 96,68% остатков попали в предпочтительную область графика Рамачандрана, 2,83% попали в разрешенную область и 0,49% были выбросами.

Расчеты FRET

Фактор ориентации κ 2 может быть извлечен из структурной информации следующим образом: κ2 = (cos θT - 3 cos θD cos θA) 2 (1) где θ T - угол между эмиссионным переходом диполь донора и диполь перехода поглощения акцептора; θ D и θ A - углы между этими диполями и вектором r , соединяющим донорный и акцепторный флуорофоры ( 27 ).Ориентация дипольных моментов перехода относительно вектора связи C O (ω) в градусах ωD = 73 ° ωA = 76 ° была взята из Ansbacher et al. ( 15 ), а угловые параметры были извлечены из кристаллографических координат в угловых единицах θT = 152,95 ° θD = 149,17 ° θA = 26,79 °

Подробные расчеты объяснены в файле данных S1. Интеграл перекрытия J (λ) был рассчитан из экспериментальных спектров поглощения и излучения изолированных доменов cpVenus и mCerulean3 соответственно (рис. S5) со сценарием Python, включенным в качестве дополнительной информации. J (λ) было определено как 2,052 × 10 15 M −1 см −1 нм 4 , как следует: J (λ) = ∫0∞FD (λ) εA (λ) λ4dλ = ∫0∞FD (λ) εA (λ) λ4dλ∫0∞FD (λ) dλ (2) где F D (λ) - нормированная интенсивность флуоресценции донора в диапазоне длин волн от λ до λ + Δλ. ε A (λ) - коэффициент экстинкции акцептора при λ.

Расстояние Ферстера, R 0 , может быть вычислено из ранее полученных экспериментальных параметров R0 = 0.211 (κ2n − 4QDJ (λ)) 1/6 (3) где Q D (0,87) - квантовый выход донора в отсутствие акцептора ( 4 ) и n , (1,33) показатель преломления водной среды.

Наконец, эффективность передачи энергии, E , может быть рассчитана как отношение скорости передачи к общей скорости распада донора в присутствии акцептора E = R06R06 + r6 (4)

После этой процедуры, Эффективность FRET была определена как E = 0. 979, из кристаллографической структуры Twitch-2B. Эквивалентный расчет, выполненный со структурой мутанта Twitch-6, дает E = 0,983 (см. Файлы данных S1 и S2).

ЯМР-спектроскопия

Мы экспрессировали белки Twitch-2B и Twitch-6 в минимальной среде Toronto, приготовленной из 100% D 2 O и пердейтерированной d-глюкозы и дополненной предшественниками аминокислот α-кетомасляной кислотой (метил-13C , 3,3-D2) и α-кетоизовалериановой кислоты (3-метил-13C, 3,4,4,4-D4), таким образом, селективно мечение атомами 13 C и 1 H только метильных групп остатки валина, лейцина и изолейцина, сохраняя при этом остальные атомы C как 12 C и протоны как 2 H ( 19 ).

Сначала были получены спектры изотропных образцов в буфере A [20 мМ Mops (pH 7,0), 100 мМ NaCl и 5 мМ CaCl 2 в 100% D 2 O]. Затем белки диализовали против буфера В [20 мМ Mops (pH 7,0), 100 мМ NaCl и 10 мМ EDTA] с последующим диализом против буфера C [20 мМ Mops (pH 7,0) и 100 мМ NaCl] и, наконец, заменяли на буфер C, приготовленный на 100% D 2 O, содержащий три эквивалента диспрозия, перед измерениями ЯМР. Концентрация белка в образцах была примерно 0.5 мМ.

Образцы были протестированы с помощью экспериментов с метил-TROSY ( 19 , 28 ) (рис. S7) на частотах 900 МГц и 1,1 ГГц, а связи J и J + RDC были определены с использованием J -модулированного Эксперимент с метил-TROSY ( 29 ), изображенный на рис. S6 в виде матриц 2048 × 128 комплексных точек данных с 96 переходными процессами на ( t 1 ) приращение. Общие использованные задержки модуляции J были следующими: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 и 20 мс (рис.S8). ЯМР-эксперименты проводились с использованием 5-мм TCI (криозонда тройного резонанса с инверсным детектированием) на спектрометре 900 МГц и 3-мм криозонда TCI на спектрометре 1,1 ГГц, оба снабжены консолями NEO (Bruker). Интенсивности (максимальная амплитуда) сигналов были извлечены с помощью CARA (компьютерное определение резонанса) ( 30 ) в экспериментах с обработкой NMRPipe ( 31 ) и проанализированы с помощью скриптов Python (рис. S8), следуя Pederson et al. ( 29 ).

Вычисление парамагнитного тензора

Мы взяли парамагнитный тензор из комплекса кальмодулин-IQ, связанный с диспрозием, из ( 18 ) и рассчитали полный тензор дважды занятого кальций-связывающего домена TnC. Сайт связывания кальция 1 TnC перекрывается с сайтом связывания лантанидов кальмодулина (CaM N60D). Мы повернули матрицу выравнивания с сайта связывания кальция из CaM на второй сайт связывания кальция TnC и добавили его к тензору сайта связывания кальция 1, таким образом получив общий тензор TnC.Затем этот тензор использовался для расчета RDC из парамагнитных белков Twitch ACaM = (1,05 10−31−1,92 10−322,04 10−31−1,92 10−32−1,22 10−316,46 10−322,04 10−316,46 10−321,67 10−32 ) ATwitch = (1,46 10-318,39 10-323,46 10-318,39 10-32-1,06 10-312,26 10-323,46 10-312,26 10-32-3,92 10-32)

Тензоры даны в м 3 M −1 .

Генерация ансамбля

Сначала мы индивидуально смоделировали все возможные двугранные углы основной цепи (ϕ и ψ; выборка с шагом 60 °) линкерных остатков (от Arg 229 до Gln 231 для mCerulean3 и Met 311 до Gly 313 для cpVenus), что не привело к стерическому конфликту между одним из модифицированных доменов флуоресцентного белка и доменом TnC. Каждую из двух линкерных областей моделировали независимо. Из всех возможных комбинаций ϕ, ψ (117 649) вращение mCerulean3 привело к 477 возможным конформациям, в то время как cpVenus допустил 84 конформации, обеспечивая в целом 40 086 возможных конформаций.

Во-вторых, мы случайным образом объединили возможные структуры для mCerulean-TnC и TnC-cpVenus в ансамбли из шести членов. Мы произвольно отобрали 1 миллион шестичленных ансамблей из 40 068 возможных ϕ, ψ комбинаций линкеров между mCerulean и TnC и между TnC и cpVenus, чтобы гарантировать правильное исследование конформационного пространства Twitch.

В-третьих, мы вычислили диапазон RDC (используя тензор, полученный, как описано выше) и FRET ансамблей и сравнили их с экспериментальными значениями, определив коэффициент качества ансамбля Qens = ∑i = 1i = 6 (RDCi − RDCeRDCe) 2+ (FRETi − FRETeFRETe) 2, где RDC i - диапазоны распределения, субиндекс e указывает экспериментальное значение, а i указывает значение из члена ансамбля. Такое значение добротности отличается от 0, если совпадения предсказанных откликов RDC и FRET от ансамбля отклоняются от экспериментальных данных, и 0 в случае полного совпадения.Наконец, ансамбли были отсортированы по их Q Ens , и был выбран самый низкий из них.

Измерения SAXS

Данные SAXS были собраны на линии пучка BM29 Европейского центра синхротронного излучения (ESRF) в Гренобле, Франция, с использованием автоматического устройства смены образцов ( 32 ). Белок диализовали либо против буфера A [20 мМ Mops (pH 7,0), 100 мМ NaCl и 5 мМ CaCl 2 ] (связанное с кальцием состояние), либо против буфера B [20 мМ Mops (pH 7,0), 100 мМ NaCl и 10 мМ ЭДТА] (без кальция).Перед измерением белок центрифугировали для удаления более крупных частиц. Образцы измеряли при концентрациях 2,5, 10 и 20 мг / мл. Буфер для диализа использовали для коррекции эталонного буфера. Данные собирали при 293 К, используя длину волны 0,995 Å и расстояние от образца до детектора 2,867 м. Загружали сто микролитров каждой концентрации образца, собирали и объединяли 10 кадров. Образцы постоянно подавались в кювету, чтобы минимизировать эффекты радиационного повреждения.Изображения детектора были объединены и преобразованы в одномерные кривые рассеяния, а вклады буфера в рассеяние были вычтены с использованием программного обеспечения BsxCuBE. Дальнейшая обработка данных проводилась автоматически с использованием онлайн-конвейера EDNA ( 33 ) для оценки качества образца и эффектов радиационного повреждения. Агрегации белков или радиационного повреждения не наблюдалось.

Данные были дополнительно проанализированы с помощью программного пакета ATSAS ( 34 ). Вкратце, первичная обработка и анализ данных проводились с использованием программ PRIMUS ( 35 ) и GNOM ( 36 ).

Теоретическое рассеяние от кристаллической структуры было рассчитано с использованием программы CRYSOL ( 37 ) (рис. S2), а молекулярные массы рассчитаны с использованием образца бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта.

Благодарности: Мы благодарим сотрудников компании SLS, X10SA за поддержку при сборе рентгеновских данных и ESRF, BM29 за поддержку при сборе данных SAXS. Мы благодарим M. Paulat, C. Schwiegk и A. Moritz за техническую помощь в производстве белка и K.Оверкамп для масс-спектров электроспрея. С.Б. благодарит T. Gruene и G. Sheldrick за советы по уточнению кристаллической структуры и структурному анализу. К.Г. и П.Т.-М. поблагодарить R. Kuemmerle (Bruker Biospin) за измерения ЯМР на частоте 1,1 ГГц. Финансирование: Эта работа была поддержана Обществом Макса Планка и DFG SFB 870 (O.G.). П.Т.-М. была поддержана докторской стипендией Гумбольдта. Вклад авторов: P.T.-M. выполнен ЯМР. П.Т.-М. и К.Г. разработал парамагнитный метод ЯМР.П.Т.-М. рассчитаны структурные ансамбли. П.Т.-М. и С. выполнены измерения SAXS. К.Г. рассчитал FRET по рентгеновским структурам. T.T. и O.G. определили экспериментальные эффективности FRET. С.Б. кристаллизовал Twitch-2B и Twitch-6 и решил кристаллические структуры. Все авторы написали рукопись. С.Б. разработал проект. Конкурирующие интересы: Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов. Доступность данных и материалов: Структуры депонированы с кодом 6GEL для биосенсора Twitch-2B и 6GEZ для мутанта Twitch-2B N532F (Twitch-6).Все данные, необходимые для оценки выводов в статье, представлены в документе и / или дополнительных материалах. Дополнительные данные, относящиеся к этой статье, могут быть запрошены у авторов.

Разработка FRET позволяет визуализировать одиночные молекулы

Используя флуоресцентные маркеры, исследователи разработали резонансный перенос энергии Ферстера (FRET) для изображения сборки, функций и взаимодействий молекул.

Новый метод оптической визуализации был разработан исследователями, использующими Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET) для наблюдения за действующей единственной молекулой, в Научном колледже Университета Клемсона, США, в сотрудничестве с учеными из Университета Генриха Гейне в Германии.

Команда предполагает, что их метод, основанный на флуоресценции, может ускорить развитие области структурной биологии, помогая исследователям лучше понять, как молекулы собираются, функционируют и взаимодействуют, что, в свою очередь, может помочь в разработке лекарств на основе структуры.

Ученые использовали FRET для изучения лизоцима бактериофага Т4, который, по их словам, лежит в основе основных этапов реакции биомолекулярных машин (ферментов).

«Наши исследования FRET демонстрируют необходимость третьего функционального состояния в знаменитой кинетике Михаэлиса-Ментен», - сказал соавтор Клаус Зайдель, председатель Института молекулярной физической химии Университета Генриха Гейне.«Описание Михаэлиса-Ментен - одна из самых известных моделей кинетики ферментов».

Команда помогает создать базу данных, в которой их структурные модели аналогичных созданных биомолекулярных моделей на основе FRET могут быть сохранены и доступны другим ученым »

Центральным элементом этого инструмента визуализации является микроскоп на основе FRET, сложный и мощный машина, способная визуализировать биомолекулы размером всего несколько нанометров.

Чтобы наблюдать за работой биомолекул, команда поместила два флуоресцентных маркера на набор молекул, которые создали линейку на молекулярном уровне.Используя разные местоположения маркеров, команда собрала набор расстояний, которые описывают форму и форму наблюдаемой молекулы.

По сути, этот процесс генерировал набор точек данных, которые были обработаны с помощью вычислений, что позволило исследователям различить, как молекула выглядит и как она движется.

«Мы наблюдаем изменения в структуре, и поскольку наш сигнал зависит от времени, мы также можем получить представление о том, как молекула движется с течением времени», - сказал ведущий исследователь Уго Санабриа, доцент кафедры физики и астрономии в Клемсоне.

В исследовании Санабриа и его команда объединили микроскоп на основе FRET с молекулярным моделированием, чтобы изучить лизоцим, фермент, обнаруженный в слезах и слизи. Лизоцим разрушает защитные углеводные цепи, окружающие клеточную стенку бактерий. Ученые широко используют лизоцим для изучения структуры и функции белков, потому что это такой стабильный фермент.

«Мы можем отслеживать лизоцим бактериофага Т4, поскольку он обрабатывает свой субстрат почти на атомистическом уровне с беспрецедентным пространственным и временным разрешением», - сказал Санабриа.«Мы подняли область визуализации на совершенно новый уровень».

Новый оптический метод показал, что структура лизоцима отличается от ранее предполагавшейся. До сих пор ученые в основном определяли структуру белков, таких как лизоцим, в основном с помощью таких методов, как рентгеновская кристаллография, спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и криоэлектронная микроскопия.

«Долгое время эта молекула считалась молекулой с двумя состояниями из-за того, как она получает субстрат или клеточную стенку бактерий-мишеней», - сказал он.«Однако мы определили новое функциональное состояние».

Команда помогает создать базу данных, где их основанные на FRET структурные модели аналогичных биомолекулярных моделей могут быть сохранены и доступны другим ученым. Они также работают над разработкой рекомендаций по микроскопии FRET вместе с другими учеными FRET.

«Этот оптический метод можно использовать для изучения сворачивания и неправильного сворачивания белков или любой структурной организации биомолекул», - сказал Санабриа. «Его также можно использовать для скрининга и разработки лекарств, что требует знания того, как выглядит биомолекула, чтобы лекарство нацелилось на нее.

«Эта работа является важной вехой в определении структуры с использованием FRET для картирования короткоживущих функционально релевантных состояний ферментов», - заключил Зайдель.

Исследование было опубликовано в Nature Communications.

Введение в применение FRET в биологических экспериментах с одной молекулой

[1] Селвин П. Р., 2000, Возрождение резонансной передачи энергии флуоресценции., Nat. Struct. Биол., 7 (9), 730–734.
[2] Förster, V. Т., 1946, Energiewanderung und Fluoreszenz., Die Naturwissenschaften, 33 (6), 166–175.
[3] Страйер, Л., и Хогланд, Р. П., 1967, Передача энергии: спектроскопическая линейка, Proc. Natl. Акад. Sci. США, 58 (2), 719–726.
[4] Хаас, Э., Качальски-Кацир, Э., Стейнберг, И. З., 1978, Влияние ориентации донора и акцептора на вероятность передачи энергии с участием электронных переходов смешанной поляризации., Биохимия, 17 (23), 5064–5070.
[5] Траутман, Дж. К., Маклин, Дж. Дж., Брус, Л. Е., Бетциг, Э., 1994, Спектроскопия одиночных молекул в ближнем поле при комнатной температуре., Nature, 369, 40–42.
[6] Се, X. С., и Данн, Р. С., 1994, Исследование динамики отдельных молекул., Science, 265, 361–364.
[7] Эмброуз, У. П., Гудвин, П. М., Мартин, Дж. К., Келлер, Р. А., 1994, Детектирование одиночных молекул и фотохимия на поверхности с использованием оптического возбуждения в ближнем поле. , Phys. Rev. Lett., 72 (1), 160–163.
[8] Маклин, Дж. Дж., Траутман, Дж. К., Харрис, Т. Д., Брус, Л. Е., 1996, Построение изображений и спектроскопия с временным разрешением отдельных молекул на границе раздела., Science, 272, 255–258.
[9] Траутман Дж. К. и Маклин Дж. Дж., 1996, Спектроскопия одиночных молекул с временным разрешением с использованием оптики ближнего и дальнего поля, Chem. Phys., 205 (1-2), 221–229.
[10] Фунацу, Т., Харада, Ю., Токунага, М., Сайто, К., Янагида, Т., 1995, Визуализация отдельных флуоресцентных молекул и отдельных оборотов АТФ отдельными молекулами миозина в водном растворе., Nature, 374, 555–559.
[11] Sase, I., Miyata, H., Corrie, JET, Craik, JS, Kinosita, Jr., K., 1995, Визуализация отдельных флуорофоров на движущемся актине с помощью эпифлуоресцентного микроскопа в реальном времени . , Biophys. J., 69 (2), 212–218.
[12] Шмидт Т., Schuetz, G.J., Баумгартнер, W., Gruber, H.J., Schindler, H., 1995, Характеристика фотофизики и подвижности одиночных молекул в жидкой липидной мембране., J. Phys. Chem., 99 (49), 17662–17668.
[13] Диксон, Р.М., Норрис, Д.Дж., Ценг, Й.-Л., Мёрнер, В.Е., 1996, Трехмерное изображение одиночных молекул, сольватированных в порах поли (акриламидных) гелей., Science , 274, 966–968.
[14] Ни, С., Чиу, Д. Т., Заре, Р.Н., 1994, Исследование отдельных молекул с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии., Science, 266, 1018–1021.
[15] Келлер, Р. А., Амброуз, У. П., Гудвин, П. М., Джетт, Дж. Х., Мартин, Дж. К., Ву, М., 1996, Анализ флуоресценции одиночных молекул в растворе., Прил. Spectrosc., 50 (7), 12А – 32А.
[16] Ha, T. , Enderle, T., Ogletree, DF, Chemla, DS, Selvin, PR, Weiss, S., 1996, Исследование взаимодействия между двумя отдельными молекулами: флуоресцентный резонансный перенос энергии между одним донором и одним акцептором., Proc. Natl. Акад. Sci. США, 93 (3), 6264–6268.
[17] Ha, T., Ting, AY, Liang, J., Caldwell, WB, Deniz, AA, Chemla, DS, Schultz, PG, Weiss, S., 1999, Single-молекулярная флуоресценция спектроскопия конформационной динамики ферментов и механизма расщепления., Proc. Natl. Акад. Sci. США, 96 (3), 893–898.
[18] Ха, Т., Чжуанг, X., Ким, Х. Д., Орр, Дж. У., Уильямсон, Дж. Р., Чу, С., 1999, Индуцированные лигандом конформационные изменения, наблюдаемые в отдельных молекулах РНК., Proc. Natl. Акад. Sci. США, 96 (16), 9077–9082.
[19] Jia, Y., Talaga, DS, Lau, WL, Lu, HSM, DeGrado, WF, Hochstrasser, RM, 1999, Динамика складывания одиночных пептидов GCN-4 с помощью флуоресцентного резонансного переноса энергии конфокальной микроскопия. , Chem. Phys., 247, 69–83.
[20] Фрайз, Дж. Р., Бранд, Л., Эггелинг, К., Кёльнер, М., Зайдель, К. А. М., 1998, Количественная идентификация различных отдельных молекул с помощью селективной конфокальной флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением., J. Phys. Chem. А, 102 (33), 6601–6613.
[21] Deniz, AA, Dahan, M., Grunwell, JR, Ha, T., Faulhaber, AE, Chemla, DS, Weiss, S., 1999, Перенос энергии резонанса однопарной флуоресценции на свободно диффундирующие молекулы: наблюдение зависимости Фёрстера от расстояния и субпопуляций., Proc. Natl. Акад. Sci. США, 96 (7), 3670–3675.
[22] Дахан, М., Дениз, А. А., Ха, Т., Хемла, Д. С., Шульц, П. Г., Вайс, С., 1999, Ратиометрические измерения и идентификация одиночных диффундирующих молекул., Chem. Физ., 247 (1), 85–106.
[23] Deniz, AA, Laurence, TA, Beligere, GS, Dahan, M. , Martin, AB, Chemla, DS, Dawson, PE, Schultz, PG, Weiss, S., 2000, Single сворачивание белка -молекулы: исследования диффузионного флуоресцентного резонансного переноса энергии денатурации ингибитора химотрипсина 2. Proc. Natl. Акад. Sci. США, 97 (10), 5179–5184.
[24] Сако, Ю., Миногучи, С., Янагида, Т., 2000, Одномолекулярная визуализация передачи сигналов EGFR на поверхности живых клеток., Nat. Cell Biol., 2 (3), 168–172.
[25] Weiss, S, 1999, Флуоресцентная спектроскопия одиночных биомолекул., Science, 283, 1676–1683.
[26] Ha, T, 2001, Одномолекулярный флуоресцентный резонансный перенос энергии., Методы, 25 (1), 78–86.
[27] Рой, Р., Хонг, С., Ха, Т., 2008, Практическое руководство по одномолекулярному FRET., Nat. Методы, 5 (6), 507–516.
[28] J.Р. Лакович, Принципы флуоресцентной спектроскопии, 3-е изд. , Нью-Йорк, США: Springer, 2006.
[29] Макканн, Дж. Дж., Чой, У. Б., Чжэн, Л., Венингер, К., Боуэн. , ME, 2010, Методы оптимизации для восстановления абсолютной эффективности FRET от иммобилизованных одиночных молекул., Biophys. J., 99 (3), 961–970.
[30] Окамото К. и Сако Ю., 2012 г., Вариационный байесовский анализ фотонной скрытой марковской модели для траекторий FRET одиночных молекул., Biophys. J., 103 (6), 1315–1324.
[31] Hanson, J. A. и Yang, H., 2008, Количественная оценка взаимной корреляции между двумя временными рядами конечной длины с приложениями к FRET одиночных молекул, J. Phys. Chem. В, 112 (44), 13962–13970.
[32] Шулер, Б., Липман, Э.А., Итон, В.А., 2002, Исследование поверхности свободной энергии для сворачивания белка с помощью флуоресцентной спектроскопии одномолекулярных соединений, Nature, 419, 743–748.
[33] Гопич, И.В., Сабо А., 2003, Перенос энергии резонанса флуоресценции одиночной макромолекулы и профили свободной энергии. // J. Phys. Chem. В, 107 (21), 5058–5063.
[34] Гопич И. В., Сабо А., 2007, Одномолекулярный FRET с диффузией и конформационной динамикой., J. Phys. Chem. В, 111 (44), 12925–12932.
[35] Букобза, Э., Зонненфельд, А., Харан, Г., 2001, Иммобилизация в липидных везикулах, связанных с поверхностью, как новый инструмент для спектроскопии отдельных биомолекул., J. Phys. Chem. В, 105 (48), 12165–12170.
[36] Окамото, К. и Теразима, М., 2008, Анализ распределения для измерения FRET одиночных молекул., J. Phys. Chem. В, 112 (24), 7308–7314.
[37] Капанидис, А.Н., Ли, Н.К., Лоуренс, Т.А., Дуз, С., Марджит, Э., Вайс, С., 2004, Сортировка молекул с помощью флуоресценции: Анализ структуры и взаимодействий с помощью переменно-лазерное возбуждение одиночных молекул. , Тр. Natl.Акад. Sci. США, 101 (24), 8936–8941.
[38] Терентьева, Т.Г., Энгелькамп, Х., Роуэн, А.Е., Комацузаки, Т., Хофкенс, Дж., Ли, Ч.-Б., Бланк, К., 2012, Динамическое расстройство в одноферментные эксперименты: факты и артефакты., ACS Nano, 6 (1), 346–354.
[39] Лю, Й., Парк, Дж., Дахмен, К.А., Чемла, Ю.Р., Ха, Т., 2010, Сравнительное исследование многомерного и одномерного скрытого марковского моделирования в дискретных по времени одинарных моделях. анализ данных молекулы FRET., J. Phys. Chem. В, 114 (16), 5386–5403.
[40] МакКинни, С.А., Джу, К., Ха, Т., 2006, Анализ траекторий FRET одиночных молекул с использованием скрытого марковского моделирования., Biophys. J., 91 (5), 1941–1951.
[41] Бронсон, Дж. Э., Фей, Дж., Хофман, Дж. М., Гонсалес-младший, Р. Л., Виггинс, Ч., 2009, Скорость обучения и состояния на основе биофизических временных рядов: байесовский подход к выбору модели и одномолекулярные данные FRET. , Biophys. Дж., 97 (12), 3196–3205.
[42] Xu, CS, Kim, H., Hayden, CC, Yang, H., 2008, Совместный статистический анализ многоканальных временных рядов из одной квантовой точки- (Cy5) n конструкций ., J. Phys. Chem. В, 112 (19), 5917–5923.
[43] Ensign, D. L., и Pande, V. S., 2010, Байесовское обнаружение изменений интенсивности в траекториях одиночных молекул и молекулярной динамики., J. Phys. Chem. В, 114 (1), 280–292.
[44] Баба А. и Комацузаки Т., 2007, Построение эффективного ландшафта свободной энергии на основе временных рядов одиночных молекул, Proc. Natl. Proc. Sci. США, 104 (49), 19297–19302.
[45] Пирчи, М., Зив, Г., Ривен, И., Коэн, С.С., Зохар, Н., Барак, Ю., Харан, Г., 2011, Флуоресцентная спектроскопия одиночных молекул картирует складчатый ландшафт большого белка., Nat. Commun. , 2, 493.
[46] Schuler, B., Lipman, E. A., Steinbach, P. J., Kumke, M., Eaton, W. A., 2005, Полипролин и «спектроскопическая линейка», пересмотренные с помощью флуоресценции одиночных молекул., Proc. Natl. Акад. Sci. США, 102 (8), 2754–2759.
[47] МакКинни, С.А., Деклайс, А.-К., Лилли, Д.М. Дж., Ха, Т., 2003, Структурная динамика отдельных узлов Холлидея., Nat. Struct. Биол., 10 (2), 93–97.
[48] Hohng, S., Joo, C., Ha, T., 2004, Одномолекулярный трехцветный FRET., Biophys. J., 87 (2), 1328–1337.
[49] Sarkar, SK, Andoy, NM, Benítez, JJ, Chen, PR, Kong, JS, Chen, CH, 2007, сконструированные соединения Холлидея в качестве одномолекулярных репортеров для взаимодействия белок-ДНК с применением регулятору семейства MerR., J. Am. Chem. Soc., 129 (41), 12461–12467.
[50] Карымов, М. А., Чиннарай, М., Богданов, А., Сринивасан, А.Р., Чжэн, Г., Олсон, В.К., Любченко, Ю.Л., 2008, Структура, динамика и отраслевая миграция соединение Холлидея ДНК: исследование флуоресценции и моделирования одной молекулы., Biophys. J., 95 (9), 4372–4383.
[51] Blanchard, S. C., Gonzalez Jr., R. L., Kim, H. D., Chu, S., Puglisi, J. D., 2004, Выбор тРНК и кинетическая корректура при переводе., Nat. Struct. Мол. Биол., 11 (10), 1008–1014.
[52] Blanchard, S. C., Kim, H. D., Gonzalez Jr., R. L., Puglisi, J. D., Chu, S., 2004, динамика тРНК на рибосоме во время трансляции., Proc. Natl. Акад. Sci. США, 101 (35), 12893–12898.
[53] Rhoades, E., Коэн, М., Шулер, Б., Харан, Г., 2004, Сворачивание в двух состояниях, наблюдаемое в индивидуальных молекулах белка., J. Am. Chem. Soc., 126 (45), 14686–14687.
[54] Мерчант, К. А., Бест, Р. Б., Луис, Дж. М., Гопич, И. В., Итон, В. А., 2007, Характеристика развернутых состояний белков с использованием спектроскопии одномолекулярных FRET и молекулярного моделирования., Proc. Natl. Акад. Sci. США, 104 (5), 1528–1533.
[55] Чанг, Х. С., Луис, Дж.M., Eaton, W.A., 2009, Экспериментальное определение верхней границы времени перехода в сворачивании белка по траекториям фотон за фотоном одной молекулы., Proc. Natl. Акад. Sci. США, 106 (29), 11837–11844.
[56] Warshaw, DM, Kennedy, GG, Work, SS, Krementsova, EB, Beck, S., Trybus, KM, 2005, Дифференциальная маркировка головок миозина V с помощью квантовых точек позволяет напрямую визуализировать руку -внешняя процессивность., Биофиз. J., 88 (5), L30– L32.
[57] Томишиге М., Стурман Н., Вейл Р. Д., 2006, Одномолекулярные наблюдения конформационных изменений шейного линкера в моторном белке кинезина. , Nat. Struct. Мол. Биол., 13 (10), 887–894.
[58] Ясуда, Р., Масайке, Т., Адачи, К., Нодзи, Х., Ито, Х., Киносита, младший, К., 2003, АТФ-ожидающая конформация вращающаяся F1-АТФаза, обнаруженная с помощью парного резонансного переноса энергии флуоресценции., Proc. Natl. Акад. Sci.США, 100 (16), 9314–9318.
[59] Козука, Дж., Йокота, Х., Араи, Ю., Исии, Ю., Янагида, Т., 2006, Динамический полиморфизм одиночных молекул актина в актиновой нити., Nat. Chem. Биол., 2 (2), 83–86.
[60] Hanson, JA, Duderstadt, K., Watkins, LP, Bhattacharyya, S., Brokaw, J., Chu, J.-W., Yang, H., 2007, Illuminating the Mechanistic роли ферментов конформационной динамики., Proc. Natl. Акад. Sci. США, 104 (46), 18055–18060.
[61] He, Y., Li, Y., Mukherjee, S., Wu, Y., Yan, H., Lu, HP, 2011, Исследование конформационного состояния активного центра одномолекулярного фермента прерывистая когерентность. , J. Am. Chem. Soc., 133 (36), 14389–14395.
[62] Бережна, С. Ю., Гилл, Дж. П., Ламичхан, Р., Миллар, Д. П., 2012, Одномолекулярный резонансный перенос энергии Ферстера выявляет контрольную точку врожденной верности ДНК-полимеразы I., J. Am. Chem. Soc., 134 (27), 11261–11268.
[63] Müller-Späth, S., Soranno, A., Hirschfeld, V., Hofmann, H., Rüegger, S., Reymond, L., Nettels, D., Schuler, B. , 2010, Зарядовые взаимодействия могут доминировать над размерами внутренне неупорядоченных белков., Proc. Natl. Акад. Soc. США, 107 (33), 14609–14614.
[64] Муракоши, Х., Иино, Р., Кобаяши, Т., Фудзивара, Т., Охшима, К., Йошимура, А., Кусуми, А., 2004, Визуализация одиночных молекул анализ активации Ras в живых клетках., Proc. Natl. Акад. Sci. США, 101 (19), 7317–7322.
[65] Huppa, JB, Axmann, M., Mörtelmaier, MA, Lillemeier, BF, Newell, EW, Brameshuber, M. , Klein, LO, Schütz, GJ, Davis, MM, 2010, TCR Взаимодействия пептид-MHC in situ демонстрируют ускоренную кинетику и повышенное сродство., Nature, 9, 963–967.
[66] Hibino, K., Shibata, T., Yanagida, T., Sako, Y., 2009, Конформационное изменение C-RAF, индуцированное RasGTP, необходимо для точного молекулярного распознавания., Biophys. J., 97 (5), 1277–1287.
[67] Сакон, Дж. Дж., И Венингер, К. Р., 2010, Определение конформации отдельных белков в живых клетках., Nat. Методы, 7 (3), 203–205.

Микроскопия с флуоресцентным резонансным переносом энергии (FRET) - общие понятия

Вводные понятия

Точное расположение и природа взаимодействий между конкретными молекулярными видами в живых клетках представляет большой интерес во многих областях биологических исследований, но исследованиям часто мешает ограниченное разрешение инструментов, используемых для изучения этих явлений. Обычная широкопольная флуоресцентная микроскопия позволяет локализовать флуоресцентно меченые молекулы в пределах оптического пространственного разрешения, определенного критерием Рэлея, примерно 200 нанометров (0,2 микрометра). Однако для понимания физических взаимодействий между белками-партнерами, участвующими в типичном биомолекулярном процессе, относительная близость молекул должна быть определена более точно, чем позволяют традиционные методы оптической визуализации с дифракционным ограничением. Метод резонансного переноса энергии флуоресценции (чаще обозначаемый аббревиатурой FRET ) в применении к оптической микроскопии позволяет определять сближение двух молекул в пределах нескольких нанометров (см. Рисунок 1), расстояние, достаточно близкое для происходить молекулярные взаимодействия.

Типичные методы флуоресцентной микроскопии основаны на поглощении флуорофором света на одной длине волны (возбуждение) с последующим испусканием вторичной флуоресценции на большей длине волны. Длины волн возбуждения и излучения часто отделены друг от друга на десятки и сотни нанометров. Маркировка клеточных компонентов, таких как ядра, митохондрии, цитоскелет, аппарат Гольджи и мембраны, специфическими флуорофорами позволяет их локализовать в фиксированных и живых препаратах.Путем одновременного мечения нескольких субклеточных структур отдельными флуорофорами, имеющими отдельные спектры возбуждения и испускания, можно использовать специализированные комбинации флуоресцентных фильтров для изучения близости меченых молекул в пределах одной клетки или участка ткани. С помощью этого метода молекулы, которые расположены ближе друг к другу, чем предел оптического разрешения, по-видимому, совпадают, и эта очевидная пространственная близость подразумевает, что молекулярная ассоциация возможна. В большинстве случаев, однако, нормального разрешения флуоресцентного микроскопа с ограничением дифракции недостаточно для определения того, действительно ли имеет место взаимодействие между биомолекулами. Флуоресцентный резонансный перенос энергии - это процесс, при котором происходит безызлучательная передача энергии от флуорофора в возбужденном состоянии ко второму хромофору в непосредственной близости. Поскольку диапазон, в котором может происходить передача энергии, ограничен примерно 10 нанометрами (100 ангстрем), а эффективность передачи чрезвычайно чувствительна к расстоянию между флуорофорами, измерения резонансной передачи энергии могут быть ценным инструментом для исследования молекулярных взаимодействий. .

Механизм резонансной передачи энергии флуоресценции включает донор флуорофор в возбужденном электронном состоянии, который может передавать свою энергию возбуждения соседнему акцептору хромофор без излучения посредством диполь-дипольных взаимодействий на большие расстояния. Теория, поддерживающая передачу энергии, основана на концепции рассмотрения возбужденного флуорофора как колеблющегося диполя, который может подвергаться обмену энергией со вторым диполем, имеющим аналогичную резонансную частоту. В этом отношении резонансная передача энергии аналогична поведению связанных осцилляторов, таких как пара камертонов, колеблющихся с той же частотой. Напротив, радиационная передача энергии требует испускания и повторного поглощения фотона и зависит от физических размеров и оптических свойств образца, а также от геометрии контейнера и путей волнового фронта. В отличие от радиационных механизмов, резонансный перенос энергии может дать значительный объем структурной информации о донорно-акцепторной паре.

Резонансная передача энергии нечувствительна к окружающей оболочке растворителя флуорофора и, таким образом, дает молекулярную информацию, уникальную по сравнению с той, которая обнаруживается с помощью зависящих от растворителя событий, таких как гашение флуоресценции, реакции возбужденного состояния, релаксация растворителя или измерения анизотропии. Основное влияние растворителя на флуорофоры, участвующие в резонансном переносе энергии, - это влияние на спектральные свойства донора и акцептора. Безызлучательный перенос энергии происходит на гораздо больших расстояниях, чем короткодействующий эффект растворителя, и диэлектрическая природа компонентов (растворителя и макромолекулы хозяина), расположенных между задействованными флуорофорами, очень мало влияет на эффективность резонансной передачи энергии, которая зависит в первую очередь от расстояние между донорным и акцепторным флуорофором.

Явление резонансной передачи энергии флуоресценции не опосредовано излучением фотонов, и, кроме того, даже не требует, чтобы акцепторный хромофор был флуоресцентным. Однако в большинстве приложений и донор, и акцептор являются флуоресцентными, и возникновение передачи энергии проявляется в тушении донорной флуоресценции и уменьшении времени жизни флуоресценции, сопровождаемом также увеличением эмиссии флуоресценции акцептора. Эффективность процесса передачи энергии изменяется пропорционально обратной шестой степени расстояния, разделяющего молекулы донора и акцептора.Следовательно, измерения FRET могут использоваться в качестве эффективной молекулярной линейки для определения расстояний между биомолекулами, помеченными соответствующим донорным и акцепторным флуорохромом, когда они находятся в пределах 10 нанометров друг от друга.

Гипотетический пример резонансной передачи энергии флуоресценции между двумя флуорохромами, прикрепленными к противоположным концам одного и того же макромолекулярного белка, представлен на рисунке 1. В нативной конформации (рисунок 1 (а)) два флуорофоров разделены расстоянием приблизительно 12 нанометров, слишком далеко для передачи энергии внутримолекулярного резонанса между флуорохромами.Однако, когда белок подвергается конформационному изменению (рис. 1 (b)), два флуорохрома сближаются гораздо ближе и теперь могут участвовать в молекулярных взаимодействиях FRET. На рисунке возбуждение донорного флуорохрома показано синим свечением вокруг желтой трехъядерной ароматической молекулы, в то время как соответствующая акцепторная эмиссия (Рисунок 1 (b)) представлена ​​зеленым свечением, окружающим второй гетероциклический флуорохром справа. -ручная сторона белка.Измерения передачи энергии часто используются для оценки расстояний между сайтами на макромолекуле и влияния конформационных изменений на эти расстояния. В этом типе экспериментов степень передачи энергии используется для расчета расстояния между донором и акцептором и получения структурной информации о макромолекуле.

Хотя резонансный перенос энергии флуоресценции часто использовался для исследования межмолекулярных и внутримолекулярных структурных и функциональных модификаций белков и липидов, основным препятствием для реализации методов FRET-микроскопии в живых клетках было отсутствие подходящих методов мечения конкретных внутриклеточных белки с соответствующими флуорофорами.Клонирование зеленого флуоресцентного белка медузы ( GFP ) и его экспрессия в самых разных типах клеток стали критическим ключом к разработке маркеров как для экспрессии генов, так и для структурной локализации белка в живых клетках. Было разработано несколько вариантов мутаций этого белка, различающихся по спектру, включая флуоресцентный белок, излучающий синий свет ( синий флуоресцентный белок , BFP ). Спектры возбуждения и излучения для нативных мутантов GFP и BFP достаточно разделены по длинам волн, чтобы быть совместимыми с подходом FRET. Рисунок 2 иллюстрирует стратегию обнаружения белок-белковых взаимодействий с использованием флуоресцентного резонансного переноса энергии и мутантных флуоресцентных белков. Если два белка, один из которых помечен BFP (донор), а другой - GFP (акцептор), физически взаимодействуют, то при возбуждении комплекса при максимальной длине волны поглощения будет наблюдаться повышенная интенсивность в максимуме эмиссии акцептора (510 нанометров). (380 нм) донора. Неспособность белков образовать комплекс не приводит к эмиссии акцепторной флуоресценции (GFP).

В сочетании с достижениями в области импульсных лазеров, оптики микроскопов и компьютерных технологий визуализации разработка методов маркировки, в которых донорные и акцепторные флуорофоры фактически являются частью самих биомолекул, позволила визуализировать динамические взаимодействия белков в живых клетках. В дополнение к исследованию взаимодействий белковых партнеров, недавние применения флуоресцентного резонансного переноса энергии включают исследования активности протеаз, изменений потенциалов мембранного напряжения, метаболизма кальция и проведение высокопроизводительных скрининговых анализов, таких как количественная оценка экспрессии генов в одиночные живые клетки.

Принципы передачи энергии резонанса флуоресценции

Процесс резонансной передачи энергии ( RET ) может происходить, когда донорный флуорофор в электронно возбужденном состоянии передает свою энергию возбуждения соседнему хромофору, акцептору. В принципе, если спектр излучения флуоресценции молекулы-донора перекрывает спектр поглощения молекулы-акцептора и они находятся в пределах минимального пространственного радиуса, донор может напрямую передавать свою энергию возбуждения акцептору через диполь-дипольные межмолекулярные соединения на большие расстояния. связь.Теория, предложенная Теодором Фёрстером в конце 1940-х годов, первоначально описывала молекулярные взаимодействия, участвующие в резонансной передаче энергии, и Фёрстер также разработал формальное уравнение, определяющее связь между скоростью передачи, межхромофорным расстоянием и спектральными свойствами задействованных хромофоров.

Резонансная передача энергии - это безызлучательный квантово-механический процесс, который не требует столкновения и не требует выделения тепла. Когда происходит передача энергии, молекула-акцептор гасит флуоресценцию молекулы-донора, и если акцептор сам является флуорохромом, наблюдается повышенное или сенсибилизированное излучение флуоресценции (см. Рисунок 3).Это явление можно наблюдать, возбуждая образец, содержащий как донорные, так и акцепторные молекулы, светом с длинами волн, соответствующими максимуму поглощения донорного флуорофора, и детектируя свет, излучаемый на длинах волн с центром вблизи максимума излучения акцептора. Альтернативный метод обнаружения, быстро набирающий популярность, заключается в измерении времени жизни флуоресценции донорного флуорофора в присутствии и в отсутствие акцептора.

На рисунке 3 представлена ​​диаграмма Яблонского, иллюстрирующая связанные переходы между испусканием донора и поглощением акцептора при резонансном переносе энергии флуоресценции.Абсорбционные и эмиссионные переходы изображены прямыми вертикальными стрелками (зелеными и красными соответственно), а колебательная релаксация - волнистыми желтыми стрелками. Связанные переходы нарисованы пунктирными линиями, что указывает на их правильное расположение на диаграмме Яблонского, если они возникли в результате опосредованных фотонами электронных переходов. В присутствии подходящего акцептора донорный флуорофор может передавать энергию возбужденного состояния непосредственно акцептору, не испуская фотон (показано синей стрелкой на рисунке 3).Результирующее излучение сенсибилизированной флуоресценции имеет характеристики, аналогичные спектру излучения акцептора.

Чтобы произошла резонансная передача энергии, необходимо выполнить несколько критериев. В дополнение к перекрывающимся спектрам излучения и поглощения молекул донора и акцептора, два задействованных флуорофора должны располагаться на расстоянии от 1 до 10 нанометров друг от друга. Как описано в уравнениях, выведенных Фёрстером (и обсуждаемых ниже), эффективность передачи энергии между молекулами донора и акцептора уменьшается в шестой степени расстояния, разделяющего их.Следовательно, способность донорного флуорофора передавать свою энергию возбуждения акцептору за счет безызлучательного взаимодействия резко снижается с увеличением расстояния между молекулами, ограничивая явление FRET максимальным радиусом разделения донор-акцептор примерно 10 нанометрами. На расстояниях менее 1 нанометра возможны несколько других режимов передачи энергии и / или электронов. Зависимость процесса резонансной передачи энергии от расстояния является основной основой его полезности при исследовании молекулярных взаимодействий.В исследованиях живых клеток с участием молекул, меченных донорными и акцепторными флуорофорами, резонансная передача энергии будет происходить только между молекулами, которые находятся достаточно близко, чтобы биологически взаимодействовать друг с другом.

Дополнительным требованием для резонансного переноса энергии является то, что время жизни флуоресценции донорной молекулы должно быть достаточным для того, чтобы событие могло произойти. Как скорость ( K (T) ), так и эффективность ( E (T) ) переноса энергии напрямую связаны со временем жизни донорного флуорофора в присутствии и в отсутствие акцептора.Согласно теории Фёрстера и подтвержденной экспериментально, скорость передачи энергии определяется уравнением:

KT = (1 / τD) • [R0 / r] 6

, где R (0) - критическое значение Фёрстера расстояние , τ (D) - время жизни донора в отсутствие акцептора, а r - расстояние, разделяющее донорные и акцепторные хромофоры. Критическое расстояние Фёрстера ( R (0) ) определяется как радиус разделения акцептор-донор, для которого скорость передачи равна скорости распада донора (снятия возбуждения) в отсутствие акцептора.Другими словами, когда радиус донора и акцептора ( r ) равен расстоянию Ферстера, эффективность переноса составляет 50 процентов. На этом радиусе разделения половина энергии возбуждения донора передается акцептору за счет резонансной передачи энергии, а другая половина рассеивается за счет комбинации всех других доступных процессов, включая излучение флуоресценции.

Концептуально критическое расстояние Фёрстера - это максимальная длина разделения между донорными и акцепторными молекулами, при которой все еще будет происходить резонансная передача энергии.Значение критического расстояния обычно находится в диапазоне от 2 до 6 нанометров, что, к счастью, порядка многих размеров молекул белка. Кроме того, диапазон критических расстояний также соответствует нескольким другим биологически значимым параметрам, таким как толщина клеточной мембраны и расстояние, разделяющее сайты на белках, имеющих несколько субъединиц. Значение R (0) (в нанометрах) может быть рассчитано из следующего выражения:

R0 = 2,11 × 10-2 • [

κ

2 • J (λ) • η-4 • QD] 1/6

, в которой κ -квадрат - коэффициент, описывающий относительную ориентацию в пространстве между переходными диполями донора и акцептора, Дж (λ) - интеграл перекрытия в области излучения донора. и спектры поглощения акцептора (с длиной волны, выраженной в нанометрах), η представляет показатель преломления среды, а Q (D) представляет собой квантовый выход донора.

Эффективность передачи энергии, E (T) , является мерой доли фотонов, поглощенных донором, которые передаются акцептору, и связана с расстоянием разделения донора и акцептора, r , соотношением уравнение:

r = R0 • [(1 / ET) - 1] 1/6

и E (T) вычисляется как:

ET = 1 - (τDA / τD)

, где τ (DA) - время жизни донора в присутствии акцептора, а τ (D) - время жизни донора в отсутствие акцептора. Следовательно, измеряя время жизни донорной флуоресценции в присутствии и в отсутствие акцептора (что указывает на степень тушения донора из-за акцептора), можно определить расстояние, разделяющее молекулы донора и акцептора. Во многих обычно применяемых методах эффективность передачи энергии определяется путем измерения в установившемся режиме относительной средней интенсивности флуоресценции донора в присутствии и в отсутствие акцептора (не путем измерения времени жизни).

Таким образом, скорость передачи энергии зависит от степени спектрального перекрытия между спектрами излучения донора и поглощения акцептора (см. Рисунок 4), квантового выхода донора, относительной ориентации дипольных моментов перехода донора и акцептора, и расстояние, разделяющее молекулы донора и акцептора. Любое событие или процесс, которые влияют на расстояние между донором и акцептором, будут влиять на скорость резонансной передачи энергии, что позволяет количественно оценить явление при условии, что артефакты можно контролировать или устранять.

На рисунке 4 представлены спектры поглощения и излучения голубого флуоресцентного белка ( CFP , донор) и красного флуоресцентного белка ( RFP или DsRed , акцептор) в сравнении с их потенциальным применением в качестве пара резонансного переноса энергии флуоресценции. Спектры поглощения обоих биологических пептидов показаны красными кривыми, а спектры эмиссии представлены синими кривыми. Область перекрытия спектров излучения донора и поглощения акцептора представлена ​​серой областью у основания кривых.Когда спектральное перекрытие молекул слишком сильно увеличивается, возникает явление, известное как спектральное просачивание или кроссовер , в котором сигнал от возбужденного акцептора (возникающий из возбуждающего освещения донора) и излучение донора обнаруживаются акцепторный канал излучения. В результате получается высокий фоновый сигнал, который необходимо выделить из излучения слабой флуоресценции акцептора.

Основная теория безызлучательного переноса энергии напрямую применима к паре донор-акцептор, разделенной фиксированным расстоянием, и в этом случае скорость передачи энергии является функцией расстояния Ферстера, R (0) , которое в свою очередь зависит от κ -квадрат, J (λ) , η и Q (D) . Если эти факторы известны, можно рассчитать расстояние между донором и акцептором. Для описания таких ситуаций, как множественные акцепторные хромофоры и распределения расстояний, требуются более сложные формулировки. В таблице 1 представлены серии экспериментально измеренных критических расстояний Фёрстера, которые были установлены из спектрального перекрытия нескольких популярных пар донорно-акцепторных флуорофоров. Поскольку переменная включает в себя выход донорного кванта и степень спектрального перекрытия, оба из которых зависят от локализованных условий окружающей среды, значения расстояния Ферстера должны определяться в тех же экспериментальных условиях, что и те, которые используются для исследования резонансного переноса энергии.

Показатель преломления среды передачи энергии обычно известен из состава растворителя или может быть оценен для конкретной макромолекулы и обычно принимается равным 1,4 в водном растворе. Квантовый выход донора определяется путем сравнения со стандартными флуорофорами с известным квантовым выходом. Поскольку Q (D) появляется как шестой корень при вычислении R (0) , небольшие ошибки или неточности в значении Q (D) не имеют большого влияния на расчет расстояния Ферстера.Также из-за зависимости корня шестой степени, R (0) не сильно зависит от вариаций J (λ) , но интеграл перекрытия все равно должен оцениваться для каждой пары донор-акцептор. В общем, более высокая степень перекрытия между спектром излучения донора и спектром поглощения акцептора дает более высокие значения критического расстояния Ферстера.

Критическое расстояние Ферстера для обычных пар донор-акцептор RET
Донор Акцептор Расстояние Фёрстера (нанометры)
Триптофан Дансил 2.1
ИАЭДАНЫ (1) ДДПМ (2) 2,5 - 2,9
BFP DsRFP 3,1 - 3,3
Дансил FITC 3,3 - 4,1
Дансил Октадецилродамин 4. 3
CFP GFP 4.7 - 4,9
CF (3) Техасский красный 5.1
Флуоресцеин Тетраметилродамин 4,9 - 5,5
Cy3 Cy5 > 5,0
GFP YFP 5,5 - 5,7
BODIPY FL (4) BODIPY FL (4) 5.7
Родамин 6G Малахитовый зеленый 6.1
FITC Эозин тиосемикарбазид 6,1 - 6,4
B-фикоэритрин Cy5 7.2
Cy5 Cy5.5 > 8,0

(1) 5- (2-йодацетиламиноэтил) аминонафталин-1-сульфоновая кислота
(2) N- (4-диметиламино-3,5-динитрофенил) малеимид
(3) карбоксифлуоресцеинсукцинимидиловый эфир
(4) 4,4-дифтор-4-бора-3a, 4a-диаза-s-индацен

Таблица 1

Неопределенность в оценке фактора ориентации ( κ -квадрат) широко обсуждалась в литературе, и, несмотря на экспериментальные доказательства того, что теория Фёрстера действительна и применима к измерению расстояний, эта переменная продолжала оставаться несколько спорным. Важно понимать, что расстояния Ферстера обычно приводятся для предполагаемого значения κ -квадрат, обычно это динамически усредненное значение 2/3 (0,67). Это предполагаемое значение является результатом рандомизации ориентации донора и акцептора путем вращательной диффузии до передачи энергии. Фактор ориентации зависит от относительной ориентации в пространстве диполя излучения донора и диполя поглощения акцептора и может варьироваться от нуля до 4. Значение 1 соответствует параллельным диполям перехода, а значение 4 соответствует диполям, которые оба являются параллельные и коллинеарные.

Из-за связи корня шестой степени с расстоянием Ферстера, изменение коэффициента ориентации от 1 до 4 приводит только к 26-процентному изменению рассчитанного расстояния, а максимальная погрешность в 35 процентов возможна, когда обычно принимаемое значение 0,67 применяется. Наиболее серьезная потенциальная ошибка возникает, если диполи ориентированы точно перпендикулярно друг другу, и соответствующее значение в квадрате κ становится равным нулю. Было использовано несколько методов работы с неопределенностью, включая предположение о том, что существует ряд статических ориентаций, которые не изменяются в течение времени жизни флуорофора в возбужденном состоянии.Измерения анизотропии флуоресценции для донора и акцептора могут позволить определить пределы для отклонения в квадрате κ . Кроме того, использование флуорофоров с низкой поляризацией флуоресценции (из-за излучения нескольких перекрывающихся переходов) снижает неопределенность в коэффициенте ориентации. Ограничение возможных значений κ -квадрат таким образом снижает потенциальную ошибку вычисления расстояния до 10 процентов.

Во многих случаях фактор ориентации трудно, если вообще возможно, определить, а точное значение переменной часто рассматривается как непреодолимая проблема.Однако некоторые свидетельства указывают на ограничение важности фактора в расчетах резонансной передачи энергии. Сравнение донорных и акцепторных расстояний с использованием резонансной спектроскопии переноса энергии и рентгеновской дифракции в значительной степени подтверждает обоснованность принятия значения 0,67 для фактора (как предлагается теорией Фёрстера), по крайней мере, для небольших пептидов и белков. Больше неопределенности существует для более крупных белков. Использование этого значения для фактора ориентации допустимо при предположении, что зонды донора и акцептора могут свободно совершать неограниченное изотропное движение.Дальнейшее обоснование получено из экспериментального доказательства того, что для флуорофоров, прикрепленных одинарной или двойной связью к макромолекулам, сегментарные движения донора и акцептора имеют тенденцию приводить к динамически рандомизированным ориентациям.

Для слабосвязанных флуорохромов свободное вращательное движение вокруг одинарных связей должно позволить использовать среднее значение ориентации, но неограниченное движение молекул, связанных через несколько сайтов связывания, вероятно, не происходит. С другой стороны, крайние значения нуля и 4 для κ -квадрат требуют полной поляризации флуоресценции донора и акцептора, а это условие маловероятно.Статистические расчеты были представлены некоторыми исследователями, которые утверждают, что расстояния распределения донор-акцептор и их ориентация определяют наблюдаемое среднее расстояние. При условии, что наблюдается некоторое распределение наблюдаемого расстояния (и это не ограничивается слишком близким расположением донора и акцептора относительно R (0) ), можно надежно получить среднее расстояние между флуорофорами и оценить погрешность, обусловленную фактором ориентации. .

Зависимость фактора ориентации ( κ - в квадрате) от относительной ориентации диполя излучения донора и диполя поглощения акцептора (проиллюстрировано на рисунке 5) дается уравнением:

κ

2 = (cos θT - 3cos θDcos θA) 2 = (sin θD sin θAcos Φ - 2cos θDcos θA) 2

, где θ (T) - угол между диполем перехода излучения донора и диполем перехода поглощения акцептор, θ (D), и θ (A), - это углы между этими диполями и вектором, соединяющим донор и акцептор, а Φ - угол между плоскостями, содержащими два переходных диполя.

Эффективность передачи энергии наиболее чувствительна к изменениям расстояния, когда расстояние между донором и акцептором приближается к расстоянию Ферстера ( R (0) ) для двух молекул. Рисунок 6 иллюстрирует экспоненциальную зависимость между эффективностью переноса и расстоянием, разделяющим донор и акцептор. Эффективность быстро увеличивается до 100 процентов, когда расстояние разделения уменьшается ниже R (0) , и, наоборот, уменьшается до нуля, когда r больше, чем R (0) .Из-за сильной (шестой степени) зависимости эффективности переноса от расстояния измерения расстояния разделения донора и акцептора надежны только в том случае, если радиус донора и акцептора находится в пределах расстояния Ферстера в два раза. Когда r составляет приблизительно 50 процентов от R (0) , эффективность резонансной передачи энергии близка к максимальной, и более короткие расстояния не могут быть надежно определены. Когда расстояние донор-акцептор превышает значение R (0) на 50 процентов, наклон кривой настолько пологий, что более длинные разделительные расстояния не разрешаются.

Практическое значение критического расстояния Ферстера состоит в том, что это значение дает представление о диапазоне расстояний разделения, которые могут быть определены FRET для данной пары датчиков (см. Таблицу 1). Поскольку измерение передачи энергии очень чувствительно к изменению расстояния, когда расстояние донор-акцептор близко к расстоянию Ферстера, приблизительные размеры целевого молекулярного взаимодействия являются наиболее важным фактором при выборе пары флуоресцентных красителей.Другие факторы, которые следует учитывать, в зависимости от того, проводятся ли измерения в установившемся режиме или с временным разрешением, включают химическую стабильность, квантовый выход и время жизни флуорофора. Поскольку для обычных методов флуоресцентного резонансного переноса энергии не существует внутреннего эталона расстояния, расстояния, рассчитанные путем измерения эффективности переноса, относятся к расстоянию Ферстера, которое выводится из спектроскопических данных, измеренных на парах донор-акцептор.

Явление резонансной передачи энергии с помощью механизма Ферстера является сложным в некоторых аспектах, но простым и надежным по своему результату.Расстояния Ферстера точно предсказываются из спектральных свойств донора и акцептора, и, поскольку никаких исключений из теории еще не выявлено, можно предположить, что резонансная передача энергии происходит при любых условиях, при которых пара молекул донора-акцептора находится в непосредственной близости. Сложность в теории, описывающей перенос диполя, возникает не из-за самого механизма передачи, а из-за наличия распределений расстояний (включая неслучайные распределения) и диффузии молекул донора и акцептора.Когда предпринимаются шаги для усреднения зависимости передачи энергии от расстояния по диапазону геометрий и временных рамок, FRET представляет собой надежный метод исследования пространственного распределения между взаимодействующими молекулами.

Применение методов FRET в оптической микроскопии

Параметры конфигурации микроскопа для исследований флуоресцентного резонансного переноса энергии варьируются в зависимости от требований флуорофоров, образца и режима (-ов) визуализации, но практически любой прямой или инвертированный микроскоп можно дооснастить для FRET-микроскопия (см. Рисунок 7).В общем, микроскоп должен быть оснащен охлаждаемой и усиленной системой CCD-камеры с высоким разрешением (12 бит), связанной с качественными интерференционными фильтрами, имеющими низкие уровни перекрестных помех (минимальный уровень блокировки) и полосы пропускания, соответствующие спектрам флуорофора. Чувствительность детектора определяет, насколько узкой может быть полоса пропускания фильтра, при этом сбор данных может продолжаться с приемлемой скоростью с минимумом сквозного спектрального шума. В большинстве случаев для получения изображений следует использовать одно дихроматическое зеркало, соединенное с колесами или ползунками фильтров возбуждения и излучения, чтобы минимизировать или исключить сдвиги изображения.

Широкопольная флуоресцентная микроскопия страдает от излучения флуорофора, возникающего выше и ниже фокальной плоскости, что приводит к получению изображений со значительным расфокусированным сигналом, что снижает контраст и приводит к ухудшению качества изображения. Эта проблема усугубляется в микроскопии FRET из-за изначально низких уровней сигнала, возникающих в результате резонансной передачи энергии. Методы цифровой деконволюции могут быть связаны с оптическим секционированием, чтобы уменьшить или исключить сигналы вдали от фокальной плоскости, но этот процесс требует больших вычислительных ресурсов и может быть недостаточно быстрым для многих экспериментов по динамической визуализации FRET. Конфокальные методы лазерного сканирования могут применяться к FRET-микроскопии для значительного улучшения латерального разрешения, позволяя собирать последовательные оптические срезы с интервалами, приближающимися к реальному времени. Основным недостатком конфокальной микроскопии является ограничение длин волн возбуждения стандартными лазерными линиями, доступными для конкретной системы, что ограничивает выбор пар флуорофора донора и акцептора в экспериментах по резонансному переносу энергии. Многофотонное возбуждение также может использоваться в сочетании с методами FRET и меньше повреждает клетки из-за задействованных более длинных волн возбуждения.Кроме того, артефакты автофлуоресценции и фотообесцвечивание образца с меньшей вероятностью возникают в ограниченном объеме возбуждения, характерном для многофотонного возбуждения.

Типичная конфигурация микроскопа, позволяющая наблюдать живые клетки в культуре с несколькими мотивами изображения флуоресцентного резонансного переноса энергии, представлена ​​на рисунке 7. Инвертированный микроскоп для культуры тканей оснащен стандартной вольфрам-галогенной лампой на столбе для исследования и записи. ячейки, использующие стандартное освещение светлого поля, фазового контраста или дифференциального интерференционного контраста ( DIC ).Обратите внимание, что последние два метода усиления контраста могут использоваться в сочетании с флуоресценцией, чтобы выявить пространственное расположение флуорофоров в клеточной архитектуре. Стандартная камера CCD с охлаждением Пельтье прикреплена к тринокулярной головке микроскопа для получения широкопольной флуоресценции и захвата изображений в светлом поле.

Эксперименты по резонансной передаче энергии проводятся с использованием мультиспектрального освещения с использованием либо широкопольного освещения (дуговая разрядная лампа), либо конфокальной сканирующей приставки в реальном времени, оснащенной высокоскоростной дисковой системой Нипкова.Луч аргонно-криптонового лазера сначала фильтруется через акустооптическое устройство с перестраиваемой длиной волны для выбора конкретных длин волн возбуждения перед прохождением к конфокальной сканирующей головке. Изображения собираются с помощью двух охлаждаемых ПЗС-камер высокого разрешения Gen III с усиленным охлаждением, считывающих отдельные каналы, и передаются в буфер на главный компьютер. Сканирование образца в боковой ( x и y ) и осевой ( z ) плоскостях позволяет собирать оптические срезы для восстановления трехмерного изображения.С проиллюстрированной конфигурацией микроскопа совместимы различные программы обработки изображений.

Основываясь на фундаментальных принципах этого явления, при проведении измерений резонансного переноса энергии флуоресценции с помощью оптического микроскопа следует учитывать ряд важных практических моментов:

  • Концентрации донорных и акцепторных флуорофоров необходимо тщательно контролировать. Статистически самая высокая вероятность достижения резонансного переноса энергии флуоресценции происходит, когда несколько акцепторных молекул окружают одну донорную молекулу.
  • Фотообесцвечивание необходимо исключить, поскольку артефакт может изменить молекулярное соотношение донора и акцептора и, следовательно, измеренное значение процесса резонансной передачи энергии.
  • Спектр излучения донорной флуоресценции и спектр поглощения акцептора должны иметь значительную область перекрытия.
  • Прямое возбуждение акцептора в диапазоне длин волн, используемом для возбуждения донора, должно быть минимальным. Распространенным источником ошибок при измерениях методом FRET-микроскопии в установившемся режиме является обнаружение донорной эмиссии с помощью наборов акцепторных фильтров.
  • Длины волн излучения как донора, так и акцептора должны совпадать с максимальным диапазоном чувствительности детектора.
  • Спектры поглощения и излучения донора должны иметь минимальное перекрытие, чтобы уменьшить возможность самопереноса от донора к донору.
  • Донорная молекула должна быть флуоресцентной и иметь достаточно долгое время жизни, чтобы произошла резонансная передача энергии.
  • Донор должен обладать низкой поляризационной анизотропией, чтобы минимизировать неопределенности в значении фактора ориентации (-квадрат).Этому требованию удовлетворяют доноры, излучение которых происходит в результате нескольких перекрывающихся переходов возбуждения.
  • При использовании методов маркировки антител не следует изменять биологическую активность реагентов, конъюгированных с донорными и акцепторными флуорохромами. Любое снижение активности серьезно повлияет на достоверность результатов измерений резонансной передачи энергии.
  • Поскольку флуоресцентный резонансный перенос энергии требует, чтобы молекулы донора и акцептора имели соответствующее дипольное выравнивание и располагались в пределах 10 нанометров друг от друга, необходимо учитывать третичную структуру реагентов, к которым присоединены молекулы.Например, когда донорно-акцепторные молекулы могут быть прикреплены к различным структурным местоположениям (таким как карбокси или амино-конец) на белке, возможно, что FRET не будет наблюдаться, даже если белки действительно взаимодействуют, потому что молекулы донора и акцептора расположены на противоположных концах взаимодействующих молекул.
  • Живые клетки, помеченные зелеными флуоресцентными мутантами белка для исследований FRET, следует анализировать с использованием традиционных иммуногистохимических методов, чтобы убедиться, что меченый белок принимает ту же внутриклеточную среду обитания и свойства, что и нативный аналог.

Для того, чтобы явление флуоресцентного резонансного переноса энергии обеспечивало получение значимых данных в качестве инструмента оптической микроскопии, необходимо оптимизировать как подготовку образца, так и параметры визуализации. Выбор подходящих донорных и акцепторных зондов и способа их использования в качестве молекулярных меток является серьезной проблемой. Кроме того, как только стратегия маркировки, которая разрешает передачу энергии, была выяснена, для выполнения самого измерения можно использовать широкий спектр методов.Большинство количественных исследований флуоресцентной микроскопии проводится путем измерения интенсивности флуоресцентного излучения. Детектирование FRET на основе интенсивности флуоресценции обычно достигается путем отслеживания изменений относительных величин интенсивности излучения на двух длинах волн, соответствующих донорному и акцепторному хромофорам. Когда условия подходят для возникновения резонансной передачи энергии флуоресценции, увеличение эмиссии акцептора ( I (A) ) сопровождается одновременным уменьшением интенсивности эмиссии донора ( I (D) ).

Хотя изменение относительной интенсивности излучения донора или акцептора можно рассматривать как показатель резонансного переноса энергии, обычно используется отношение двух значений, I (A) / I (D) , как мера FRET. Величина отношения зависит от среднего расстояния между парами донор-акцептор и нечувствительна к различиям в длине пути и объёме, к которым получает доступ возбуждающий световой луч. Любое состояние образца, которое вызывает изменение относительного расстояния между молекулярными парами, вызывает изменение соотношения испускания донора и акцептора.Следовательно, FRET можно наблюдать в микроскопе путем преимущественного возбуждения донорного флуорофора и детектирования повышенного излучения взаимодействующего акцепторного флуорофора, сопровождаемого уменьшением флуоресценции донора, вызванным гашением из-за передачи энергии. Измерение FRET с использованием подхода мониторинга интенсивности называется установившимся режимом флуоресцентным резонансным переносом энергии.

Подходящие донорные и акцепторные зонды выбираются на основании их спектральных характеристик поглощения и излучения.Для максимальной резонансной передачи энергии спектр излучения донора должен существенно перекрывать спектр поглощения акцептора. Кроме того, должно быть минимальное прямое возбуждение акцепторного флуорофора в максимуме возбуждения донора, и не должно быть значительного перекрытия эмиссии между донором и акцептором в области длин волн, в которой происходит эмиссия акцептора. На практике может быть сложно определить пары донор-акцептор, удовлетворяющие этим требованиям.Ситуация часто осложняется тем фактом, что имеющиеся в продаже наборы флуоресцентных фильтров не полностью эффективны в пропускании только желаемых длин волн, и может передаваться небольшой процент света за пределами проектной полосы пропускания. Если не используются очень хорошо охарактеризованные и контролируемые системы экспрессии, может быть трудно определить точную концентрацию донорных и акцепторных флуорофоров. Дополнительные корректировки могут также потребоваться для автофлуоресценции, фотообесцвечивания и фоновой флуоресценции.

Типичное исследование внутриклеточной белковой ассоциации в живой культуре клеток проиллюстрировано на Рисунке 8 для событий, связанных с апоптозом, физическим процессом гибели клеток в результате сложного каскада последовательных взаимодействий. Генные продукты, непосредственно участвующие в цепи событий, могут быть помечены слиянием с соответствующими членами семейства флуоресцентных белков (в данном случае BFP и GFP) для совместной экспрессии в одной и той же клетке, чтобы исследовать специфические ассоциации с помощью FRET.Белки, участвующие в апоптозе, взаимодействуют внутри митохондрий и демонстрируют постепенное снижение связывания по мере того, как происходит запрограммированная гибель клеток. Таким образом, изображение излучения донора (рис. 8 (а)) содержит только флуоресценцию от белков, меченных BFP, в то время как соответствующий профиль излучения акцептора (рис. 9 (b)) иллюстрирует сигналы, обусловленные белками, меченными GFP (и некоторый вклад от донорская эмиссия). Фильтр FRET (рис. 8 (c)), как описано ниже, выявляет флуоресценцию, полученную в результате резонансного переноса энергии между двумя белками

Среди факторов, которые могут потенциально повлиять на точность измерений резонансного переноса энергии флуоресценции в целом, несколько очень специфичны. к оптическому микроскопу.Основная цель микроскопических исследований - получить изображения с высоким разрешением, и это требует особого внимания к качеству и характеристикам оптических фильтров, используемых для спектрального различения длин волн поглощения и излучения донора и акцептора. Чтобы максимизировать отношение сигнал / шум (без вредного воздействия на образец или исследуемый процесс), необходимо тщательно сбалансировать интенсивность и время воздействия возбуждающего света с концентрацией донорных и акцепторных флуорофоров и детектора. эффективность.Если концентрация донорно-акцепторных флуорофоров чрезмерна, может произойти самотушение, влияющее на точность измерений FRET. Фотообесцвечивание является проблемой всех флуорофоров и может повлиять на соотношение донор-акцептор, изменяя измерения флуоресценции. Избыточная интенсивность освещения также может повредить образцы, особенно содержащие живые клетки или ткани.

Метод, известный как донорский фотообесцвечивающий резонансный перенос энергии флуоресценции ( pbFRET ), который использует процесс фотообесцвечивания для измерения FRET, часто применяется при исследовании фиксированных образцов.Основанный на попиксельном анализе, этот метод был применен для измерения отношений близости между белками клеточной поверхности, меченными моноклональными антителами, конъюгированными с флуорофором. Фотообесцвечивание FRET основано на теории, согласно которой флуорофор чувствителен к фотоповреждению только тогда, когда он находится в возбужденном состоянии. Статистически только небольшая часть молекул находится в возбужденном состоянии в любой момент времени, и поэтому флуорофоры с более длительным временем жизни флуоресценции имеют более высокую вероятность фотоповреждения и демонстрируют более высокую скорость фотообесцвечивания.

Экспериментальные данные, подтверждающие эту концепцию, продемонстрировали, что время фотообесцвечивания флуорофора обратно пропорционально времени его жизни в возбужденном состоянии. Возникновение резонансной передачи энергии сокращает время жизни флуоресценции молекулы донора, эффективно защищая ее от фотообесцвечивания. Расчеты pbFRET основаны на уменьшении скорости фотообесцвечивания донора по сравнению с измеренной для донора в отсутствие резонансной передачи энергии. Измерение фотообесцвечивания в исследованиях FRET требует относительно длительного периода времени и поэтому наиболее применимо к образцам фиксированных клеток, в которых временные данные не важны, а влияние фотообесцвечивания на функцию клеток не является проблемой.В некоторых отношениях метод фотообесцвечивания доноров менее сложен, чем измерение сенсибилизированного излучения, хотя подгонка постоянных времени к кривым фотообесцвечивания, включающим несколько компонентов, представляет некоторые дополнительные трудности.

Эффективность передачи энергии также может быть определена с помощью метода фотообесцвечивания акцептора , в котором изменение в тушении эмиссии донора измеряется путем сравнения значения до и после селективного фотообесцвечивания молекулы акцептора.Анализ изменения интенсивности флуоресценции донора в одних и тех же областях образца до и после удаления акцептора имеет то преимущество, что требует подготовки только одного образца, и напрямую связывает эффективность передачи энергии с флуоресценцией как донора, так и акцептора.

Точное измерение резонансного переноса энергии флуоресценции в микроскопе требует компенсации всех потенциальных источников ошибок. Был разработан простой метод корректировки обнаружения донорной флуоресценции с помощью фильтра эмиссии акцептора и флуоресценции акцептора с фильтром эмиссии донора (из-за кроссовера или спектрального просвечивания).Метод также корректирует зависимость FRET от концентраций донорных и акцепторных флуорофоров. Стратегия измерения, которая требует минимум спектральной информации, использует комбинацию из трех наборов фильтров и может быть легко реализована. Наборы фильтров донора, FRET и акцептора предназначены для выделения и максимизации трех конкретных сигналов: флуоресценции донора, флуоресценции акцептора, относящейся к FRET, и флуоресценции непосредственно возбужденного акцептора, соответственно. На практике три разных образца, содержащие только донор, только акцептор, и донор, и акцептор, исследуются с каждым из трех наборов фильтров, и полученные данные обрабатываются арифметически для корректировки кроссовера и неконтролируемых изменений концентраций донор-акцептор.

На рисунке 9 представлены схематические иллюстрации кроссовера (спектральное просачивание) и перекрестных помех фильтра, двух существенных проблем, которые необходимо преодолеть, чтобы получить количественные результаты в экспериментах с резонансным переносом энергии флуоресценции. Кроссовер или просачивание проявляется в перекрытии спектра излучения донорной флуоресценции с полосой пропускания интерференционного фильтра излучения акцептора на рисунке 9, в результате чего сигнал излучения донора (нежелательные длины волн) проходит через фильтр излучения. Напротив, перекрестные помехи фильтра описывают минимальный уровень затухания (блокировки) в определенном диапазоне двух фильтров, установленных вместе последовательно, и вызывают беспокойство при согласовании фильтров возбуждения и излучения для наборов флуоресценции. Дихроматические зеркала часто включают в оценку перекрестных помех комбинаций флуоресцентных фильтров. Хотя два эмиссионных фильтра редко устанавливаются на пути света одновременно, спектры объединены на рисунке 9, чтобы одновременно проиллюстрировать обе концепции.Обратите внимание, что два спектра фильтра (синяя и красная кривые) представляют коэффициент пропускания света интерференционными фильтрами, тогда как кривая излучения донора (зеленый) представляет собой график зависимости интенсивности от длины волны.

Дополнительные факторы, которые потенциально могут привести к значительным ошибкам, также требуют исправления при использовании методов измерения FRET в установившемся режиме. Кроме того, желателен тщательный контроль концентраций донорного и акцепторного флуорофора. Определения концентрации флуорофора можно частично избежать за счет применения измерений флуоресценции с временным разрешением, которые обеспечивают метод получения среднего времени жизни без точного знания концентраций доноров.Этот метод позволяет количественно определять расстояние разделения донор-акцептор и основан на измерениях времени жизни донора в присутствии и в отсутствие акцептора. Измерение затухания интенсивности флуоресценции как функции времени проясняет динамику излучения молекулы в возбужденном состоянии, и, следовательно, может быть получена более подробная информация о природе донорно-акцепторного взаимодействия. Графические графики спада интенсивности иллюстрируют усредненные по времени детали процесса затухания флуоресценции (см. Рисунок 10 (а)), которые не разрешаются при использовании методов устойчивого состояния.Измерения, показывающие одно и то же значение средней продолжительности жизни, когда они регистрируются как интенсивность в установившемся режиме, нормированная на поглощение, могут соответствовать существенно разным формам кривых затухания на графиках данных с временным разрешением, указывая на различия в участвующих межмолекулярных процессах.

Время жизни флуоресценции ( τ ) флуорофора - это характерное время, в течение которого молекула находится в возбужденном состоянии перед возвращением в основное состояние. Представляя затухание флуоресценции в упрощенной единственной экспоненциальной форме после короткого импульса возбуждающего света, интенсивность флуоресценции как функция времени ( t ) определяется уравнением:

I (t) = I0 exp (-t / τ )

, где I (0) - начальная интенсивность излучения флуоресценции сразу после импульса возбуждающего света, а I (t) - интенсивность флуоресценции, измеренная в момент времени t .Время жизни флуоресценции ( τ ) определяется как время, необходимое для уменьшения интенсивности до 1 / e от ее начального значения (приблизительно 37 процентов от I (0) ; рисунок 10 (a)), и составляет величина, обратная константе скорости затухания флуоресценции из возбужденного состояния в основное.

Основным общим преимуществом измерений FRET с временным разрешением по сравнению с установившимся режимом является то, что расстояние разделения донор-акцептор может быть нанесено на карту с большей количественной точностью. Это происходит отчасти потому, что время жизни флуоресценции не зависит от локальной интенсивности или концентрации и в значительной степени не зависит от фотообесцвечивания флуорофоров. Однако времена жизни флуоресценции очень чувствительны к среде флуорофора, и даже молекулы со сходными спектрами могут проявлять разные времена жизни в разных условиях окружающей среды. Поскольку рассеяние не влияет на время жизни флуорофора, измерения изменения времени жизни могут предоставить информацию, которая конкретно связана с локальными молекулярными процессами.

Срок службы флуорофора может быть изменен множеством переменных в локальном микроокружении, включая такие факторы, как гидрофобность, концентрация кислорода, ионная сила других компонентов среды, связывание с макромолекулами и близость к молекулам акцептора, которые могут истощать возбужденное состояние. состояние за счет резонансной передачи энергии. Значительным практическим преимуществом является то, что измерения времени жизни могут служить абсолютными индикаторами молекулярных взаимодействий и не зависят от концентрации флуорофора.

Два общих метода, обычно используемых для измерения времени жизни флуоресценции, классифицируются как во временной области ( импульсный , см. Рисунок 10 (a)) и в частотной области (также называемый с фазовым разрешением ; рисунок 10 (б)) методы. При измерении срока службы во временной области используются источники света с импульсным возбуждением, а время жизни флуоресценции получают путем прямого измерения сигнала излучения или регистрации с помощью счета фотонов. Подход в частотной области использует синусоидальную модуляцию источника возбуждающего света (полученную от импульсных или модулированных лазерных систем), а время жизни определяется из фазового сдвига и глубины демодуляции сигнала флуоресцентного излучения.Каждый из этих подходов к визуализации времени жизни флуоресценции имеет определенные преимущества и недостатки, и оба широко применяются в традиционной широкопольной, конфокальной и многофотонной микроскопии.

На рисунке 10 показаны схематические диаграммы, представляющие методы временной и частотной областей для определения времени жизни флуоресценции. В подходе во временной области (рис. 10 (а)) образец возбуждается коротким импульсом лазерного света, длительность которого намного короче, чем время жизни возбужденных частиц, и измеряется экспоненциальный профиль затухания как функция времени.Затухание флуоресценции обычно является моноэкспоненциальной функцией для одного флуорофора, но может иметь гораздо более сложный характер, если возбужденное состояние имеет многочисленные пути релаксации, доступные в окружающей среде. Синусоидально модулированный свет от лазера непрерывного действия, соединенного с акустооптическим модулятором, используется для возбуждения флуорофора в экспериментах в частотной области (рис. 10 (b)). Результирующее флуоресцентное излучение модулируется синусоидально на той же частоте, что и возбуждение, но сопровождается фазовым сдвигом и уменьшением глубины модуляции.В случае однократного экспоненциального затухания время жизни флуоресценции можно рассчитать, определив либо степень фазового сдвига ( φ ), либо коэффициент модуляции ( M ), используя уравнения, представленные на рисунке 10 (b). Если два значения идентичны, затухание флуоресценции действительно состоит из одной экспоненциальной функции. Когда присутствует более одного флуоресцентного вещества (или один флуорофор находится в сложной среде), фазовый сдвиг и время жизни модуляции следует оценивать в широком диапазоне частот.

Метод измерения времени жизни флуоресценции во временной области в основном основан на подсчете одиночных фотонов и требует системы обнаружения с достаточным временным разрешением для сбора почти 100 процентов фотонов, генерируемых каждым импульсом возбуждения. Хотя методы с фазовым разрешением относительно менее требовательны к выполнению, они, как правило, не так чувствительны, как метод подсчета фотонов. Когда фазовая модуляция используется для разрешения сложных времен жизни мультифлуорофоров, длительное время воздействия повреждающего возбуждающего света может оказаться чрезмерным для некоторых образцов, а также может не обеспечить достаточного временного разрешения для процессов с живыми клетками. Предпочтительный метод зависит как от информации, необходимой для исследования, так и от типа исследуемого образца.

Измерения времени жизни флуоресценции оказались чувствительным индикатором FRET и имеют особые преимущества при исследованиях живых клеток из-за независимости измерений времени жизни от таких факторов, как концентрация и длина светового пути, которые трудно контролировать в живых образцах. Основное преимущество выполнения FRET-исследований с помощью измерения времени жизни флуоресценции заключается в том, что можно различать перенос энергии даже между донорно-акцепторными парами с аналогичными спектрами излучения.Когда время жизни флуоресценции измеряется напрямую (в отличие от использования значений в установившемся состоянии), определение FRET возможно без фотодеструкции донорных или акцепторных флуорофоров. Поскольку FRET уменьшает время жизни флуоресценции донорной молекулы за счет передачи энергии акцептору, прямое сравнение времени жизни донора в присутствии акцептора ( τ (DA) ) с временем жизни в отсутствие акцептора ( τ ( D) ), позволяет вычислять значение эффективности FRET ( E (T) ) для каждого пикселя изображения.

В зависимости от метода измерения времени жизни флуоресценции требуют, чтобы образец подвергался воздействию либо высокочастотных повторяющихся импульсов возбуждающего света, либо непрерывного синусоидально модулированного света. В исследованиях с живыми клетками всегда необходимо оценивать эффект интенсивного освещения. Независимо от метода, эталонное время жизни донора без акцептора должно быть определено в экспериментальных условиях, идентичных условиям измерения донор-акцептор.Одним из способов достижения этого с одним образцом является измерение времени жизни только донора после фотообесцвечивания акцептора после эксперимента по передаче энергии.

Выводы

В биологических исследованиях наиболее распространенными применениями резонансного переноса энергии флуоресценции являются измерение расстояний между двумя участками макромолекулы (обычно белка или нуклеиновой кислоты) или исследование взаимодействия in vivo между биомолекулярными объектами. Белки могут быть помечены синтетическими флуорохромами или иммунофлуоресцентными флуорофорами, которые служат донором и акцептором, но достижения в генетике флуоресцентных белков теперь позволяют исследователям маркировать определенные целевые белки множеством биологических флуорофоров, имеющих разные спектральные характеристики. Во многих случаях аминокислота триптофан используется в качестве флуорофора внутреннего донора, который может быть связан с любым количеством внешних зондов, выступающих в качестве акцептора.

Если макромолекулы помечены одним донором и акцептором, а расстояние между двумя флуорохромами не изменяется в течение времени жизни возбужденного состояния донора, то расстояние между зондами можно определить по эффективности передачи энергии в установившемся состоянии. измерения, как обсуждалось выше.В случаях, когда расстояние между донором и акцептором колеблется вокруг кривой распределения, например, белковые сборки, мембраны, одноцепочечные нуклеиновые кислоты или развернутые белки (см. Сценарии, представленные на рисунке 11), FRET все еще можно использовать для изучения явления, но предпочтительны измерения срока службы с временным разрешением. Несколько биологических приложений, которые попадают в оба случая, показаны на рисунке 11, включая конформационные изменения, диссоциацию или гидролиз, слияние мембраноподобных липидных везикул и взаимодействия лиганд-рецептор.

Несмотря на то, что для измерения резонансного переноса энергии флуоресценции в оптическом микроскопе доступны различные методы, ни один из них не лишен недостатков. Некоторые методы требуют более сложных и дорогих инструментов, в то время как другие основаны на предположениях, которые необходимо тщательно проверять. Некоторые подходы подходят для фиксированных образцов, но не могут применяться к системам живых клеток, в то время как другие методы должны включать значительные корректирующие вычисления или алгоритмы анализа данных.Тем не менее, несомненно, что анализ FRET показывает большие перспективы для дальнейшего развития полезности и объема биологических приложений. В последние годы произошли драматические улучшения в инструментарии, особенно в отношении методов с временным разрешением.

Измерения времени жизни флуоресценции, которые раньше выполнялись крайне трудно, теперь поддерживаются зрелыми пикосекундными и наносекундными технологиями. Успехи в разработке флуоресцентных зондов позволили получить более мелкие и более стабильные молекулы с новыми механизмами прикрепления к биологическим мишеням.Были также разработаны флуорофоры с широким диапазоном времени жизни в возбужденном состоянии, и значительные усилия прилагаются к развитию большего разнообразия генетических вариаций флуоресцентных белков. Совершенно новые классы флуоресцентных материалов, многие из которых меньше, чем предыдущие флуорофоры, и позволяют оценивать молекулярные взаимодействия на более низких расстояниях разделения, обещают улучшить универсальность мечения и привести к новым применениям метода FRET.

Соавторы

Брайан Херман и Виктория Э. Centonze Frohlich - Департамент клеточной и структурной биологии, Центр медицинских наук Техасского университета, 7703 Floyd Curl Drive, Сан-Антонио, Техас 78229.

Джозеф Р. Лакович - Центр флуоресцентной спектроскопии, Департамент биохимии и молекулярной биологии, Университет Мэриленда и Институт биотехнологии Университета Мэриленда (UMBI), 725 West Lombard Street, Baltimore, Maryland 21201.

Thomas J. Fellers and Michael W.Дэвидсон - Национальная лаборатория сильного магнитного поля, 1800 Ист. Пол Дирак, доктор, Университет штата Флорида, Таллахасси, Флорида, 32310.

FRET - Учебный центр Андора

Обзор решений Andor для FRET

FRET (иногда называемый Förster Resonance Energy Transfer ) позволяет определить близость двух флуорофоров. FRET - это один из ряда методов одиночных молекул, таких как TIRF, SIM и локализация сверхвысокого разрешения, которые приобрели популярность в последние годы. Резонансная передача энергии происходит только на очень короткие расстояния, обычно в пределах 10 нм, и включает прямую передачу энергии возбужденного состояния от донорного флуорофора к акцепторному флуорофору в качестве альтернативы затуханию флуоресценции от донора. При передаче энергии молекула акцептора переходит в возбужденное состояние, из которого она распадается эмиссионно (всегда с большей длиной волны, чем у акцепторного излучения). Возбуждая донора, а затем отслеживая относительные выбросы донора и акцептора, последовательно или одновременно, можно определить, когда произошел FRET и с какой эффективностью.

Флуорофоры могут быть использованы для специфической маркировки представляющих интерес биомолекул, а условие расстояния для FRET порядка диаметра большинства биомолекул (1-10 нм). Это означает, что FRET можно использовать для определения того, когда и где две или более из этих меченых биомолекул (обычно белки) взаимодействуют в своем физиологическом окружении. Сигнал FRET, соответствующий определенному месту на изображении микроскопа, обеспечивает дополнительную точность определения расстояния, превышающую оптическое разрешение (~ 0.25 мм) светового микроскопа. Помимо пространственной близости, для того, чтобы иметь место эффективный FRET, пара красителей FRET должна также демонстрировать значительное перекрытие спектра возбуждения донора со спектром поглощения акцептора. Именно эта характеристика составляет один из экспериментальных парадоксов FRET:

.
  • Спектральные профили пары FRET не могут быть разделены настолько, чтобы у нас было плохое перекрытие,
  • , но желательно избежать «перекрестных помех» между двумя каналами формирования изображения, т.е.е. В идеале комплект эмиссионных фильтров донора должен собирать только свет от донора, а не от акцептора, и наоборот.

На практике это может быть достигнуто с помощью коротких полосовых фильтров, которые собирают свет только с более коротковолновой стороны донорного излучения и более длинноволновой стороны акцепторного излучения. Это может несколько ограничить поток фотонов как от донора, так и от акцептора во время типичного экспонирования, особенно если учесть, что эти измерения лучше всего проводить в условиях пониженной мощности возбуждения, так что мы не увеличиваем скорость обесцвечивания.Это означает, что для экспериментов FRET требуются сверхчувствительные детекторы.
Примеры пар красителей FRET включают:

  • BFP-GFP
  • CFP-DSRED
  • BFP-GFP
  • Cy3-Cy5
  • CFP-YFP
  • Алекса488-Алекса555
  • Алекса488-Cy3
  • Алекса594-Алекса647
  • FITC-TRITC
  • Тербий (III) -Флуоресцеин
  • DiSBAC4 (3) -CC2-DMPE (пара FRET, чувствительная к напряжению)

Профиль пары красителей CFP-YFP FRET показан ниже:

Спектральные профили поглощения и излучения пары CFP-YFP FRET.

Камеры

Andor iXon EMCCD, будь то в качестве ключевого компонента платформы конфокальной визуализации живых клеток Dragonfly или в составе другой конфокальной системы, представляют собой хорошо зарекомендовавшие себя детекторные решения для получения изображений FRET. EMCCD обеспечивает высокое разрешение и высокое отношение сигнал / шум (S / N) для определения взаимодействий FRET по всей отображаемой области или объему клетки и помогает устранить низкие уровни фотонов, присутствующие при использовании узкополосных фильтров. В сочетании с тщательным выбором наборов фильтров это обеспечивает высокую целостность данных FRET.Поскольку EMCCD преодолевают предел обнаружения минимального уровня шума при любой скорости считывания, молекулярные взаимодействия можно отслеживать динамически с высокой точностью. Кроме того, мощность возбуждения часто может быть уменьшена, а это означает, что фототоксические эффекты и эффекты фотообесцвечивания сведены к минимуму, так что молекулярные взаимодействия могут отслеживаться в течение гораздо более длительных периодов. Для получения дополнительной информации о выборе детектора для исследования одиночных молекул, пожалуйста, просмотрите статью Какой детектор является лучшим для исследований одиночных молекул?

1. О, H-K et al. (2019) Быстрое и простое обнаружение охратоксина A с использованием флуоресцентного резонансного переноса энергии при иммуноанализе бокового потока (FRET-LFI) Toxins 11 (5), 292; https://doi.org/10.3390/toxins11050292
2. Hu J. et al (2018) Объединение антенн из наночастиц золота с резонансным переносом энергии флуоресценции одиночных молекул (smFRET) для изучения динамики шпильки ДНК Nanoscale, 10, 6611-6619 10.1039 / C7NR08397A
3. Чаурасия К.Р., Дама Р.Т. (2018) Одномолекулярный FRET-анализ ДНК-связывающих белков.В: Peterman E. (eds) Single Molecule Analysis. Методы в молекулярной биологии, том 1665. Humana Press, New York, NY
4. Юнг С. и др. (2018), Мониторинг в реальном времени состояния связывания / диссоциации и окислительно-восстановительного состояния ионов одного переходного металла. Бык. Korean Chem. Soc., 39: 638-642. DOI: 10.1002 / bkcs.11443

% PDF-1.4 % 64 0 объект > endobj xref 64 71 0000000016 00000 н. 0000001768 00000 н. 0000002624 00000 н. 0000002877 00000 н. 0000003117 00000 п. 0000003408 00000 н. 0000003947 00000 н. 0000004330 00000 н. 0000004789 00000 н. 0000004985 00000 н. 0000005054 00000 н. 0000005298 00000 п. 0000005543 00000 н. 0000007640 00000 н. 0000007977 00000 н. 0000008348 00000 п. 0000008388 00000 н. 0000008781 00000 н. 0000011964 00000 п. 0000012195 00000 п. 0000012624 00000 п. 0000012646 00000 п. 0000013803 00000 п. 0000014127 00000 п. 0000014544 00000 п. 0000015008 00000 п. 0000015138 00000 п. 0000015420 00000 н. 0000015809 00000 п. 0000016024 00000 п. 0000018016 00000 п. 0000018333 00000 п. 0000018565 00000 п. 0000018666 00000 п. 0000018932 00000 п. 0000019612 00000 п. 0000019919 00000 п. 0000020444 00000 п. 0000020466 00000 п. 0000021535 00000 п. 0000022239 00000 п. 0000022491 00000 п. 0000022808 00000 п. 0000023049 00000 п. 0000023132 00000 п. 0000023564 00000 п. 0000024190 00000 п. 0000024760 00000 п. 0000024960 00000 п.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *