На лада х рей: LADA XRAY кроссовер — Официальный сайт LADA

2 • J (λ) • η-4 • QD] 1/6

, в котором κ -квадрат — коэффициент, описывающий относительную ориентацию в пространстве между переходными диполями донора и акцептора, Дж (λ) — интеграл перекрытия в области излучения донора. и спектры поглощения акцептора (с длиной волны, выраженной в нанометрах), η представляет показатель преломления среды, а Q (D) представляет собой квантовый выход донора.

Эффективность передачи энергии, E (T) , является мерой доли фотонов, поглощенных донором, которые передаются акцептору, и связана с расстоянием разделения донора и акцептора, r , соотношением уравнение:

r = R0 • [(1 / ET) — 1] 1/6

и E (T) вычисляется как:

ET = 1 — (τDA / τD)

, где τ (DA) — время жизни донора в присутствии акцептора, а τ (D) — время жизни донора в отсутствие акцептора.Следовательно, измеряя время жизни донорной флуоресценции в присутствии и в отсутствие акцептора (что указывает на степень тушения донора из-за акцептора), можно определить расстояние, разделяющее молекулы донора и акцептора. Во многих обычно применяемых методах эффективность передачи энергии определяется путем измерения в установившемся режиме относительной средней интенсивности флуоресценции донора в присутствии и в отсутствие акцептора (а не путем измерения времени жизни).

Таким образом, скорость передачи энергии зависит от степени перекрытия спектров между спектрами излучения донора и поглощения акцептора (см. Рисунок 4), квантового выхода донора, относительной ориентации дипольных моментов перехода донора и акцептора, и расстояние, разделяющее молекулы донора и акцептора. Любое событие или процесс, которые влияют на расстояние между донором и акцептором, будут влиять на скорость резонансной передачи энергии, что позволяет количественно оценить явление при условии, что артефакты можно контролировать или устранять.

На рисунке 4 представлены спектры поглощения и излучения голубого флуоресцентного белка ( CFP , донор) и красного флуоресцентного белка ( RFP или DsRed , акцептор) по сравнению с их потенциальным применением в качестве пара резонансного переноса энергии флуоресценции. Спектры поглощения для обоих биологических пептидов показаны красными кривыми, а спектры испускания представлены синими кривыми. Область перекрытия спектров излучения донора и поглощения акцептора представлена ​​серой областью у основания кривых.Всякий раз, когда спектральное перекрытие молекул слишком сильно увеличивается, возникает явление, известное как спектральное просачивание или кроссовер , в котором сигнал от возбужденного акцептора (возникающий из возбуждающего освещения донора) и излучение донора обнаруживаются в акцепторный канал излучения. Результатом является высокий фоновый сигнал, который необходимо выделить из излучения слабой флуоресценции акцептора.

Основная теория безызлучательного переноса энергии напрямую применима к паре донор-акцептор, разделенной фиксированным расстоянием, и в этом случае скорость передачи энергии является функцией расстояния Ферстера, R (0) , которое в свою очередь зависит от κ -квадрат, Дж (λ) , η и Q (D) .Если эти факторы известны, можно рассчитать расстояние между донором и акцептором. Для описания таких ситуаций, как множественные акцепторные хромофоры и распределения расстояний, требуются более сложные формулировки. В таблице 1 представлена ​​серия экспериментально измеренных критических расстояний Фёрстера, которые были установлены из спектрального перекрытия нескольких популярных пар донорно-акцепторных флуорофоров. Поскольку переменная включает выход донорного кванта и степень спектрального перекрытия, оба из которых зависят от локализованных условий окружающей среды, значения расстояния Ферстера должны определяться в тех же экспериментальных условиях, что и те, которые используются для исследования резонансного переноса энергии.

Показатель преломления среды передачи энергии обычно известен из состава растворителя или может быть оценен для конкретной макромолекулы и обычно принимается равным 1,4 в водном растворе. Квантовый выход донора определяется путем сравнения со стандартными флуорофорами с известным квантовым выходом. Поскольку Q (D) появляется как шестой корень при вычислении R (0) , небольшие ошибки или неопределенности в значении Q (D) не имеют большого влияния на расчет расстояния Ферстера.Также из-за зависимости корня шестой степени, R (0) не сильно зависит от вариаций J (λ) , но интеграл перекрытия все равно должен оцениваться для каждой пары донор-акцептор. В общем, более высокая степень перекрытия между спектром излучения донора и спектром поглощения акцептора дает более высокие значения критического расстояния Ферстера.

Критическое расстояние Фёрстера для обычных пар донор-акцептор RET

Донор	Акцептор	Расстояние Ферстера (нанометры)
Триптофан	Дансил	2. 1
ИАЭДАНЫ (1)	ДДПМ (2)	2,5 — 2,9
BFP	DsRFP	3,1 — 3,3
Дансил	FITC	3,3 — 4,1
Дансил	Октадецилродамин	4.3
CFP	GFP	4.7 — 4,9
CF (3)	Техасский красный	5.1
Флуоресцеин	Тетраметилродамин	4,9 — 5,5
Cy3	Cy5	> 5,0
GFP	YFP	5,5 — 5,7
BODIPY FL (4)	BODIPY FL (4)	5.7
Родамин 6G	Малахитовый зеленый	6.1
FITC	Эозин тиосемикарбазид	6,1 — 6,4
B-фикоэритрин	Cy5	7. 2
Cy5	Cy5.5	> 8,0

(1) 5- (2-иодацетиламиноэтил) аминонафталин-1-сульфоновая кислота
(2) N- (4-диметиламино-3,5-динитрофенил) малеимид
(3) карбоксифлуоресцеинсукцинимидиловый эфир
(4) 4,4-дифтор-4-бора-3a, 4a-диаза-s-индацен

Таблица 1

Неопределенность в оценке фактора ориентации ( κ -квадрат) широко обсуждалась в литературе, и, несмотря на экспериментальные доказательства того, что теория Фёрстера действительна и применима к измерению расстояний, эта переменная продолжает оставаться в силе. несколько спорно.Важно понимать, что расстояния Ферстера обычно приводятся для предполагаемого значения κ в квадрате, обычно это динамически усредненное значение 2/3 (0,67). Это предполагаемое значение является результатом рандомизации ориентации донора и акцептора за счет вращательной диффузии до передачи энергии. Фактор ориентации зависит от относительной ориентации в пространстве диполя излучения донора и диполя поглощения акцептора и может варьироваться от нуля до 4. Значение 1 соответствует параллельным диполям перехода, а значение 4 соответствует диполям, которые оба являются параллельные и коллинеарные.

Из-за отношения корня шестой степени к расстоянию Ферстера, изменение коэффициента ориентации от 1 до 4 приводит только к 26-процентному изменению рассчитанного расстояния, а максимальная погрешность в 35 процентов возможна, когда обычно принимаемое значение 0,67 применяется. Наиболее серьезная потенциальная ошибка возникает, если диполи ориентированы точно перпендикулярно друг другу и соответствующее значение в квадрате κ становится равным нулю. Было использовано несколько методов работы с неопределенностью, включая предположение, что существует ряд статических ориентаций, которые не изменяются в течение времени жизни флуорофора в возбужденном состоянии.Измерения анизотропии флуоресценции для донора и акцептора могут позволить определить пределы для вариации κ в квадрате. Кроме того, использование флуорофоров с низкой поляризацией флуоресценции (из-за излучения нескольких перекрывающихся переходов) снижает неопределенность фактора ориентации. Ограничение возможных значений κ в квадрате таким образом снижает потенциальную ошибку вычисления расстояния до 10 процентов.

Во многих случаях фактор ориентации трудно, если вообще возможно, определить, а точное значение переменной часто рассматривается как непреодолимая проблема.Однако некоторые данные указывают на ограничение важности фактора в расчетах резонансного переноса энергии. Сравнение донорных и акцепторных расстояний с использованием резонансной спектроскопии переноса энергии и рентгеновской дифракции в значительной степени подтверждает обоснованность принятия значения 0,67 для фактора (как предлагается теорией Фёрстера), по крайней мере, для небольших пептидов и белков. Большая неопределенность существует для более крупных белков. Использование этого значения для фактора ориентации допустимо при предположении, что зонды донора и акцептора могут свободно совершать неограниченное изотропное движение.Дальнейшее обоснование получено из экспериментальных доказательств того, что для флуорофоров, прикрепленных одинарной или двойной связью к макромолекулам, сегментарные движения донора и акцептора имеют тенденцию приводить к динамически рандомизированным ориентациям.

Для слабосвязанных флуорохромов свободное вращательное движение вокруг одинарных связей должно позволить использовать среднее значение ориентации, но неограниченное движение молекул, связанных через несколько сайтов связывания, вероятно, не происходит. С другой стороны, крайние значения нуля и 4 для κ -квадрат требуют полной поляризации флуоресценции донора и акцептора, а это условие маловероятно.Статистические расчеты были представлены некоторыми исследователями, которые утверждают, что расстояния распределения донор-акцептор и их ориентация определяют наблюдаемое среднее расстояние. При условии, что наблюдается некоторое распределение наблюдаемого расстояния (и это не ограничивается слишком близкими расстояниями донора и акцептора относительно R (0) ), можно надежно получить среднее расстояние между флуорофорами и оценить погрешность, обусловленную фактором ориентации. .

Зависимость фактора ориентации ( κ в квадрате) от относительной ориентации диполя излучения донора и диполя поглощения акцептора (показано на рисунке 5) дается уравнением:

2 = (cos θT — 3cos θDcos θA) 2 = (sin θD sin θAcos Φ — 2cos θDcos θA) 2

, где θ (T) — угол между диполем перехода излучения донора и диполем перехода поглощения акцептор, θ (D) и θ (A) — это углы между этими диполями и вектором, соединяющим донор и акцептор, а Φ — угол между плоскостями, содержащими два переходных диполя.

Эффективность передачи энергии наиболее чувствительна к изменениям расстояния, когда расстояние между донорами и акцепторами приближается к расстоянию Ферстера ( R (0) ) для двух молекул. Рисунок 6 иллюстрирует экспоненциальную зависимость между эффективностью переноса и расстоянием, разделяющим донор и акцептор. Эффективность быстро увеличивается до 100 процентов, когда расстояние разделения уменьшается ниже R (0) , и, наоборот, уменьшается до нуля, когда r больше, чем R (0) .Из-за сильной (шестой степени) зависимости эффективности переноса от расстояния измерения расстояния разделения донор-акцептор надежны только в том случае, если радиус донора и акцептора находится в пределах расстояния Ферстера в два раза. Когда r составляет приблизительно 50 процентов от R (0) , эффективность резонансной передачи энергии близка к максимальной, и более короткие расстояния не могут быть надежно определены. Когда расстояние донор-акцептор превышает значение R (0) на 50 процентов, наклон кривой настолько пологий, что более длинные разделительные расстояния не разрешаются.

Практическое значение критического расстояния Ферстера состоит в том, что это значение дает представление о диапазоне расстояний разделения, которые могут быть определены FRET для данной пары датчиков (см. Таблицу 1). Поскольку измерение передачи энергии очень чувствительно к изменению расстояния, когда расстояния донор-акцептор близки к расстоянию Ферстера, приблизительные размеры целевого молекулярного взаимодействия являются наиболее важным фактором при выборе пары флуоресцентных красителей.Другие факторы, которые следует учитывать в зависимости от того, проводятся ли измерения в установившемся режиме или с временным разрешением, включают химическую стабильность, квантовый выход и время жизни распада флуорофора. Поскольку для обычных методов флуоресцентного резонансного переноса энергии не существует внутреннего эталона расстояния, расстояния, рассчитанные путем измерения эффективности переноса, относятся к расстоянию Ферстера, которое выводится из спектроскопических данных, измеренных на парах донор-акцептор.

Явление резонансной передачи энергии с помощью механизма Ферстера сложно в некоторых аспектах, но простое и надежное по своему результирующему эффекту.Расстояния Ферстера точно предсказываются из спектральных свойств донора и акцептора, и, поскольку никаких исключений из теории еще не выявлено, можно предположить, что резонансная передача энергии происходит при любых условиях, при которых пара молекулы донор-акцептор находится в непосредственной близости. Сложность теории, описывающей перенос диполя, возникает не из-за самого механизма передачи, а из-за наличия распределений расстояний (включая неслучайные распределения) и диффузии молекул донора и акцептора.Когда предпринимаются шаги для усреднения зависимости передачи энергии от расстояния по диапазону геометрий и временных рамок, FRET представляет собой надежный метод исследования пространственного распределения между взаимодействующими молекулами.

Применение методов FRET в оптической микроскопии

Параметры конфигурации микроскопа для исследований флуоресцентного резонансного переноса энергии меняются в зависимости от требований флуорофоров, образца и режима (-ов) визуализации, но практически любой вертикальный или инвертированный микроскоп можно модернизировать для FRET-микроскопия (см. Рисунок 7).Как правило, микроскоп должен быть оснащен охлаждаемой и усиленной системой CCD-камеры с высоким разрешением (12 бит), связанной с качественными интерференционными фильтрами, имеющими низкие уровни перекрестных помех (минимальный уровень блокировки) и полосы пропускания, соответствующие спектрам флуорофора. Чувствительность детектора определяет, насколько узкой может быть полоса пропускания фильтра, при этом сбор данных может продолжаться с приемлемой скоростью с минимальным спектральным сквозным шумом. В большинстве случаев для получения изображений следует использовать одно дихроматическое зеркало, соединенное с колесами или ползунками фильтров возбуждения и излучения, чтобы минимизировать или исключить сдвиги изображения.

Широкопольная флуоресцентная микроскопия страдает от излучения флуорофора, возникающего выше и ниже фокальной плоскости, что приводит к получению изображений со значительным расфокусированным сигналом, который снижает контраст и приводит к ухудшению качества изображения. Эта проблема усугубляется в микроскопии FRET из-за изначально низких уровней сигнала, возникающих в результате резонансной передачи энергии. Методы цифровой деконволюции могут быть связаны с оптическим секционированием, чтобы уменьшить или исключить сигналы вдали от фокальной плоскости, но этот процесс требует больших вычислительных ресурсов и может быть недостаточно быстрым для многих экспериментов по динамической визуализации FRET.Конфокальные методы лазерного сканирования могут применяться к FRET-микроскопии для значительного улучшения латерального разрешения, позволяя собирать последовательные оптические срезы с интервалами, приближающимися к реальному времени. Основным недостатком конфокальной микроскопии является ограничение длин волн возбуждения стандартными лазерными линиями, доступными для конкретной системы, что ограничивает выбор пар флуорофора донора и акцептора в экспериментах по резонансному переносу энергии. Многофотонное возбуждение также может использоваться в сочетании с методами FRET и меньше повреждает клетки из-за задействованных более длинных волн возбуждения. Кроме того, артефакты автофлуоресценции и фотообесцвечивание образца с меньшей вероятностью возникают в ограниченном объеме возбуждения, характерном для многофотонного возбуждения.

Типичная конфигурация микроскопа, позволяющая наблюдать живые клетки в культуре с несколькими мотивами изображения флуоресцентного резонансного переноса энергии, представлена ​​на рисунке 7. Инвертированный микроскоп для культуры тканей оснащен стандартной вольфрам-галогенной лампой на столбе для исследования и записи. ячейки, использующие стандартное светлое поле, фазово-контрастное или дифференциально-интерференционное ( DIC ) освещение.Обратите внимание, что последние два метода усиления контраста могут использоваться в сочетании с флуоресценцией для выявления пространственного расположения флуорофоров в клеточной архитектуре. К тринокулярной головке микроскопа крепится стандартная система CCD-камеры с охлаждением Пельтье, обеспечивающая широкополосную флуоресценцию и получение изображений в светлом поле.

Эксперименты по резонансной передаче энергии проводятся с использованием мультиспектрального освещения с использованием либо широкопольного освещения (дуговая разрядная лампа), либо конфокальной сканирующей приставки в реальном времени, оснащенной высокоскоростной дисковой системой Нипкова.Луч аргонно-криптонового лазера сначала фильтруется через акустооптическое устройство с перестраиваемой длиной волны для выбора конкретных длин волн возбуждения перед прохождением к конфокальной сканирующей головке. Изображения собираются с помощью двух охлаждаемых CCD-камер высокого разрешения Gen III с усиленным охлаждением, считывающих отдельные каналы, и передаются в буфер на главный компьютер. Сканирование образца в боковой ( x и y ) и осевой ( z ) плоскостях позволяет собирать оптические срезы для восстановления трехмерного изображения.Различные программы обработки изображений совместимы с проиллюстрированной конфигурацией микроскопа.

Основываясь на фундаментальных принципах этого явления, при проведении измерений резонансного переноса энергии флуоресценции с помощью оптического микроскопа следует учитывать ряд важных практических моментов:

• Необходимо тщательно контролировать концентрации донорных и акцепторных флуорофоров. Статистически самая высокая вероятность достижения резонансного переноса энергии флуоресценции происходит, когда несколько акцепторных молекул окружают одну донорную молекулу.
• Фотообесцвечивание необходимо устранить, поскольку артефакт может изменить молекулярное соотношение донора и акцептора и, следовательно, измеренное значение процесса резонансной передачи энергии.
• Спектр излучения донорной флуоресценции и спектр поглощения акцептора должны иметь значительную область перекрытия.
• Прямое возбуждение акцептора в диапазоне длин волн, используемом для возбуждения донора, должно быть минимальным. Распространенным источником ошибок в измерениях с помощью FRET-микроскопии в установившемся режиме является обнаружение донорной эмиссии с помощью наборов акцепторных фильтров.
• Длины волн излучения как донора, так и акцептора должны совпадать с максимальным диапазоном чувствительности детектора.
• Спектры поглощения и излучения донора должны иметь минимальное перекрытие, чтобы уменьшить возможность самопереноса от донора к донору.
• Донорная молекула должна быть флуоресцентной и иметь достаточно длительный срок службы, чтобы произошла резонансная передача энергии.
• Донор должен обладать низкой поляризационной анизотропией, чтобы минимизировать неопределенности в значении фактора ориентации (-квадрат).Этому требованию удовлетворяют доноры, испускание которых происходит в результате нескольких перекрывающихся переходов возбуждения.
• При использовании методов маркировки антител не следует изменять биологическую активность реагентов, конъюгированных с донорными и акцепторными флуорохромами. Любое снижение активности серьезно повлияет на достоверность результатов измерений резонансной передачи энергии.
• Поскольку флуоресцентный резонансный перенос энергии требует, чтобы молекулы донора и акцептора имели соответствующее дипольное выравнивание и располагались в пределах 10 нанометров друг от друга, необходимо учитывать третичную структуру реагентов, к которым присоединены молекулы.Например, когда донорно-акцепторные молекулы могут быть присоединены к различным структурным местоположениям (таким как карбокси или аминоконце) на белке, возможно, что FRET не будет наблюдаться, даже если белки действительно взаимодействуют, потому что молекулы донора и акцептора расположены на противоположных концах взаимодействующих молекул.
• Живые клетки, помеченные зелеными флуоресцентными мутантами белка для исследований FRET, должны быть проанализированы с использованием традиционных иммуногистохимических методов, чтобы убедиться, что меченый белок принимает ту же внутриклеточную среду обитания и свойства, что и нативный аналог.

Для того, чтобы явление флуоресцентного резонансного переноса энергии предоставило значимые данные в качестве инструмента в оптической микроскопии, необходимо оптимизировать как подготовку образца, так и параметры визуализации. Выбор подходящих донорных и акцепторных зондов и способа их использования в качестве молекулярных меток является серьезной проблемой. Кроме того, как только стратегия маркировки, которая разрешает передачу энергии, была разъяснена, широкий спектр методов может быть использован для выполнения самого измерения.Большинство количественных исследований флуоресцентной микроскопии проводится путем измерения интенсивности флуоресцентного излучения. Детектирование FRET на основе интенсивности флуоресценции обычно достигается путем отслеживания изменений относительных величин интенсивности излучения на двух длинах волн, соответствующих донорному и акцепторному хромофорам. Когда условия подходят для возникновения резонансного переноса энергии флуоресценции, увеличение эмиссии акцептора ( I (A) ) сопровождается одновременным уменьшением интенсивности эмиссии донора ( I (D) ).

Хотя изменение относительной интенсивности излучения донора или акцептора можно рассматривать как показатель резонансного переноса энергии, обычно используется отношение двух значений: I (A) / I (D) , как мера FRET. Величина отношения зависит от среднего расстояния между парами донор-акцептор и нечувствительна к различиям в длине пути и объёме, доступном для возбуждающего светового луча. Любое состояние образца, которое вызывает изменение относительного расстояния между парами молекул, приводит к изменению соотношения испускания донора и акцептора.Следовательно, FRET можно наблюдать в микроскоп путем преимущественного возбуждения донорного флуорофора и обнаружения повышенного излучения взаимодействующего акцепторного флуорофора, сопровождаемого уменьшением флуоресценции донора, вызванным тушением из-за передачи энергии. Измерение FRET с использованием подхода мониторинга интенсивности называется стационарным флуоресцентным резонансным переносом энергии.

Соответствующие донорные и акцепторные зонды выбираются на основе их спектральных характеристик поглощения и излучения.Для максимальной резонансной передачи энергии спектр излучения донора должен существенно перекрывать спектр поглощения акцептора. Кроме того, должно быть минимальное прямое возбуждение акцепторного флуорофора в максимуме возбуждения донора, и не должно быть значительного перекрытия излучения между донором и акцептором в области длин волн, в которой происходит излучение акцептора. На практике может быть сложно идентифицировать пары донор-акцептор, удовлетворяющие этим требованиям.Ситуация часто осложняется тем фактом, что имеющиеся в продаже наборы флуоресцентных фильтров не полностью эффективны в пропускании только желаемых длин волн, и может передаваться небольшой процент света за пределами проектной полосы пропускания. Если не используются очень хорошо охарактеризованные и контролируемые системы экспрессии, может быть трудно определить точную концентрацию донорных и акцепторных флуорофоров. Дополнительные корректировки могут также потребоваться для автофлуоресценции, фотообесцвечивания и фоновой флуоресценции.

Типичное исследование внутриклеточной белковой ассоциации в живой культуре клеток проиллюстрировано на рисунке 8 для событий, связанных с апоптозом, физическим процессом гибели клеток в результате сложного каскада последовательных взаимодействий. Генные продукты, непосредственно участвующие в цепочке событий, могут быть помечены путем слияния с соответствующими членами семейства флуоресцентных белков (в данном случае BFP и GFP) для совместной экспрессии в одной и той же клетке, чтобы исследовать специфические ассоциации с помощью FRET.Белки, участвующие в апоптозе, взаимодействуют внутри митохондрий и демонстрируют постепенное уменьшение связывания по мере того, как происходит запрограммированная гибель клеток. Таким образом, изображение эмиссии донора (рисунок 8 (a)) содержит только флуоресценцию от белков, меченных BFP, в то время как соответствующий профиль эмиссии акцептора (рисунок 9 (b)) иллюстрирует сигналы, обусловленные белками, меченными GFP (и некоторый вклад от белков, меченных GFP). донорская эмиссия). Фильтр FRET (рис. 8 (c)), как описано ниже, выявляет флуоресценцию, полученную в результате резонансного переноса энергии между двумя белками

Среди факторов, которые могут потенциально повлиять на точность измерений резонансного переноса энергии флуоресценции в целом, некоторые из них очень специфичны. к оптическому микроскопу.Основной целью микроскопических исследований является получение изображений с высоким разрешением, и это требует особого внимания к качеству и характеристикам оптических фильтров, используемых для спектрального различения длин волн поглощения и излучения донора и акцептора. Чтобы максимизировать отношение сигнал / шум (без вредного воздействия на образец или исследуемый процесс), необходимо тщательно сбалансировать интенсивность и время воздействия возбуждающего света с концентрацией донорных и акцепторных флуорофоров и детектора. эффективность.Если концентрация донорно-акцепторных флуорофоров чрезмерна, может произойти самотушение, влияющее на точность измерений FRET. Фотообесцвечивание является проблемой всех флуорофоров и может повлиять на соотношение донор-акцептор, изменяя измерения флуоресценции. Избыточная интенсивность освещения также может повредить образцы, особенно содержащие живые клетки или ткани.

Метод, известный как донорский фотообесцвечивающий резонансный перенос энергии флуоресценции ( pbFRET ), который использует процесс фотообесцвечивания для измерения FRET, часто применяется при исследовании фиксированных образцов.Основанный на попиксельном анализе, этот метод был применен для измерения отношений близости между белками клеточной поверхности, меченными моноклональными антителами, конъюгированными с флуорофором. Фотообесцвечивание FRET основано на теории, согласно которой флуорофор чувствителен к фотоповреждению только тогда, когда он находится в возбужденном состоянии. Статистически только небольшая часть молекул находится в возбужденном состоянии в любой момент времени, и поэтому флуорофоры с более длительным временем жизни флуоресценции имеют более высокую вероятность фотоповреждения и демонстрируют более высокую скорость фотообесцвечивания.

Экспериментальные данные, подтверждающие эту концепцию, продемонстрировали, что время фотообесцвечивания флуорофора обратно пропорционально времени его жизни в возбужденном состоянии. Возникновение резонансной передачи энергии снижает время жизни флуоресценции молекулы донора, эффективно защищая ее от фотообесцвечивания. Расчеты pbFRET основаны на уменьшении скорости фотообесцвечивания донора по сравнению с измеренной для донора в отсутствие резонансной передачи энергии. Измерение фотообесцвечивания в исследованиях FRET требует относительно длительного периода времени и поэтому наиболее применимо к образцам фиксированных клеток, в которых временные данные не важны, а влияние фотообесцвечивания на функцию клеток не является проблемой.В некоторых отношениях методика фотообесцвечивания доноров менее сложна, чем измерение сенсибилизированного излучения, хотя подгонка постоянных времени к кривым фотообесцвечивания, включающим несколько компонентов, представляет некоторые дополнительные трудности.

Эффективность передачи энергии также может быть определена с помощью методов фотообесцвечивания акцептора , в которых изменение тушения донорной эмиссии измеряется путем сравнения значения до и после селективного фотообесцвечивания акцепторной молекулы.Анализ изменения интенсивности флуоресценции донора в одних и тех же областях образца до и после удаления акцептора имеет то преимущество, что требует подготовки только одного образца, и напрямую связывает эффективность передачи энергии с флуоресценцией как донора, так и акцептора.

Точное измерение резонансного переноса энергии флуоресценции в микроскопе требует компенсации всех потенциальных источников ошибок. Был разработан простой метод корректировки обнаружения донорной флуоресценции с помощью фильтра эмиссии акцептора и флуоресценции акцептора с фильтром эмиссии донора (из-за кроссовера или спектрального просвечивания).Метод также корректирует зависимость FRET от концентраций донорных и акцепторных флуорофоров. Стратегия измерения, которая требует минимум спектральной информации, использует комбинацию из трех наборов фильтров и может быть легко реализована. Наборы фильтров донора, FRET и акцептора предназначены для выделения и максимизации трех конкретных сигналов: флуоресценции донора, флуоресценции акцептора, относящейся к FRET, и флуоресценции непосредственно возбужденного акцептора, соответственно. На практике три разных образца, содержащие только донор, только акцептор, и донор, и акцептор, исследуются с каждым из трех наборов фильтров, и полученные данные обрабатываются арифметически для корректировки кроссовера и неконтролируемых изменений концентраций донор-акцептор.

На рисунке 9 представлены схематические иллюстрации кроссовера (спектральное просачивание) и перекрестных помех фильтра, двух важных проблем, которые необходимо преодолеть, чтобы получить количественные результаты в экспериментах по флуоресцентному резонансному переносу энергии. Кроссовер или просачивание проявляется в перекрытии спектра излучения донорной флуоресценции с полосой пропускания интерференционного фильтра излучения акцептора на рисунке 9, в результате чего сигнал излучения донора (нежелательные длины волн) проходит через фильтр излучения.Напротив, перекрестные помехи фильтра описывают минимальный уровень затухания (блокировки) в определенном диапазоне двух фильтров, установленных вместе последовательно, и вызывают беспокойство при согласовании фильтров возбуждения и излучения для наборов флуоресценции. Дихроматические зеркала часто включают в оценку перекрестных помех комбинаций флуоресцентных фильтров. Хотя два эмиссионных фильтра редко устанавливаются на световом пути одновременно, спектры объединены на рисунке 9, чтобы одновременно проиллюстрировать обе концепции.Обратите внимание, что два спектра фильтра (синяя и красная кривые) представляют коэффициент пропускания света интерференционными фильтрами, тогда как кривая излучения донора (зеленый) представляет собой график зависимости интенсивности от длины волны.

Дополнительные факторы, которые потенциально могут привести к значительным ошибкам, также требуют исправления при использовании методов измерения FRET в установившемся режиме. Кроме того, желателен тщательный контроль концентрации донорного и акцепторного флуорофора. Определения концентрации флуорофора можно частично избежать за счет применения измерений флуоресценции с временным разрешением, которые обеспечивают метод получения среднего времени жизни без точного знания концентраций доноров.Метод позволяет количественно определять расстояние разделения донор-акцептор и основан на измерениях времени жизни донора в присутствии и в отсутствие акцептора. Измерение спада интенсивности флуоресценции как функции времени проясняет динамику излучения молекулы в возбужденном состоянии, и, следовательно, может быть получена более подробная информация о природе донорно-акцепторного взаимодействия. Графические графики спада интенсивности иллюстрируют усредненные по времени детали процесса затухания флуоресценции (см. Рисунок 10 (а)), которые не разрешаются при использовании методов устойчивого состояния.Измерения, показывающие одно и то же значение средней продолжительности жизни, когда они записываются как интенсивность в установившемся режиме, нормированная на поглощение, могут соответствовать существенно разным формам кривых затухания на графиках данных с временным разрешением, указывая на различия в участвующих межмолекулярных процессах.

Время жизни флуоресценции ( τ ) флуорофора — это характерное время, в течение которого молекула находится в возбужденном состоянии перед возвращением в основное состояние. Представляя затухание флуоресценции в упрощенной единственной экспоненциальной форме после короткого импульса возбуждающего света, интенсивность флуоресценции как функция времени ( t ) определяется уравнением:

I (t) = I0 exp (-t / τ )

, где I (0) — начальная интенсивность излучения флуоресценции сразу после импульса возбуждающего света, а I (t) — интенсивность флуоресценции, измеренная в момент времени t .Время жизни флуоресценции ( τ ) определяется как время, необходимое для уменьшения интенсивности до 1 / e от ее начального значения (приблизительно 37 процентов от I (0) ; рисунок 10 (a)), и составляет величина, обратная константе скорости затухания флуоресценции из возбужденного состояния в основное.

Основным общим преимуществом измерений FRET с временным разрешением по сравнению с установившимся режимом является то, что расстояние разделения донор-акцептор может быть нанесено на карту с большей количественной точностью.Это происходит отчасти потому, что время жизни флуоресценции не зависит от локальной интенсивности или концентрации и в значительной степени не зависит от фотообесцвечивания флуорофоров. Однако времена жизни флуоресценции очень чувствительны к среде флуорофора, и даже молекулы со сходными спектрами могут проявлять разные времена жизни в разных условиях окружающей среды. Поскольку рассеяние не влияет на время жизни флуорофора, измерения изменения времени жизни могут предоставить информацию, которая конкретно связана с локальными молекулярными процессами.

Срок службы флуорофора может быть изменен множеством переменных в локальном микроокружении, включая такие факторы, как гидрофобность, концентрация кислорода, ионная сила других компонентов среды, связывание с макромолекулами и близость к молекулам акцептора, которые могут истощать возбужденное состояние. состояние за счет резонансной передачи энергии. Значительным практическим преимуществом является то, что измерения времени жизни могут служить абсолютными индикаторами молекулярных взаимодействий и не зависят от концентрации флуорофора.

Два общих метода, обычно используемых для измерения времени жизни флуоресцентных ламп, классифицируются как во временной области ( в импульсном режиме , см. Рисунок 10 (а)) и в частотной области (также называемый с фазовым разрешением ; рисунок 10 (б)) методы. При измерении срока службы во временной области используются источники света с импульсным возбуждением, а время жизни флуоресценции определяется путем прямого измерения сигнала излучения или регистрации с помощью счета фотонов. Подход с частотной областью использует синусоидальную модуляцию источника возбуждающего света (полученную из импульсных или модулированных лазерных систем), а время жизни определяется по фазовому сдвигу и глубине демодуляции сигнала флуоресцентного излучения.Каждый из этих подходов к визуализации времени жизни флуоресценции имеет определенные преимущества и недостатки, и оба широко применяются в традиционной широкопольной, конфокальной и многофотонной микроскопии.

На рисунке 10 показаны схематические диаграммы, представляющие методы временной и частотной области для определения времени жизни флуоресценции. В подходе во временной области (рис. 10 (а)) образец возбуждается коротким импульсом лазерного света, длительность которого намного короче, чем время жизни возбужденных частиц, и измеряется экспоненциальный профиль затухания как функция времени.Затухание флуоресценции обычно является моноэкспоненциальной функцией для одного флуорофора, но может иметь гораздо более сложный характер, если возбужденное состояние имеет многочисленные пути релаксации, доступные в окружающей среде. Синусоидально модулированный свет от лазера непрерывного действия, соединенного с акустооптическим модулятором, используется для возбуждения флуорофора в экспериментах в частотной области (рис. 10 (b)). Результирующее флуоресцентное излучение модулируется синусоидально на той же частоте, что и возбуждение, но сопровождается фазовым сдвигом и уменьшением глубины модуляции.В случае однократного экспоненциального затухания время жизни флуоресценции можно рассчитать, определив либо степень фазового сдвига ( φ ), либо коэффициент модуляции ( M ), используя уравнения, представленные на рисунке 10 (b). Если два значения идентичны, затухание флуоресценции действительно состоит из одной экспоненциальной функции. Когда присутствует более одного флуоресцентного вещества (или один флуорофор находится в сложной среде), фазовый сдвиг и время жизни модуляции следует оценивать в широком диапазоне частот.

Метод измерения времени жизни флуоресценции во временной области в основном основан на подсчете одиночных фотонов и требует системы детектирования с достаточным временным разрешением для сбора почти 100 процентов фотонов, генерируемых каждым импульсом возбуждения. Хотя методы с фазовым разрешением относительно менее требовательны в исполнении, они, как правило, не так чувствительны, как метод подсчета фотонов. Когда фазовая модуляция используется для разрешения сложных времен жизни мультифлуорофоров, длительное время воздействия повреждающего возбуждающего освещения может оказаться чрезмерным для некоторых образцов, а также может не обеспечить достаточного временного разрешения для процессов с живыми клетками.Предпочтительный метод зависит как от информации, необходимой для исследования, так и от типа исследуемого образца.

Измерения времени жизни флуоресценции оказались чувствительным индикатором FRET и имеют особые преимущества при исследованиях живых клеток из-за независимости измерений времени жизни от таких факторов, как концентрация и длина светового пути, которые трудно контролировать в живых образцах. Основное преимущество выполнения FRET-исследований путем измерения времени жизни флуоресценции заключается в том, что можно различать перенос энергии даже между донорно-акцепторными парами с аналогичными спектрами излучения.Когда время жизни флуоресценции измеряется напрямую (в отличие от использования значений в установившемся состоянии), определение FRET возможно без фотодеструкции донорных или акцепторных флуорофоров. Поскольку FRET уменьшает время жизни флуоресценции донорной молекулы за счет передачи энергии акцептору, прямое сравнение времени жизни донора в присутствии акцептора ( τ (DA) ) с временем жизни в отсутствие акцептора ( τ ( D) ), позволяет вычислять значение эффективности FRET ( E (T) ) для каждого пикселя изображения.

В зависимости от метода измерения времени жизни флуоресценции требуют, чтобы образец подвергался воздействию либо высокочастотных повторяющихся импульсов возбуждающего света, либо непрерывного синусоидально модулированного света. В исследованиях с живыми клетками всегда необходимо оценивать эффект интенсивного освещения. Независимо от метода, эталонное время жизни донора без акцептора должно быть определено в экспериментальных условиях, идентичных условиям измерения донор-акцептор.Одним из способов достижения этого с одним образцом является измерение времени жизни только донора после фотообесцвечивания акцептора после эксперимента по передаче энергии.

Выводы

В биологических исследованиях наиболее распространенным применением флуоресцентного резонансного переноса энергии является измерение расстояний между двумя участками макромолекулы (обычно белка или нуклеиновой кислоты) или исследование взаимодействия in vivo между биомолекулярными объектами.Белки могут быть помечены синтетическими флуорохромами или иммунофлуоресцентными флуорофорами, которые служат донором и акцептором, но достижения в генетике флуоресцентных белков теперь позволяют исследователям маркировать определенные целевые белки множеством биологических флуорофоров, имеющих разные спектральные характеристики. Во многих случаях аминокислота триптофан используется в качестве внутреннего донорного флуорофора, который может быть связан с любым количеством внешних зондов, выступающих в качестве акцептора.

Если макромолекулы помечены одним донором и акцептором, а расстояние между двумя флуорохромами не изменяется в течение времени жизни возбужденного состояния донора, то расстояние между зондами можно определить по эффективности передачи энергии в установившемся состоянии. измерения, как описано выше.В случаях, когда расстояние между донором и акцептором колеблется вокруг кривой распределения, например, белковые сборки, мембраны, одноцепочечные нуклеиновые кислоты или развернутые белки (см. Сценарии, представленные на рисунке 11), FRET все еще можно использовать для изучения явлений, но предпочтительны измерения срока службы с временным разрешением. Некоторые биологические применения, которые попадают в оба случая, показаны на рисунке 11, включая конформационные изменения, диссоциацию или гидролиз, слияние мембраноподобных липидных везикул и взаимодействия лиганд-рецептор.

Хотя для измерения резонансного переноса энергии флуоресценции в оптическом микроскопе доступны различные методы, ни один из них не лишен недостатков. Некоторые методы требуют более сложных и дорогостоящих инструментов, в то время как другие основаны на предположениях, которые необходимо тщательно проверять. Некоторые подходы подходят для фиксированных образцов, но не могут применяться к системам живых клеток, в то время как другие методы должны включать значительные корректирующие вычисления или алгоритмы анализа данных.Однако несомненно, что анализ FRET показывает большие перспективы для дальнейшего развития полезности и объема биологических приложений. В последние годы произошли драматические улучшения в инструментарии, особенно в отношении методов с временным разрешением.

Измерения времени жизни флуоресценции, которые раньше выполнялись крайне сложно, теперь поддерживаются зрелыми пикосекундными и наносекундными технологиями. Успехи в разработке флуоресцентных зондов позволили получить более мелкие и более стабильные молекулы с новыми механизмами прикрепления к биологическим мишеням.Были также разработаны флуорофоры с широким диапазоном времени жизни в собственном возбужденном состоянии, и значительные усилия прилагаются к развитию большего разнообразия генетических вариаций флуоресцентных белков. Совершенно новые классы флуоресцентных материалов, многие из которых меньше, чем предыдущие флуорофоры, и позволяют оценивать молекулярные взаимодействия на меньших расстояниях разделения, обещают повысить универсальность мечения и привести к новым применениям метода FRET.

Соавторы

Брайан Херман и Виктория Э.Centonze Frohlich — Департамент клеточной и структурной биологии, Научный центр здравоохранения Техасского университета, 7703 Floyd Curl Drive, Сан-Антонио, Техас 78229.

Joseph R. Lakowicz — Центр флуоресцентной спектроскопии, Департамент биохимии и молекулярной биологии, Университет Мэриленда и Институт биотехнологии Университета Мэриленда (UMBI), 725 West Lombard Street, Baltimore, Maryland 21201.

Thomas J. Fellers и Michael W.Дэвидсон — Национальная лаборатория сильного магнитного поля, 1800 Ист. Пол Дирак, доктор, Университет штата Флорида, Таллахасси, Флорида, 32310.

Платформа гибридных биосенсоров BRET-FRET для оптогенетики, химического скрининга и визуализации in vivo

Плазмида конструкция

Комплементарная ДНК (кДНК), кодирующая mTurquoise, и кДНК, кодирующая mTurquoise-GL, были получены от Joachim Goedhart ⁴³ . кДНК для Turquoise2-GL, mTurquoise2 и Turquoise2 были получены с помощью сайт-специфического мутагенеза с помощью ПЦР.Были введены следующие мутации: I146F (для Turquoise2-GL и mTurquoise2) ⁴³ и K206A (для Turquoise2-GL). Прототип ERK-биосенсора активности FRET, EKAREVnes, состоит из ECFP и YPet для донорных и акцепторных флуоресцентных белков соответственно ¹⁹ . В дальнейшем белки, происходящие из бирюзы, и ECFP вместе называются CFP. Точно так же белки, производные YFP, включая YPet и Venus, вместе называются YFP. Чтобы сконструировать биосенсор hyBRET для активности ERK, hyBRET-ERK, кДНК ECFP в EKAREVnes была заменена на PCR-амплифицированную кДНК, кодирующую слитый белок, состоящий из Turquoise2-GL dC10, Gly-Thr и RLuc8 S257G dN3, с использованием рестрикционного расщепления с последующим перевариванием. путем сборки ДНК с помощью набора для клонирования In-Fusion HD (Takara Bio, Otsu, Japan).Аналогичным образом, CFP в PicchuEV-x ^19,44,45 и RaichuEV-Ras ^19,46 были заменены тандемно связанными Turquoise2-GL dC10 и RLuc8 S257G dN3 с образованием hyBRET-PicchuX и hyBRET-HRas, соответственно. В качестве контроля мы разработали EKAREV-4464, заменив ECFP Turquoise2-GL dC10 из EKAREVnes. Варианты CFP hyBRET-ERK были получены путем замены Turquoise2-GL dC10 в hyBRET-ERK на mTurquoise2 dC10, Turquoise2 dC10 или ECFP dC10 посредством реакции In-Fusion. HyBRET-ERK с парой mVenus-mTurquoise2 был создан путем замены mVenus dC10 на YPet путем лигирования рестрикционных фрагментов.Варианты hyBRET-ERK NanoLuc также были получены реакцией In-Fusion. CeNL, гибридный белок Turquoise2 и NanoLuc, был описан ранее ²² . Для разработки биосенсоров hyBRET для других киназ Ser / Thr сенсорный домен и соответствующий лигандный домен в hyBRET-ERK были заменены на таковые из AKAR3EV, JNKAR1EV и Eevee-S6K путем лигирования рестрикционных фрагментов, генерируя hyBRET-PKA, JNK и S6K, соответственно. . кДНК, кодирующие биосенсоры или флуоресцентные белки, субклонировали в вектор pCAGGS ⁴⁷ или вектор pPBbsr, транспозонный вектор PiggyBac с IRES-bsr (ген устойчивости к бластицидину) ⁴⁸ .Лентивирусный вектор для hyBRET-ERK был сконструирован путем вставки компонентов, кодирующих кДНК hyBRET-ERK, за исключением YPet, в вектор pCSII-EF с IRES-bsr (ген устойчивости к бластицидину) и кодон-оптимизированным YPet для E . coli для подавления рекомбинации между гуманизированным YFP и CFP ⁴⁹ . Затем остаток треонина субстрата ERK в pCSIIbsr-hyBRET-ERK был заменен на аланин для создания устойчивого к фосфорилированию мутанта hyBRET-ERK-TA путем рестрикционного переваривания и последующего лигирования отожженного дуплекса олиго-ДНК.Чтобы сконструировать векторы для стабильной экспрессии биолюминесцентных белков в клетках млекопитающих, кДНК для RLuc8 S257G dN3 была вставлена ​​в вектор CSII-EF с IRES-puro, и кДНК для голубого нано-фонарика и желтого нано-фонаря были амплифицированы с помощью ПЦР и субклонированы в Вектор pPBbsr путем лигирования рестрикционных фрагментов. pCX4puro-CRY2-cRaf и pCX4neo-CIBN-EGFPx были описаны ранее ⁵⁰ . Для создания pCX4puro-mCherry-CRY2-cRaf кДНК, кодирующая mCherry, была амплифицирована с помощью ПЦР и слита с CRY2 в pCX4puro-CRY2-cRaf с помощью реакции In-Fusion.Затем cRaf в pCX4puro-mCherry-CRY2-cRaf был заменен линкером и каталитическим доменом мышиного Sos1 (aa 548–1020) или интер-Sh3 доменом p85 человека (aa 428–621), образуя pCX4puro-mCherry-CRY2- Soscat и pCX4puro-mCherry-CRY2-iSh3 соответственно. pT2ADW-hyBRET-ERK был сконструирован следующим образом: инсулятор D4Z4 был вставлен перед промотором CAG pT2AL200R175-CAGGS-EGFP, несущего сайты рекомбинации Tol2 ⁵¹ . Затем последовательность WPRE pCSII-EF была вставлена ​​перед последовательностью поли А.Наконец, EGFP был заменен кДНК hyBRET-ERK.

Культура клеток и создание стабильных клеточных линий

Клетки HeLa были приобретены в Human Science Research Resources Bank (Sennanshi, Japan). Клетки HCT116 и клетки 4T1 были получены из АТСС (Американская коллекция типовых культур). Клетки Lenti-X 293T были приобретены у Clontech (Маунтин-Вью, Калифорния). Клетки РС9 были любезным подарком от Масато Окада (Университет Осаки, Япония). Клетки HeLa и Lenti-X 293T поддерживали в среде DMEM (Wako Pure Chemical Industries, Осака, Япония).Клетки HCT116 выращивали в среде McCoy 5A (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). Клетки 4T1 и клетки PC9 культивировали в RPMI1640 (ThermoFisher Scientific). Описанная выше среда для выращивания была дополнена 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сывороткой (FBS) (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) и пенициллин / стрептомицин (Nacalai Tesque, Киото, Япония). Все клетки инкубировали во влажной атмосфере с 5% CO2 на воздухе при 37 ° C. Для создания стабильных клеточных линий, экспрессирующих биосенсоры hyBRET с помощью системы транспозонов, клетки котрансфицировали вектором pPB и pCMV-mPBase ⁴⁸ , полученным из Wellcome Trust Sanger Institute.Через день после трансфекции трансфицированные клетки отбирали 20 мкг / мл бластицидина S (InVivoGen, Сан-Диего, Калифорния), а затем культивировали дополнительно в течение по меньшей мере 1 недели. Для получения лентивируса клетки HEK-293T были котрансфицированы вектором pCSII-EF, psPAX2, который был получен от Addgene (плазмида № 12260) и pCMV-VSV-G-RSV-Rev, любезным подарком от Dr. Миёси (RIKEN BioResource Center, Ибараки, Япония) липофекцией с использованием полиэтиленимина «Макс» с молекулярной массой 40 000 (Polyscience Inc., Уоррингтон, Пенсильвания).Среды, содержащие вирус, собирали через 48 часов после трансфекции, фильтровали и концентрировали с помощью PEG6000. Клетки-мишени инфицировали в присутствии 10 мкг / мл полибрена (Nacalai Tesque). Через два дня после заражения инфицированные клетки отбирали с помощью бластицидина S с концентрацией 20 мкг / мл. Основная масса клеток использовалась в последующих анализах.

Реагенты

Диацетилцелентеразин-h синтезировали, как описано ранее ¹⁴ . Целентеразин-h и PD-0325901 были получены от Wako (Осака, Япония).Гефитиниб и AZD6244 были приобретены в компании Symansis (Шанхай, Китай). Анизомицин, dbcAMP и эпидермальный фактор роста были приобретены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури). Реагент для трансфекции 293fectin был получен от ThermoFisher Scientific и использован для липофекции плазмиды в клетки HeLa. Система анализа люциферазы Nano-Glo была приобретена у Promega (Мэдисон, Висконсин), и субстрат для анализа, включенный в набор, использовали в качестве исходного раствора фуримазина. Люциферины, используемые в каждом люминесцентном анализе, перечислены в таблице S3.

Спектроскопия

Для измерения спектров флуоресценции клетки HeLa, экспрессирующие только CFP, только YFP, или биосенсор помещали на 35-миллиметровую стеклянную чашку. Клетки наблюдали с помощью инвертированного микроскопа (IX81; Olympus, Tokyo), снабженного линзой объектива (масляный объектив UPLAPO 100 × / 1,35NA; Olympus). CFP возбуждались фильтром возбуждения FF02-438 / 24 (Semrock) и дихроичным зеркалом FF458-Di02-25×36 (Semrock). YFP возбуждали возбуждающим фильтром S492 / 18X (Chroma) и стеклянным дихроичным зеркалом (Olympus).Спектры флуоресценции регистрировали с интервалами 2 нм с использованием фотонного многоканального анализатора PMA-12 (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japan). Для измерения люминесцентных спектров клетки HeLa, экспрессирующие биосенсор, обрабатывали трипсином и суспендировали в M199 (ThermoFisher Scientific), содержащем 3% FBS и 20 мМ HEPES. К суспензии клеток добавляли 20 мкМ целентеразин-h или 3 мкМ фуримазин для регистрации спектров люминесценции с помощью PMA-12. Полученные спектры флуоресценции и люминесценции были использованы для оценки эффективности передачи энергии биосенсорами.

Оценка эффективности передачи энергии

Для оценки эффективности передачи энергии спектры флуоресценции и биолюминесценции биосенсора hyBRET были подогнаны к теоретическим спектрам излучения, по существу, как сообщалось ранее ²⁰ . Для нелинейной регрессии использовались метод Лербенберга-Марквардта, реализованный в функции nlinfit в MATLAB (MathWorks, Натик, Массачусетс) и функции решателя в Microsoft Excel (Microsoft Corporation, Редмонд, Вашингтон). Теоретические спектры флуоресценции описываются следующим уравнением:

$$ {\ rm {F}} (\ lambda) = {\ varepsilon} _ {c} ({\ lambda} _ {ex}) \ {(1- {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {C} \ times {f} _ {C} (\ lambda) + {E} _ {CY} \ times {\ varphi} _ {Y} \ раз {f} _ {Y} (\ lambda) \} + {\ varepsilon} _ {Y} ({\ lambda} _ {ex}) \ times {\ varphi} _ {Y} \ times {f} _ { Y} (\ lambda), $$

(1)

где F ( λ ) — флуоресценция на длине волны λ, ε _c ( λ _из ) — коэффициент возбуждения CFP на длине волны возбуждения, E _CY — КПД FRET между CFP и YFP, ϕ _C — квантовая эффективность CFP, f _C ( λ ) — нормированное излучение CFP на длине волны λ, ϕ _Y — квантовая эффективность YFP, f _Y ( λ ) — нормализованное излучение YFP, а ε _Y ( λ _из ) — коэффициент экстинкции YFP на длине волны возбуждения. ε _Y ( λ _из ) значение при 440 нм, которое представляет перекрестное возбуждение YFP ​​в режиме FRET, составляет 2,9% от максимального ε _Y ( λ _из ) значение при 513 нм.

Если предположить, что слияние RLuc8 на С-конце в кадре не изменило физических свойств биосенсоров, теоретические биолюминесцентные спектры описываются следующим уравнением:

$$ \ begin {array} {rcl} { \ rm {B}} (\ lambda) & = & {E} _ {RC} \ times (1- {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {C} \ times {f} _ { C} (\ lambda) + ({E} _ {RY} + {E} _ {RC} \ times {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {Y} \ times {f} _ { Y} (\ lambda) \\ & & + \, (1- {E} _ {RC} — {E} _ {RY}) \ times {\ varphi} _ {R} \ times {f} _ {R } (\ lambda), \ end {array} $$

(2)

где B ( λ ) — интенсивность биолюминесценции на длине волны λ, E _RC — это эффективность BRET между RLuc8 и CFP, E _RY — эффективность BRET между RLuc8 и YFP, ϕ _R — квантовая эффективность RLuc8, а f _R ( λ ) — нормализованное излучение RLuc8.

E _CY был оценен путем нелинейной подгонки измеренных спектров флуоресценции к формуле. 1. E _RC считается постоянным независимо от конформации биосенсора, поскольку линкер между RLuc8 и CFP был оптимизирован для максимизации эффективности BRET и стабилизации структуры слитого белка RLuc8-CFP. Следовательно, E _RC Nano-lantern используется для биосенсора hyBRET.Квантовая эффективность голубого нано-фонаря, ϕ _CNL , выражается следующим уравнением:

$$ {\ varphi} _ {CNL} = {\ varphi} _ {C} \ times {E} _ {RC} + {\ varphi} _ {R} \ times (1- {E} _ {RC}), $$

(3)

Используя данные квантовой эффективности, приведенные в таблице S1, E _RC было определено как 0,13. Наконец, E _RY было оценено путем подгонки измеренных биолюминесцентных спектров к формуле.2. Значения ε и ϕ перечислены в Таблице S1.

Скорости передачи энергии биосенсоров, содержащих NanoLuc, определяли аналогично биосенсорам, содержащим RLuc8, путем нелинейной подгонки измеренных спектров флуоресценции к уравнению. 4.

$$ \ begin {array} {rcl} {\ rm {B}} (\ lambda) & = & {E} _ {NC} \ times (1- {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {C} \ times {f} _ {C} (\ lambda) + ({E} _ {NY} + {E} _ {NC} \ times {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {Y} \ times {f} _ {Y} (\ lambda) \\ & & + \, (1- {E} _ {NC} — {E} _ {NY}) \ times { \ varphi} _ {N} \ times {f} _ {N} (\ lambda), \ end {array} $$

(4)

где B ( λ ) — интенсивность биолюминесценции на длине волны λ, E _NC — это эффективность BRET между NanoLuc и CFP, E _NY — эффективность BRET между NanoLuc и YFP, ϕ _N — квантовая эффективность NanoLuc, а f _N ( λ ) — нормализованное излучение NanoLuc.Обратите внимание, что эффективность BRET между NanoLuc и CFP: E _NC , был также оценен по формуле. 4, установка E _NY и E _CY как ноль.

Покадровая визуализация культивируемых клеток

Покадровые изображения были получены и обработаны с использованием по существу тех же условий и процедур, что и ранее. ⁵² .Вкратце, клетки HeLa, экспрессирующие биосенсоры hyBRET, голодали в течение 3-8 часов с помощью FluoroBrite DMEM (Thermo Fischer Scientific, Уолтем, Массачусетс) с добавлением 0,1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 1 мМ пирувата натрия (Thermo Fischer Scientific), GlutaMax и пенициллина. /стрептомицин. При необходимости голодные клетки обрабатывали стимулом в процессе покадровой визуализации. Клетки получали с помощью инвертированного микроскопа (IX83; Olympus, Токио), оснащенного линзой объектива (масляный объектив UPlanSApo 60 × / 1,35NA; Olympus), системой освещения (световой двигатель Spectra-X; Lumencore, Бивертон, Орегон), Лазерная система автофокусировки IX3-ZDC2 (Olympus), автоматически программируемый XY-столик MD-XY30100T-Meta (SIGMA KOKI, Токио) и инкубатор INUG2F-IX3W (Tokai Hit, Фудзиномия, Япония).В каждом эксперименте использовалась одна из следующих камер: CCD с охлаждением MD-695 (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния), EMCCD с охлаждением iXon Ultra 888 (ANDOR, Белфаст, Великобритания) и EMCCD с охлаждением Rolera Thunder (QImaging, Surey, BC) . Для визуализации FRET клетки подвергали воздействию света 440 нм с интенсивностью света 25 мкВт / см ² в течение 30–200 мс, и получали изображения FRET и CFP. Для визуализации BRET в чашку для культивирования добавляли 20 мкМ коэлентеразин-h или 3 мкМ фуримазин (Promega) перед началом визуализации.Голубое свечение и желтое свечение клеток регистрировали при времени экспозиции от 6 до 30 с, в зависимости от камеры, используемой в каждом эксперименте. Чтобы уменьшить рассеянный свет от микроскопа и окружающей среды во время визуализации BRET, в IX83 был включен режим аппаратного затемнения, верх нагревателя предметного столика был покрыт алюминиевой фольгой, и эксперименты проводились в темной комнате. Дихроичные зеркала и фильтры, использованные в этой работе, представляли собой дихроичное зеркало FF458-Di02-25×36 для CFP и FRET, три эмиссионных фильтра (FF01-483 / 32-25 для CFP и голубой люминесценции, FF01-542 / 27-25 для FRET, YFP и желтое свечение и FF01-624 / 40-25 для mCherry) от Semrock (Рочестер, Нью-Йорк) и стеклянный отражатель U-MREF, используемый в качестве дихроичного зеркала для YFP и mCherry от Olympus.Для визуализации BRET не использовалось дихроичное зеркало.

Обработка изображений

Программное обеспечение Metamorph (Molecular Devices) и программное обеспечение Safir (Roper Scientific France, Lisses, Франция) использовались для уменьшения шума и анализа изображений. После вычитания фона изображения отношения FRET / CFP были созданы и представлены в режиме отображения с модуляцией интенсивности (IMD). В режиме IMD восемь цветов от красного до синего используются для представления отношения FRET / CFP, причем интенсивность каждого цвета указывает среднюю интенсивность каналов FRET и CFP.Для люминесцентных изображений вычитанию фона предшествовало удаление космических лучей и уменьшение шума ⁵³ . Затем были созданы изображения с соотношением желтого / голубого люминесценции таким же образом, как и изображения с соотношением FRET / CFP. Двухволновые изображения, полученные при люминесцентном изображении всего тела, были разделены между желтым и голубым люминесцентными изображениями после удаления шума и вычитания фона. На рис. S7 сигналы от голубого нано-фонарика и желтого нано-фонаря были разделены линейным разделением.

Optogenetics

Клетки HeLa трансфицировали вектором экспрессии для биосенсора hyBRET, pCX4neo-CIBN-EGFP-x и вектором экспрессии для слитого белка CRY2.Через день после трансфекции клетки голодали с помощью FluoroBrite DMEM с добавлением 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA), 1 мМ пирувата натрия и GlutaMAX в течение 3-8 часов. Перед началом визуализации в чашку для культивирования добавляли 20 мкМ коэлентеразин-ч. Канал mCherry использовался для определения фокуса и положения стадии, чтобы не запускать транслокацию через мембрану слитых с CRY2 сигнальных молекул. Визуализацию BRET выполняли, как описано выше. В момент времени 0 клетки освещали светом с длиной волны 490 нм (55 мкВт / см ² ) в течение 100 мс.Чтобы оценить влияние освещения синим светом на соотношение BRET сенсоров hyBRET и интенсивность люминесценции RLuc8, клетки трансфицировали pCAGGS-hyBRET-ERK или pCSIIpuro-RLuc8. На следующий день клетки голодали и получали люминесцентное изображение, как описано выше. Во время визуализации клетки освещали светом 440 нм (200 или 450 мкВт / см ² ) или светом 490 нм (180 мкВт / см ² ) в течение 5 с в заранее определенные моменты времени. Плотность света измеряли измерителем оптической мощности TQ8230 (Advantest).

Анализы на микропланшетном ридере

Клетки, экспрессирующие hyBRET-ERK, высевали на 96-луночные белые планшеты при плотности клеток 3000 клеток / лунку. На следующий день клетки обрабатывали серийно разведенным AZD6244, ингибитором MEK, в течение 20 минут. Цифровой диспенсер HP D300 (Tecan, Männedorf, Швейцария) использовался для разбавления лекарственного средства и добавления в лунку. После обработки лекарственным средством в каждую лунку добавляли среду, содержащую 1 мкМ коелентеразин-h с серийно разведенным ингибитором, и измеряли желтое и голубое свечение с помощью устройства для считывания микропланшетов GloMax Discover (Promega).Фильтр короткого прохода 495 нм использовали для голубой люминесценции, а фильтр длиной 530 нм использовали для желтой люминесценции. В мультиплексном анализе, показанном на рис. 4c – f, среду заменяли 250 мкл FluoroBriteDMEM с добавлением 10% FBS, 1 мМ пирувата натрия, GlutaMAX и пенициллина / стрептомицина после прикрепления клеток ко дну лунки. Через несколько часов после смены среды клетки обрабатывали серийно разведенным гефитинибом в течение 1 дня. Голубое свечение и желтое свечение клеток hyBRET-ERK, обработанных лекарственным средством, измеряли в присутствии 1 мкМ целентеразина-h.{\ prime} = 1- \ frac {3 (S {D} _ {AZD0} + S {D} _ {AZD1})} {Av {e} _ {AZD0} -Av {e} _ {AZD1}} $

(5)

Здесь SD — это стандартное отклонение, а Ave — это среднее значение желтой / голубой люминесценции из 3 лунок, обработанных без AZD6244 (AZD0) или 1 мкМ AZD6244 (AZD1). На рис. 4f теоретические функции, описанные ниже, использовались в качестве модельных функций для соответствия экспериментальным данным, как сообщалось ранее ²⁶ . Уравнения представляют взаимосвязь между активностью ERK и количеством живых клеток.{\ frac {1} {n {H} _ {ERK}}} $$

(7)

Здесь min — минимум, amp — амплитуда, IC50 — это половина максимальной ингибирующей концентрации, а nH — коэффициент Хилла количества живых клеток (L) или активности ERK (ERK). ERK — это соотношение желтого / голубого люминесценции hyBRET-ERK. Поскольку минимумы и амплитуды были однозначно определены из экспериментальных данных, IC50s и nHs были подобраны как свободные параметры.

Образование опухоли ксенотрансплантатом и генерация трансгенных мышей

Самок мышей BALB / c nu / nu в возрасте 7–9 недель (Japan SLC, Hamamatsu, Japan) использовали для образования опухоли ксенотрансплантата.1 × 10 ⁶ клеток HeLa, стабильно экспрессирующих желтый нано-фонарь и голубой нано-фонарь в 50 мкл GelTrex / PBS (1: 1) (ThermoFisher Scientific), вводили подкожно в левый и правый бок мышей. Мышей визуализировали через две недели после трансплантации. Для исследования метастазов опухоли мышам внутривенно вводили 1 × 10 ⁵ клеток опухоли молочной железы мыши 4T1, стабильно экспрессирующих hyBRET-ERK или hyBRET-ERK-TA в PBS в хвостовой вене, и анализировали через 2–3 недели после инъекции опухоли 4T1. .Трансгенных мышей получали с помощью Tol2-опосредованного переноса гена ⁵⁴ . Вкратце, оплодотворенные яйца, полученные от мышей Jcl: B6C3F1 (B57BL / 6N Jcl X C3H / HeN Jcl), микроинъектировали смесью мРНК Tol2 и pT2ADW-hyBRET-ERK. Животных-основателей скрещивали с мышами Jcl: ICR для получения стабильных линий. Новорожденных мышей освещали синим фонариком LEDGFP-3W (Optocode, Tokyo) и проверяли на зеленую или красную флуоресценцию через желтые очки. Протоколы для животных были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Высшей школы медицины Киотского университета (No.10584, 14079, 15064, 16038 и 17539), и методы были выполнены в соответствии с соответствующими директивами и правилами.

Биолюминесцентная визуализация всего тела животных

Для сравнения продолжительности жизни биолюминесценции между аналогами целентеразина-h in vivo (рис. S7) мышей с подкожными опухолями анестезировали изофлураном (1,5% ингаляции, 0,5 л / мин) и внутривенно вводили коэлентеразин-h (80 мкг на мышь) в этаноле / PBS (1: 4) или диацетил-коэлентеразин-h (80 мкг на мышь) / Pluronic F-127 (20% мас. / об. в DMSO) (Biotium, Hayward , CA) (1: 1) растворяли в PBS.Для получения люминесцентных изображений мышей с метастазированными опухолями (рис. 5a – j и S8) мышей анестезировали изофлураном (1,5% ингаляции, 0,5 л / мин) и внутривенно вводили смесь диацетил-целентеразина-h (200 мкг на мышь. ) и носитель или 5,0 мг / кг PD-0325901 в Pluronic F-127 (20% мас. / об. в ДМСО) / PBS (1: 1) (общий объем составлял 100 мкл / мышь). Для визуализации трансгенных мышей, экспрессирующих hyBRET-ERK (рис. 5k), трансгенных мышей анестезировали изофлураном (1,5% ингаляции, 0.5 л / мин) и вводили 1 мМ диацетил-целентеразин-h, растворенный в PBS, содержащем 1% Pluronic F-127 (20% мас. / Об. В ДМСО), путем непрерывной внутривенной инфузии со скоростью 90 мкл / час с помощью шприцевого насоса Model 11 plus (Harvard Аппарат, Холлистон, Массачусетс). Носитель или 5,0 мг / кг PD-0325901 (общий объем составлял 100 мкл / мышь) вводили внутрибрюшинно во время визуализации. Изображение мышей получали с помощью имидж-сканера MIIS (Molecular Devices), оснащенного камерой iXon Ultra 888 EMCCD (ANDOR), оптикой разделения изображений W-VIEW GEMINI (Hamamatsu Photonics), системой светодиодного освещения XT640-W (Lumen Dynamics, Missisauga, ON ) и монофокальный телецентрический объектив TEC-55 (Computar, Cary, NC), управляемый программой Metamorph (Molecular Devices).Во время люминесцентной визуализации мышей держали под анестезией изофлураном и держали в тепле с помощью пластины предварительного нагрева Chamlide (Live Cell Instrument, Сеул, Корея). Желтое свечение и голубое свечение опухолей регистрировали при следующих условиях: время воздействия 30 с (для подкожных опухолей) или 4 мин (для метастазированных опухолей), усиление ЭМ 1000 (максимум) и биннинг ПЗС 1. Дихроичное зеркало и Эмиссионные фильтры, установленные в W-VIEW GEMINI для двухцветного люминесцентного изображения in vivo , представляли собой дихроичное зеркало FF509-Di01-25×36 и два эмиссионных фильтра (FF01-483 / 32-25 для голубой люминесценции и FF01-542 / 27- 25 для желтого свечения) и были получены от Semrock.

Прижизненная FRET-визуализация легкого мыши

Мышей с метастатической опухолью 4T1 анестезировали изофлураном (1% ингаляция, 0,5 л / мин). Часть кожи на левой груди была разрезана, чтобы обнажить поверхностный мышечный слой и ребра. Горло мышей разрезали по средней линии глотки, чтобы обнажить трахеальную трубку, и в трахеальную трубку вставляли ангиокатетер SURFLO 22-G (Terumo, Tokyo). Затем мышей помещали в положение для правого бокового пролежня и резецировали левые ребра, чтобы обнажить левое легкое.Мышей немедленно подключали к механическому аппарату ИВЛ MK-V100 (Muromachi Kikai, Tokyo). До конца визуализации дыхание обеспечивалось механически при следующих условиях: 55 ударов в минуту, 35 мл / мин, соотношение вдох / выдох 3: 2, изофлуран 1,5%. Чтобы уменьшить артефакты движения, вызванные дыханием, обнаженную область левого легкого осторожно отсосали и зафиксировали на покровном стекле с помощью изготовленного на заказ стабилизатора органа, который был подключен к вакуумному насосу. Опухоли в легких получали с помощью вертикального микроскопа FV1200MPE-BX61WI (Olympus), оснащенного водно-иммерсионным объективом XLPlanN 25x (Olympus), лазером InSight DeepSee (Spectra-Physics, Санта-Клара, Калифорния) и FV1200MPE Reflected Четырехканальный внешний детектор GaAsP NDD (Olympus).CFP возбуждали лазером с длиной волны 840 нм. В качестве дихроичных зеркал использовали DM450, DM570 и DM505 (Olympus). Используемые фильтры выбросов: FF01-425 / 30 (Semrock), BA460–500 (Olympus) и BA520–560 (Olympus) для SHG, CFP и FRET, соответственно. Во время визуализации FRET мышам внутривенно вводили 5,0 мг кг ^-1 PD-0325901 без прерывания визуализации.

Наблюдается аномальная передача избыточной энергии несколькими приемниками FRET

Аннотация

Фон

Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET) — это механизм, при котором энергия передается от возбужденного донорного флуорофора соседним хромофорам через безызлучательные диполь-дипольные взаимодействия.Теория FRET в первую очередь рассматривает взаимодействия одной пары донор-акцептор. К сожалению, редко известно, присутствует ли в молекулярном комплексе только один акцептор. Таким образом, использование FRET в качестве инструмента для измерения белок-белковых взаимодействий внутри живых клеток требует понимания того, как FRET изменяется с множеством акцепторов. Когда присутствует несколько акцепторов FRET, предполагается, что квант энергии либо высвобождается от донора, либо передается в toto только одному из присутствующих акцепторов.Скорость передачи энергии между донором и конкретным акцептором ( k _{D → A} ) можно измерить в отсутствие других акцепторов, и эти отдельные скорости передачи FRET можно использовать для прогнозирования эффективности FRET ансамбля с помощью простого кинетическая модель, в которой сумма всех скоростей переноса FRET делится на сумму всех скоростей переноса излучения и без излучения.

Методология / основные выводы

Общность этого подхода была проверена путем измерения эффективности ансамбля FRET в двух конструкциях, каждая из которых содержит один донор флуоресцентного белка (Cerulean) и два или три акцептора FRET (Venus).Скорости передачи FRET между отдельными парами донор-акцептор в этих конструкциях были рассчитаны на основе эффективности FRET, измеренной после систематического введения точечных мутаций для устранения всех других акцепторов. Мы обнаружили, что количество передачи энергии, наблюдаемое в конструкциях, имеющих несколько акцепторов, значительно больше, чем эффективность FRET, предсказанная из суммы скоростей передачи от отдельного донора к акцептору.

Выводы / Значение

Мы пришли к выводу, что либо существует дополнительный путь передачи энергии при наличии нескольких акцепторов, либо теоретическое предположение, на котором основывается прогноз кинетической модели, неверно.

Образец цитирования: Кушик С.В., Бланк П.С., Фогель С.С. (2009) Аномальная передача избыточной энергии, наблюдаемая при использовании нескольких приемников FRET. PLoS ONE 4 (11): e8031. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0008031

Редактор: Владимир Брезина, Медицинская школа Маунт Синай, Соединенные Штаты Америки

Поступила: 1 октября 2009 г .; Принята к печати: 2 ноября 2009 г .; Опубликовано: 25 ноября 2009 г.

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с положениями декларации Creative Commons Public Domain, которая предусматривает, что после размещения в общественном достоянии эта работа может быть свободно воспроизведена, распространена, передана, модифицированы, построены или иным образом использованы кем-либо в законных целях.

Финансирование: Это исследование было поддержано внутренней исследовательской программой NIH, NIAAA. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET) — это механизм ближнего поля, с помощью которого энергия передается от донорного флуорофора на соседний хромофор посредством безызлучательных диполь-дипольных взаимодействий [1], [2], [3], [4] ], [5], [6].Теория FRET применима только к флуорофорам, которые имеют очень слабую связь [7], и в первую очередь рассматривает взаимодействия одной пары донор-акцептор, когда они разделены расстоянием 1–10 нм [5], [6], но могут быть расширены. чтобы охватить ситуацию, когда присутствует более одного акцептора, если предположить, что донор взаимодействует с каждым акцептором независимо . Несмотря на то, что независимость параллельно действующих путей дезактивации флуоресценции является одним из краеугольных камней, на которых строится спектроскопия [5], справедливость этого предположения в применении к передаче энергии в ближнем поле непосредственно не проверялась.Очевидно, что использование FRET в качестве всеобъемлющего инструмента для измерения белок-белковых взаимодействий требует понимания того, как значения FRET меняются, когда присутствует более одного акцептора [6], [8].

Эффективность FRET донорно-акцепторной пары определяется как доля энергии фотона, поглощенная флуоресцентной молекулой, которая передается акцептору [ 4 ] , [ 5 ] , [ 6 ]. Если k _{D → A} — это скорость передачи энергии от донора к акцептору в присутствии одного акцептора, а τ _D — время жизни флуоресценции донорного флуорофора в отсутствие акцепторов, тогда E, эффективность FRET равна [4], [6]:

Этот кинетический формализм был изменен для расчета эффективности FRET между донором и множественными акцепторами.Например, эффективность FRET при наличии двух акцепторов считается равной [4], [6] 🙁 1)

Эта модель позволяет дискретно передавать энергию от донора к двум акцепторам, а предполагает, что каждый ведет себя независимо в параллельных путях деактивации. Общая форма уравнения 1 при наличии акцепторов и : (2)

Результаты

Чтобы проверить универсальность кинетической модели FRET с несколькими акцепторами, мы разработали набор генетических конструкций, состоящих из различных смесей и расположений трех спектральных вариантов зеленого флуоресцентного белка (FP), используя Cerulean [9] (в качестве Донор FRET), Венера [10] (как акцептор) и Янтарь, [11] «подобная» Венере молекула, которая имеет точечную мутацию, предотвращающую образование флуорофора, и предположительно не может действовать как акцептор FRET.Amber-Cerulean-Amber (ACA) был создан для измерения времени жизни флуоресценции Cerulean в отсутствие FRET при присоединении к FP как на его C-, так и на N-конце. Церулеан в ACA имел время жизни 2,95 ± 0,02 нс (среднее ± SEM, n = 5 клеток) при измерении в живых клетках коррелированным по времени подсчетом одиночных фотонов (TCSPC) [12] (рис. 1A). На рисунке 1B мы сравниваем спектр излучения Cerulean, Cerulean, прикрепленного к Amber (C5A), и Cerulean, прикрепленного к Венере (C5V), при возбуждении двухфотонным возбуждением 820 нм.Спектр излучения C5A был неотличим от спектра Cerulean, и оба они отличались от спектра излучения C5V, что указывает на то, что Amber не является флуоресцентным. Разрешенное во времени затухание флуоресцентной анизотропии флуоресцентного белка в комплексе чувствительно к массе и форме белка, а также к количеству флуорофоров и скорости миграции энергии в комплексе [13]. Флуоресценцию Венеры возбуждали двухфотонным возбуждением с длиной волны 950 нм и измеряли затухание анизотропии флуоресценции Венеры с временным разрешением для трех структурно связанных конструкций: Янтарь-Янтарь-Венера (AAV), Венера-Церулеан-Венера (VCV) и Венера-Янтарь-Венера. Венера (VAV) (рис.1С). Поскольку конструкция AAV имеет только один флуорофор, его кривая затухания анизотропии будет отражать вращение флуорофора Венеры в этом комплексе в зависимости от массы и формы. Напротив, и VCV, и VAV имеют два флуорофора Венеры, присоединенные либо молекулой Cerulean, либо молекулой Amber. Таким образом, помимо деполяризации, вызванной вращением молекул, эти конструкции должны также иметь компонент быстрого спада анизотропии из-за гомо-FRET. Если структура янтаря и церулеана по существу одинакова, расстояние между двумя флуорофорами Венеры в VCV и VAV также должно быть одинаковым, и, следовательно, передача гомо-FRET между этими флуорофорами должна иметь одинаковую скорость.Кривые затухания анизотропии VCV и VAV были практически идентичны, что соответствовало Amber, имеющему такую ​​же структуру складывания β-ствола, что и Cerulean [14]. Более того, компонент медленного распада, наблюдаемый в AAV, был подобен компоненту медленного распада как VCV, так и VAV, что еще раз указывает на то, что Amber имеет подобную складчатую структуру, как Cerulean [14] и Venus [15]. Таким образом, мы заключаем, что Янтарь не поглотитель темноты, не флуоресцентный, но имеет аналогичную трехмерную структуру, как Церулеан и Венера.

Рисунок 1.Время жизни Церулеана в окружении двух молекул янтаря.

A. Время жизни флуоресценции Cerulean в конструкции ACA измеряли коррелированным по времени подсчетом одиночных фотонов (КРАСНАЯ кривая представляет собой среднее значение следов, наблюдаемых в 5 различных клетках, экспрессирующих ACA). Флуоресцеин при pH 10 использовался в качестве стандарта на время жизни для проверки точности нашего оборудования, и его спад времени жизни флуоресценции показан на вставке (ЗЕЛЕНЫЙ след, среднее значение трех измерений). Функция отклика прибора нашей системы FLIM также изображена на вставке (ЧЕРНАЯ линия).B. Нормализованный спектр излучения клеток, трансфицированных либо церулеаном (синяя кривая), либо церулеаном, прикрепленным к янтарному (красный пунктирный график), либо церулеаном, прикрепленным к Венере (зеленая пунктирная кривая). Каждая кривая представляет собой среднее значение для 3 ячеек, и все образцы возбуждали двухфотонным возбуждением на длине волны 820 нм. Следы были нормализованы к пику эмиссии Cerulean при 481 нм. C. Разрешенное во времени затухание анизотропии флуоресценции Венеры в клетках, трансфицированных AAV (ЗЕЛЕНЫЕ кружки), VAV (КРАСНЫЕ квадраты) или VCV (СИНИЕ треугольники).Каждая точка представляет собой среднее значение 10 клеток, возбужденных на длине волны 950 нм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0008031.g001

Янтарь-Церулеан-Венера (ACV) и Венера-Церулеан-Янтарь (VCA) — это структурно связанные конструкции, созданные для измерения эффективности FRET (и скорости передачи ) между Церулеанами и С- или N-концевой Венерой (рис. 2). В ACV линкер, разделяющий Cerulean и Venus, состоит из 6 аминокислот, в то время как в VCA только 5. Эффективность FRET составляет 0,36 ± 0,09 (среднее ± SD, n = 26) и 0.44 ± 0,08 (n = 26) соответственно, как определено sRET-анализом [16] спектральных изображений двухфотонного возбуждения [17]. Скорости передачи энергии ACV и VCA были рассчитаны с использованием их эффективности FRET и времени жизни Cerulean в ACA и оказались равными 0,19 ± 0,01 и 0,26 ± 0,02 нс ^-1 (среднее ± стандартная ошибка среднего распространения). VCV, конструкция FRET с 1 донором и 2 акцепторами, имела эффективность переноса 0,64 ± 0,05 (n = 16). Это значение было аналогично эффективности FRET, измеренной для VCV в предыдущем исследовании [16] (0.70 ± 0,06 по sRET, 0,65 ± 0,03 по FLIM-FRET), но было больше и статистически отличалось от значения, предсказанного с использованием скоростей передачи ACV и VCA в уравнении 1 (0,58 ± 0,01, среднее ± стандартная ошибка среднего, p <0,01).

Рис. 2. Прогнозирование эффективности FRET конструкции с двумя акцепторами.

A. Конструкции, используемые для изучения эффектов наличия двух акцепторов в комплексе FRET. Синие «банки» изображают донора Церулеана, желтые — акцепторов Венеры, а серые — янтаря, у которого есть единственная точечная мутация на Венере, которая не позволяет ему образовывать флуорофор.Стрелки, ведущие от Церулеана, представляют как радиационные, так и неизлучающие пути эмиссии. Синие стрелки показывают излучение, когда Cerulean испускает фотон. Красные стрелки показывают безызлучательные пути высвобождения энергии возбуждения с участием FRET. B. Таблица, в которой сравниваются FRET-эффективности VCA, ACV и VCV, измеренные с помощью sRET или E-FRET, а также измеренное соотношение акцепторов и доноров (A / D) для каждой конструкции. C. Скорости передачи энергии и их ошибка распространения рассчитывались из измеренного Cerulean времени жизни ACA и эффективности FRET, измеренной с помощью E-FRET отдельных конструкций.Столбец «Сумма» представляет собой арифметическую сумму скоростей передачи VCA и ACV с распространяемой ошибкой и теоретически должен равняться скорости передачи, измеренной для VCV.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0008031.g002

Хотя разница между измеренной эффективностью VCV FRET и эффективностью передачи, предсказанной кинетической моделью, была статистически различной, она также была относительно небольшой (6%). . Соответственно, мы хотели подтвердить это наблюдение, используя другой метод FRET, который не полагался ни на двухфотонное, ни на лазерное возбуждение.E-FRET [18], [19], метод измерения эффективности FRET, основанный на десенсибилизации акцептора, был выбран, потому что он использует дуговую лампу в качестве источника однофотонного возбуждения. Дополнительным преимуществом подхода E-FRET является то, что он может точно измерить соотношение акцепторов и доноров [18], [19]. Затем это может быть использовано для проверки того, генерируют ли молекулы Cerulean и Venus свои флуорофоры, и присутствуют ли они в стехиометрии, предсказанной последовательностью конкретной конструкции. Анализ E-FRET показал, что ACV имеет эффективность FRET 0.38 ± 0,03 (среднее ± стандартное отклонение, n = 52) и выражали при ожидаемом соотношении акцептора к донору, равному 1 для молекулы с одним акцептором и одним донором (0,95 ± 0,07). VCA имел эффективность FRET 0,45 ± 0,04 (n = 82) и соотношение акцептора к донору 0,96 ± 0,09. Скорости передачи энергии, рассчитанные с использованием этих значений эффективности FRET, составили 0,21 ± 0,00 (обратите внимание, что ошибки 0,00 указывают на усеченную ошибку, которая была ≤0,005.) И 0,27 ± 0,00 нс ^-1 (среднее ± стандартное отклонение от распространенной ошибки). Анализ E-FRET показал, что VCV имел отношение акцептора к донору, равное 1.96 ± 0,17 (n = 59), как и ожидалось для молекулы с двумя акцепторами и одним донором. Измеренная эффективность FRET для VCV составила 0,69 ± 0,01 (среднее ± SEM). Опять таки. это значение было больше, чем значение, предсказанное с помощью уравнения 1 (0,59 ± 0,01, среднее ± стандартная ошибка среднего). Разница между прогнозируемыми и измеренными значениями составляет 0,10 ± 0,02 (разница ± 99% достоверности). Поскольку разница не включает ноль при уровне достоверности 99%, мы отвергаем гипотезу о том, что экспериментально измеренные значения для VCV согласуются с прогнозируемыми значениями, полученными на основе индивидуальных значений эффективности FRET.

Чтобы проверить, является ли наблюдаемый перенос избыточной энергии уникальным для конструкции VCV с двумя акцепторами или представляет собой более общий случай, когда присутствует несколько акцепторов, был создан набор конструкций для исследования FRET между одним донором и 3 акцепторами (рис. 3). Янтарь-Церулеан-Венера-Янтарь (ACVA) имел эффективность FRET 0,41 ± 0,05 (среднее ± стандартное отклонение, n = 72) и отношение акцептора к донору 0,96 ± 0,10, как измерено с помощью E-FRET. Венера-Церулеан-Янтарь-Янтарь (VCAA) имела эффективность FRET 0.42 ± 0,06 (n = 74) и отношение акцептора к донору 0,98 ± 0,15, а Amber-Cerulean-Amber-Venus (ACAV) имеет эффективность FRET 0,29 ± 0,03 (n = 64) и отношение акцептора к донору, равное 1,15 ± 0,12. Рассчитанные скорости переноса донора на акцептор для этих трех донорно-акцепторных пар составили 0,23 ± 0,00, 0,24 ± 0,01 и 0,14 ± 0,00 нс ^-1 соответственно (среднее ± стандартная ошибка среднего) и предсказали эффективность FRET ансамбля 0,65 ± 0,01. (среднее ± стандартная ошибка среднего) для конструкции Венера-Церулеан-Венера-Венера (VCVV). Эффективность FRET, измеренная для VCVV, составляла 0.76 ± 0,01 (среднее ± стандартная ошибка среднего, n = 71), и соотношение акцептора к донору составляло 2,87 ± 0,35 (среднее ± стандартное отклонение), как ожидалось для комплекса с одним донором и тремя акцепторами. Разница между прогнозируемыми и измеренными значениями для VCVV составляет 0,11 ± 0,02 (разница ± 99% достоверности). Поскольку разница не включает ноль при уровне достоверности 99%, мы отвергаем гипотезу о том, что экспериментально измеренные значения VCVV согласуются с прогнозируемыми значениями, полученными на основе индивидуальных значений эффективности FRET.

Рисунок 3.Прогнозирование эффективности FRET конструкции с тремя акцепторами.

A. Конструкции, используемые для изучения эффектов наличия трех акцепторов в комплексе FRET. Синие «банки» изображают донора Церулеана, желтые — акцепторов Венеры, а серые — янтаря. B. Таблица, показывающая FRET-эффективности VCAA, ACVA, ACAV и VCVV, измеренные с помощью E-FRET, а также измеренное отношение акцептора к донору (A / D) для каждой конструкции. C. Скорости передачи энергии и их ошибка распространения были рассчитаны из измеренного Cerulean времени жизни ACA и эффективности FRET, измеренной с помощью E-FRET.Столбец «Сумма» представляет собой арифметическую сумму скоростей передачи VCAA, ACVA и ACAV с распространяемой ошибкой и теоретически должен равняться скорости передачи, измеренной для VCVV.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0008031.g003

Молекулярный FRET внутри — это перенос энергии, который происходит между донором и акцепторами внутри молекулярного комплекса, а межмолекулярный FRET — это перенос энергии. это может происходить между донором в одном комплексе и акцептором в другом в результате молекулярного краудинга.Если межмолекулярный FRET имеет место и не учитывается, измеренная эффективность FRET ансамбля может быть переоценкой истинной внутримолекулярной эффективности FRET. Для ковалентно связанных цитоплазматических комплексов, подобных таковым в сериях VCV и VCVV, значительные уровни межмолекулярного FRET должны возникать только в том случае, если эти конструкции экспрессируются в очень высокой концентрации (в диапазоне мМ [8]). Экспериментально межмолекулярный FRET может быть обнаружен как увеличение эффективности FRET с увеличением концентрации акцептора.В случае обнаружения истинная внутримолекулярная эффективность FRET может быть оценена из экстраполированного значения эффективности FRET при бесконечно разбавленных концентрациях акцепторов; Y-пересечение. В экспериментах E-FRET, помимо измерения эффективности FRET и отношения акцептора к донору, также измеряется интенсивность непосредственно возбужденного акцептора, Венеры, нормированная на время воздействия. Интенсивность непосредственно возбужденного акцептора должна быть пропорциональна концентрации акцептора. Чтобы проверить и контролировать любые межмолекулярные FRET, измеренные эффективности FRET каждой клетки, которая экспрессировала конструкции либо в серии VCV (фиг. 4A), либо в серии VCVV (фиг. 4B), были нанесены на график в зависимости от концентрации акцептора.Лишь незначительное увеличение эффективности FRET наблюдалось с увеличением интенсивности Венеры в диапазоне 1-2 порядка величины. Тем не менее, каждый набор данных хорошо соответствовал линейной регрессии, и поэтому пересечения по оси Y использовались для оценки экстраполированной эффективности FRET ± 95% доверительный интервал (VCA = 0,45 ± 0,01, ACV = 0,37 ± 0,01, VCV = 0,66 ± 0,02). , VCAA = 0,40 ± 0,02, ACVA = 0,39 ± 0,01, ACAV = 0,27 ± 0,01, VCVV = 0,73 ± 0,02). Эти значения были приняты за внутримолекулярную эффективность FRET без межмолекулярного FRET.Как и ожидалось, экстраполированные эффективности FRET для любой конкретной конструкции были либо статистически неразличимы, либо лишь незначительно снижены по сравнению с эффективностями FRET, измеренными ранее как среднее значение ансамбля. Независимо от этого, используя эти экстраполированные значения эффективности FRET, кинетическая модель предсказывает эффективность VCV FRET 0,58 ± 0,01 и эффективность FRET VCVV 0,63 ± 0,02 (эффективность FRET ± распространенный 95% доверительный уровень). Разница между предсказанием кинетической модели и измеренными значениями VCV составила 0.08 ± 0,03, а для VCVV — 0,10 ± 0,03 (разница ± 99% достоверности). Поскольку эти различия не включают ноль при уровне достоверности 99%, мы отвергаем гипотезу о том, что экспериментально измеренные значения для VCV и VCVV, даже с поправкой на межмолекулярный FRET, согласуются с предсказанными значениями, полученными на основе индивидуальных эффективностей FRET.

Рисунок 4. Оценка внутримолекулярной эффективности FRET.

E-FRET использовался для измерения эффективности FRET и интенсивности акцептора (Венера) для каждой клетки, экспрессирующей члены серии VCV (A; VCV, ACV и VCA) или серии VCVV (B; VCVV, ACVA, VCAA). , ACAV), и эти значения нанесены на график как функция интенсивности Венеры, нормированной на экспозицию.Пунктирными линиями показана аппроксимация линейной регрессии для каждого набора данных для расчета точки пересечения по оси Y как оценки количества внутримолекулярного FRET в отсутствие межмолекулярного FRET. Обратите внимание, что данные построены в полулогарифмическом масштабе, чтобы легче было выявить полный диапазон интенсивности Венеры, но при этом линейные графики выглядят изогнутыми.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0008031.g004

Обсуждение

Целью данного исследования была экспериментальная проверка универсальности использования суммы индивидуальных скоростей передачи FRET от донора до акцептора ( k _{D → A} ) для прогнозирования эффективности ансамбля FRET комплекса донора с множественные акцепторы (уравнение 2).Мы специально хотели провести этот тест с использованием спектральных вариантов GFP в живых клетках, поскольку это общий подход, используемый для изучения межбелковых взаимодействий в физиологических условиях. Этот кинетический формализм постоянно не позволял предсказать измеренную эффективность FRET ансамбля. Это наблюдалось как при однофотонном, так и при двухфотонном возбуждении, при возбуждении как лазером, так и дуговыми лампами, а также с использованием двух различных методов измерения FRET, одного на основе спектрального изображения [16], а другого на основе акцепторной десенсибилизации [18], [ 19].В чем причина несоответствия между эффективностями ансамбля FRET, измеренными при наличии нескольких акцепторов, по сравнению со значениями, предсказанными теорией? Стоит рассмотреть шесть возможных объяснений: 1. Время жизни флуоресценции Cerulean в отсутствие акцепторов, которое использовалось для наших расчетов, неточно, 2. Янтарь ведет себя аномально, 3. Cerulean и / или Venus имеют разную эффективность сворачивания в разных конструкциях. , 4. Дополнительная передача энергии происходит за счет межмолекулярного FRET, 5.Дополнительный скрытый путь передачи энергии от донора существует, и его необходимо учитывать, и 6. Одно из теоретических предположений, на которых основан кинетический формализм, неверно.

Время жизни церулеана в ACA составило 2,95 ± 0,02 нс (среднее значение ± стандартная ошибка среднего, n = 5 клеток). Это время жизни было измерено на системе FLIM, которая имела длительность импульса возбуждающего лазера менее 200 фс, и была получена с помощью фотоумножителя с микроканальной пластиной (Hammamatsu R3809U-52), у которой измеренная функция отклика системы составляла <40 пс (FWHM; Инжир.1А). Измерение продолжительности жизни проводили на пяти повторностях клеток, трансфицированных ДНК, кодирующей АСА. Каждая кривая затухания имела минимум 5000 пиковых отсчетов фотонов и была подобрана с использованием модели двойного экспоненциального затухания, деконволюционной из измеренной функции отклика прибора для дополнительной точности. Кроме того, точность нашей системы TCSPC была подтверждена с использованием сертифицированного NIST стандарта флуоресцеина (Invitrogen) при pH 10 и дала значение срока службы 4,08 ± 0,00 (среднее ± стандартное отклонение, n = 3; рис. 1A). Ожидаемое время жизни флуоресценции флуоресцеина при pH 10 составляет 4.1 нс [11]. Наиболее важно то, что время жизни ACA было аналогично ранее измеренному времени жизни Cerulean, когда он экспрессировался в клетках отдельно (2,94 ± 0,11 нс, среднее ± стандартное отклонение) [11], что указывает на то, что время жизни Cerulean не изменилось заметно, когда молекулы Amber были добавлены к обеим его молекулам. C- и N-концы. Таким образом, очень маловероятно, что измеренное время жизни ACA было отклонено более чем на 100 пс, а фактическая стандартная ошибка времени жизни Cerulean для среднего в ACA составляла 20 пс. Более того, можно показать, что время жизни донора в отсутствие акцепторов не требуется для предсказания эффективности ансамбля FRET; он может быть рассчитан только с использованием эффективности FRET для эффективности переноса отдельных доноров-акцепторов (см. Материалы и методы , предсказания кинетической модели и распространение ошибок ).Следовательно, ошибки в сроке службы ACA не могут объяснить это несоответствие.

В этом исследовании единственная точечная мутация в последовательности, которая формирует флуорофор Венеры, Y ₆₇ C, была использована для образования янтаря, по сути, белка Венеры, лишенного внутреннего хромофора. Спектроскопия использовалась, чтобы показать, что добавление янтаря к церулеану не изменяет профиль эмиссии флуоресценции церулеанцев, подтверждая отсутствие флуорофора Венеры в янтаре (рис. 1B). В предыдущем исследовании мы продемонстрировали, что лигирование Amber только с C-концом Cerulean незначительно изменяет его время жизни (на ~ 200 пс).Этот результат отличался от результата, приведенного выше для ACA. Тем не менее этот небольшой сдвиг в продолжительности жизни Cerulean не изменился в зависимости от длины линкера [11], как это наблюдалось в гомологичных конструкциях, где Венера была прикреплена к C-концу Cerulean. В этом случае время жизни Cerulean резко сократилось, по крайней мере, на 1 нс, и постоянно становилось еще короче, поскольку количество аминокислот в линкере, разделяющем два флуорофора, уменьшалось с 32 до 17, а затем до 5 [11]. Соответственно, был сделан вывод, что точечная мутация Amber не создала новый хромофор, который мог бы действовать как темный поглотитель для Cerulean флуоресценции.

В этом исследовании предполагается, что систематическое введение точечных мутаций Amber в VCV и в VCVV не изменило расстояние разделения или фактор дипольной ориентации (κ ² ) оставшихся пар Cerulean-Venus FRET в этих конструкциях. Это кажется разумным предположением, поскольку известно, что тирозин ₆₇ находится внутри структуры β-бочки Венеры, а не на ее поверхности [15]. Более того, разница в массе между тирозином и цистеином составляет 60 г / моль, таким образом, в худшем случае с двумя заменами янтаря разница в массе между конструкцией VCVV и массой ACVA, VCAA или ACAV составляет всего 0. .1%. Мы также отмечаем, что если введение янтаря должно было вызвать сдвиг в расстоянии разделения или коэффициенте дипольной ориентации оставшихся пар Cerulean-Venus FRET, мы могли бы ожидать как положительные, так и отрицательные изменения в оставшихся скоростях передачи FRET. Однако результаты, представленные здесь, были бы возможны только в том случае, если введение мутации Amber всегда приводило к значительному чистому снижению оставшейся скорости передачи FRET (~ 36% для ACV и VCA и ~ 41% для ACVA, VCAA и ACAV).Тем не менее, для дальнейшего исследования этой возможности был использован анализ затухания флуоресцентной анизотропии для сравнения трехмерной структуры янтаря с известными β-бочкообразными структурами Церулеана [14] и Венеры [15] (рис. 1С). Сходство между затуханием анизотропии флуоресценции VCV и VAV указывает на то, что как скорости передачи гомо-FRET между двумя молекулами Венеры в этих конструкциях, так и время корреляции вращения для этих флуорофоров были почти идентичными [13]. Мы пришли к выводу, что трехмерная структура янтаря, вероятно, представляет собой β-бочку, подобную Церулеану и Венере, и что крайне маловероятно, что введение янтаря вызвало изменение расстояния разделения или фактора ориентации диполя оставшихся Церулеан-Венеры. FRET пары.Следует также отметить, что, поскольку времена корреляции вращения Венеры и Церулеана намного больше, чем время их жизни флуоресценции [20], движение этих флуорофоров во время установившегося измерения FRET будет незначительным, если вообще будет. Таким образом, маловероятно, что расхождения, наблюдаемые в этом исследовании, можно объяснить изменениями расстояния разделения пар FRET или значения κ ² в результате вращения молекул между возбуждением и излучением.

Было высказано предположение, что большая часть флуоресцентных белков неспособна сворачиваться и образовывать хромофоры при экспрессии в клетках [21].Если это так, интерпретация измерений FRET флуоресцентного белка потребует учета доли неправильно свернутых доноров и акцепторов. Этот крайний вывод был основан на зависимой от модели интерпретации отсутствия единственного экспоненциального спада при анализе спада времени жизни флуоресценции тандемных флуоресцентных белковых конструкций с одним донором и одним акцептором. Альтернативное объяснение этого наблюдения, однако, состоит в том, что тандемные конструкции флуоресцентных белков имеют распределение расстояний разделения между донорами и акцепторами, а не одно дискретное расстояние разделения.Это тоже привело бы к многоэкспоненциальному распаду, даже если оба флуорофора складывались нормально и эффективно. Чтобы различать эти возможности, мы использовали анализ E-FRET [18], [19], который в дополнение к эффективности ансамбля FRET также дает соотношение акцепторов и доноров в клетке. Мы обнаружили, что в наших условиях культивирования прогнозируемое соотношение акцепторов и доноров для конкретной конструкции соответствовало соотношению, измеренному экспериментально. Таким образом, маловероятно, что значительная часть флуорофоров в этих конструкциях не может образоваться в результате неправильной укладки белка.

Одно из возможных объяснений избыточного переноса энергии, наблюдаемого в клетках, экспрессирующих VCV или VCVV, заключается в том, что клетки, экспрессирующие эти конструкции, имели значительно более высокие уровни межмолекулярного FRET, чем наблюдаемые в клетках, экспрессирующих контрольные конструкции (например, ACV, VCA для серии VCV и ACVA, VCAA и ACAV для серии VCVV). На рисунке 4 измеренные эффективности FRET были нанесены на график в зависимости от концентрации акцептора. Только небольшое увеличение эффективности FRET в зависимости от интенсивности Венеры наблюдалось в диапазоне интенсивности акцептора, охватывающем по крайней мере 1 порядок величины для каждой конструкции.Линейный регрессионный анализ набора данных для каждой конструкции использовали для оценки внутримолекулярной эффективности FRET в отсутствие межмолекулярного FRET. Эти экстраполированные внутримолекулярные эффективности FRET затем использовались для прогнозирования эффективности VCV и VCVV FRET с использованием кинетической модели. Даже при использовании этих скорректированных значений эффективности FRET кинетическая модель не смогла точно предсказать измеренные значения эффективности FRET VCV или VCVV. Мы пришли к выводу, что наличие межмолекулярного FRET в наших образцах, если таковое имеется, не является причиной наблюдаемого переноса избыточной энергии.

Если существует дополнительный скрытый путь передачи энергии, который удаляет энергию возбуждения от донора, эффективность передачи ансамбля будет:

Где k _{D → X} — скорость передачи энергии этого нового гипотетического пути. Соответственно, это уравнение также можно использовать для оценки скорости передачи k _{D → X} (и эффективности передачи, E _X ) этого дополнительного пути передачи энергии, если эффективность ансамбля FRET и отдельные скорости передачи FRET известны.Для эксперимента VCV E-FRET с двумя акцепторами Венеры, описанного выше, используя средние значения эффективности E-FRET из рисунков 2B и 3B, мы вычисляем, что E _X = 0,45 ± 0,02 ( k _{D → X} = 0,28 ± 0,02 нс ^-1 , среднее ± стандартная ошибка среднего распространения), а для VCVV с тремя акцепторами Венеры мы вычисляем, что E _X = 0,56 ± 0,03 ( k _{D → X} = 0,43 ± 0,05 нс ^{— 1} ). Концептуально k _{D → X} для VCV можно рассматривать как разницу между скоростью передачи VCV и суммой на рисунке 2C, а k _{D → X} для VCVV можно рассматривать как разницу между VCVV и Суммарная скорость передачи на рисунке 3C.Эти скорости передачи не совпадают. Удивительно, но k _{D → X} увеличивалось с количеством акцепторов и, по-видимому, масштабировалось с количеством молекул Венеры, присутствующих в конструкции (~ 0,14 нс ^-1 / акцептор Венеры). Это предполагает, что дополнительный путь, если он существует, физически включает взаимодействия между Cerulean и этими молекулами Венеры. Также стоит отметить, что скорость передачи k _{D → X} , предсказанная для VCVV (0,43 нс ^-1 ), значительно выше, чем три скорости передачи FRET, измеренные между церулеанским донором и отдельными акцепторами Венеры (0.23, 0,24 и 0,14 нс ⁻¹ ). Один из способов объяснить расхождение между измеренной эффективностью VCVV FRET, равной 0,76, с эффективностью FRET, предсказанной кинетической моделью (0,65), состоит в том, чтобы предположить, что измерения эффективности FRET для ACVA, VCAA и ACAV, каждое из которых занижало « истинную » эффективность FRET на примерно 0,12–0,13. По трансферным ставкам нам пришлось бы занижать их на 41%. Это кажется маловероятным, поскольку мы ранее показали, что измерения E-FRET статистически неотличимы от измерений FLIM-FRET [11], и что оба метода могут различать изменения эффективности FRET всего на 5% [11].Кроме того, система E-FRET, используемая в этом исследовании, была откалибрована с помощью эталонных стандартов FRET [11], [19], а соотношение акцептор / донор, измеренное одновременно с помощью E-FRET для всех этих конструкций, было правильным до ближайшего целого числа (1 для ACVA, VCAA, ACAV, 3 для VCVV). Мы пришли к выводу, что в VCVV доминирующим путем передачи энергии от возбужденного церулеанского флуорофора является не радиационная эмиссия или классический перенос FRET к какой-либо из трех присоединенных молекул Венеры, а скорее является результатом плохо изученного дополнительного пути передачи энергии.

Какой физический процесс может объяснить передачу энергии с такой высокой скоростью? И Церулеан, и Венера представляют собой флуорофоры, заключенные в белковой оболочке β-ствола. Таким образом, маловероятно, что механизм обмена электронов Декстера возможен, потому что самое близкое, что эти флуорофоры могут сблизиться друг с другом, составляет ∼2–3 нм [7], [22]. Точно так же при таких расстояниях разделения, и особенно при физиологически значимых температурах [23], также кажется маловероятным, что флуорофоры могут быть сильно связаны [7].Также маловероятно, что этот дополнительный путь является результатом присутствия эндогенного клеточного тушителя, как: 1. Время жизни Cerulean, когда он присоединен к другим белкам как на его C-, так и на N-конце, в отсутствие акцепторов (ACA) также измеряли у живых организмов. клетки; таким образом, если бы тушители присутствовали в этих клетках, они были бы учтены в наших расчетах, 2. Время жизни Cerulean в клетках [11] было аналогично времени жизни очищенного Cerulean в буферах, показатель преломления которых был подобен таковому у цитоплазмы [24]. ; таким образом, маловероятно, что гипотетические эндогенные тушители существенно повлияли на наши измерения времени жизни ACA, 3.Церулеан и Венера не тушатся низкомолекулярными тушителями, такими как акриламид или йодид калия [20], и 4. Как упоминалось выше, скорость передачи энергии k _{D → X} увеличивается с увеличением количества акцепторов Венеры, присутствующих в конструкция. Это говорит о том, что хромофор Венеры является «гасителем», ответственным за передачу избыточной энергии. Хотя мы не можем исключить дополнительный механизм передачи энергии от Cerulean, облегченный физическим контактом между стенками соседних белковых оболочек β-ствола, такой механизм все же требует присутствия хромофоров Венеры внутри β-ствола, так как время жизни Cerulean в ACA был подобен времени жизни только Cerulean, и оба были намного дольше, чем ранее измеренное время жизни флуоресценции Cerulean в VCV [16].Более того, такой механизм кажется маловероятным, поскольку все молекулы Cerulean, Venus и Amber, использованные в этом исследовании, содержали мутацию A ₂₀₆ K, которая предотвращает агрегацию флуоресцентных белков [25].

Без убедительного объяснения переноса избыточной энергии, наблюдаемого при наличии нескольких акцепторов Венеры, мы должны сделать вывод, что существует необъяснимый новый механизм передачи от донора Церулеана акцепторам Венеры, или рассмотреть возможность того, что одно из наших предположений о применении кинетический формализм для расчета эффективности ансамбля FRET для VCV или VCVV неверен.Предположения, связанные с передачей энергии FRET, были четко объяснены Фёрстером [1]. Более того, многие предсказания для FRET были соблюдены, что подтвердило теорию, и полезность этого подхода выдержала испытание временем [2], [26], [27], [28], [29], [ 30], [31]. Это будет менее ясно, если мы можем просто предположить, что члены семейства зеленых флуоресцентных белков (GFP) [32], такие как Cerulean и Venus, будут вести себя как «типичные» флуорофоры. DsRed представляет собой красный флуоресцентный белок, структурно связанный с GFP [33], который, как полагают, образует комплекс из четырех тесно связанных флуорофоров, каждый из которых заключен в свои белковые оболочки β-бочонка [34].Эксперименты по отбеливанию одиночных молекул [35], [36], а также сравнение кругового дихроизма и абсорбционной спектроскопии [37] предполагают существование экситонного поведения в этой тетрамерной сборке DsRed. Как заметил Фёрстер [1], в этих условиях «сам процесс возбуждения по существу разделяется с соседними молекулами, и правильнее приписывать энергию возбуждения всей системе молекул, чем отдельным молекулам». По сути, доноры и акцепторы будут вести себя как единое целое, а не как отдельные флуорофоры.Если бы экситонное поведение происходило в VCV или VCVV, теория FRET и кинетический формализм для передачи энергии нескольким акцепторам не действовали бы. Как упоминалось ранее, экситонное поведение или даже слабая связь не возникает при физиологических температурах, особенно для флуорофоров, которым препятствуют сближение друг с другом в результате стерических препятствий [32]. Хотя такой неортодоксальный квантово-механический механизм переноса кажется маловероятным в биологическом контексте [38], отсутствие других объяснений заставляет нас предположить, что, возможно, структура β-бочонка флуоресцентных белков была эволюционно выбрана, чтобы допускать либо экситонное поведение, либо слабую связь. возбуждение, или дополнительный путь передачи энергии.

Независимо от фактических причин более высоких количеств передачи энергии, которые мы наблюдали в конструкциях, имеющих несколько акцепторов FRET Венеры, наше исследование показывает: 1. Следует проявлять осторожность при интерпретации количественных экспериментов FRET, в которых может присутствовать несколько акцепторов FRET, и 2. Использование нашей экспериментальной системы, в которой мы можем создавать белки с любым произвольным числом доноров и акцепторов, может быть использовано для создания более эффективных путей передачи энергии. Это, в свою очередь, может быть использовано для оптимизации как захвата энергии, так и воронки в приложениях нанотехнологий.Мы предполагаем, что β-цилиндрическая структура флуоресцентных белков может быть ответственна за более высокую скорость переноса при наличии нескольких акцепторов. Даже отдаленная возможность того, что флуоресцентные белки в физиологических условиях могут передавать энергию вне режима Ферстера, указывает на необходимость дальнейших экспериментов.

Материалы и методы

Конструкция клонов

эндонуклеазы рестрикции были получены от New England Biolabs (NEB, США) или Roche (США). Pfu Ultra (Stratagene, США) использовали во всех полимеразных цепных реакциях (ПЦР). Все спектральные варианты зеленого флуоресцентного белка (FP) [39], использованные в данном исследовании, содержали мономерную мутацию A ₂₀₆ K [25]. Клонирование и конструирование Cerulean C1; голубой ФП с одним экспоненциальным спадом времени жизни [9], Венера C1; желтый FP, который быстро сворачивается [10], 6 × His-меченый Cerulean, 6 × His-меченный Venus, Cerulean-5-Venus (C5V), а также гетеротримерная конструкция FP VCV; Венера-5-Церулеан-6-Венера (где числа указывают количество аминокислот, разделяющих флуорофоры) описаны в другом месте, как указано [11], [16].Янтарный C1; «подобный» Венере FP, лишенный хромофора в результате единственной точечной мутации (Y ₆₇ C), был получен путем мутации тирозина ₆₇ Венеры-C1 в цистеин с использованием смыслового праймера 5′-ACCCTCGTGACCACCCTCGGCTGCGCCTGCAGTGCT 3 ‘и антисмысловой праймер 5′-GCGGGCGAAGCACTGCAGGCCGCAGCCGAGGGTGGTCACGAGGGT-3’. Полученный клон Amber C1 подтверждали секвенированием. Двойные конструкции FP C5A, V5A, A5C, V5C, V5V, A5V и A5A были сконструированы путем первой амплификации кДНК Amber, Cerulean или Venus без стартового кодона с использованием смыслового праймера с сайтом BglII (подчеркнутым) 5′-GCAGATCTGTGAGCAAGGCGACCAGCTG-3 ‘И антисмысловой праймер с сайтом EcoRI (подчеркнутым) сайтом 5′-GCGAATTCCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGAGTG-3’ из любого мономерного вектора Amber-C1, Cerulean-C1 или Venus-C1.Полученные фрагменты клонировали в Zero Blunt II Topo (Invitrogen, США) и секвенировали. Полноразмерную кДНК для Amber вырезали с использованием BglII и EcoRI и клонировали в Cerulean C1 или Venus C1 для образования C5A и V5A соответственно. Аналогичным образом полноразмерную кДНК Cerulean клонировали в сайт BglII / EcoRI Amber C1 для генерации A5C или в Venus C1 для генерации V5C. Полноразмерную кДНК Венеры клонировали в сайт BglII / EcoRI Amber C1 для генерации A5V и Venus C1 для генерации V5V. Конструкции были проверены по размеру с использованием рестрикционных дайджестов.Полноразмерную кДНК Amber клонировали в сайт BglII / EcoRI Amber C1 для получения A5A.

Для создания гетеротримерных конструкций FP: Amber-5-Cerulean-6-Amber (ACA), Venus-5-Cerulean-6-Amber (VCA), Amber-5-Cerulean-6-Venus (ACV), Amber -5-Венера-6-Янтарь (AVA), Венера-5-Янтарь-6-Янтарь (VAA), Янтарь-5-Янтарь-6-Венера (AAV) и Венера-5-Венера-6-Венера-Янтарь, Открытая рамка считывания (ORF) Cerulean или Venus была амплифицирована с использованием смыслового праймера с сайтом SalI (подчеркнутым), 5′-GCGTCGACGGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCG-3 ‘и антисмысловым праймером с сайтом BamHI (подчеркнутый) TAGTAT’-AGTCTCGGATGCCGCCGCCGTG-3TAT’-AGTCTCGGATGCCGCCTGTCGACCCCTGTCGTCGCCGCCTG-3 (подчеркнутый).Полученный фрагмент клонировали и секвенировали, как описано ранее. Фрагмент Венеры был клонирован в AC, расщепленный SalI / BamHI, для генерации ACV, AA для генерации AAV и VV для генерации VVV. Amber ORF аналогичным образом клонировали в VC для генерации VCA и AC для генерации ACA.

Для создания гетеротетрамерных конструкций FP: Венера-5-Церулеан-5-Венера-6-Венера (VCVV), Янтарь-5-Церулеан-5-Венера-6-Янтарь (ACVA), Янтарь-5-Церулеан- 5-Янтарь-6-Венера (ACAV) и Венера-5-Церулеан-5-Янтарь-6-Янтарь (VCAA) были созданы из VVV, AVA, VAA и AAA соответственно.Смысловой праймер с сайтом BspE1 (подчеркнутый) 5′-AGTCTCCGGAGGAGGTGGAAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3 ‘и антисмысловой праймер с сайтом BglII (подчеркнутый) 5′-AGTCAGATCTTCCACCTCCCTTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3’ были использованы для амплификации Cerulean из вектора Cerulean из Cerulean. Фрагмент ДНК клонировали в Zero Blunt II-TOPO, и вставку секвенировали. Вставку вырезали с помощью BspE1 и BglII и клонировали в VVV для генерации VCVV, в AAV для генерации ACAV, в VAA для генерации VCAA и в AVA для генерации ACVA.

Культура клеток и трансфекция

HEK 293 (ATCC, США) культивировали в виде монослоя в колбе Т-75 (Corning, США) в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO ₂ на воздухе при 37 ° C в средах, содержащих DMEM с Hi-глюкозой, пируват натрия, 10% фетальная бычья сыворотка, 1 × NEAA, 1 × Pen-Strep и 1 × Glutamax (все закуплено у Invitrogen, США). За два дня до визуализации клетки ресуспендировали с использованием TrypLE Express (Invitrogen, США) и высевали на чашки со стеклянным дном диаметром 35 мм (Fluorodish, World Precision Instruments, США).На следующий день 1 мг кДНК плазмиды трансфицировали в клетки с использованием Lipofectamine 2000 (Invitrogen, США) и инкубировали в течение ночи, а на следующий день проводили визуализацию в PBS (Media Tech, США).

Многофотонная микроскопия

Ti: сапфировый лазер с синхронизацией мод (Coherent Chameleon, США), работающий на частоте 80 МГц и перестраиваемый в диапазоне 710–950 нм, был присоединен к вертикальному микроскопу Zeiss Axioplan-2 со сканирующей головкой Zeiss 510 META / NLO и использовался для получать спектральные изображения с двухфотонным возбуждением [40] для анализа sRET [16], [17].После блокировки возбуждающего света с помощью фильтра BG39, помещенного на световом пути, спектральные изображения со всеми 32 каналами внутреннего детектора META были использованы для получения спектров излучения (охватывающих диапазон 388-719 нм).

Анализ sRET

Спектральные изображения для анализа sRET были получены, как описано ранее [16]. Вкратце, пары спектральных изображений 1. капилляров, содержащих 7,8 мкМ Cerulean или Venus, и 2. Клетки, трансфицированные конкретной конструкцией FRET, собирали при возбуждении 860 и 900 нм с использованием 20 × NA 0.5 водный объектив. Затем этот набор из 4 спектральных изображений был загружен в Igor Pro (Wavemetrics, США) и обработан с помощью макроса, реализующего алгоритм sRET. Измеряли эффективность FRET для отдельных ячеек. Среднюю эффективность FRET и статистический анализ выполняли с использованием Prism 5.0 (GraphPad software Inc., США).

Анализ E-FRET

измерения E-FRET были выполнены, как описано в [19]. Вкратце, инвертированный микроскоп IX-71 (Olympus, Япония), оснащенный дуговой ксеноновой лампой мощностью 75 Вт, механическим затвором UNIBLITZ (Vincent Associates, США), масляным объективом 60 × (NA 1.4), набор донорных фильтров (куб IDD, донорный канал; возбуждение: 436 ± 10 нм, эмиттер: 480 ± 20 нм, дихроичный: 455LP), набор акцепторных фильтров (куб IAA, акцепторный канал; возбуждение: 500 ± 10 нм, излучатель: 540 ± 15 нм, дихроичный: 520LP) и набор фильтров FRET (куб IDA, канал FRET; возбуждение: 436 ± 10 нм, излучатель: 540 ± 15 нм, дихроичный: 455LP). Для сбора данных использовалась 12-битная охлаждаемая ПЗС-камера (Retiga Exi, Qimaging, Канада). Эффективность FRET и линейный регрессионный анализ межмолекулярного FRET рассчитывали с помощью Igor Pro (Wavemetrics), а статистический анализ выполняли с помощью Graph Pad Prism 5.0.

Флуоресцентная пожизненная микроскопия

Анализ затухания времени жизни флуоресценции проводился с использованием коррелированного по времени счета одиночных фотонов [12], как описано ранее [11], [16]. Лазер с синхронизацией мод, настроенный на 820 нм, использовался для возбуждения Cerulean в конструкциях. Излучаемые фотоны фильтровались через фильтр BG39, полосовой фильтр 460–490 нм, поляризатор, настроенный на условия магического угла (54,7 °, Medowlark Optics, США), фильтр короткого прохода 700 нм (e700sp-2p; Chroma Optical, США). ) и обнаруживается на микроканальном пластинчатом фотоумножителе (R3809U-52; Hamamatsu, Япония), присоединенном к нерассканированному порту детектора Zeiss 510, расположенному на пути проходящего света.Фотоны подсчитывались и коррелировались с возбуждающими лазерными импульсами с помощью модуля SPC830 (Becker and Hickl, Германия). Кривые затухания времени жизни флуоресценции собирали и обрабатывали, как описано ранее [11], [16]. Кривые были скорректированы по темноте. Сигнал второй гармоники, генерируемый одноосновными кристаллами фосфата натрия, облученными светом 940 нм, был использован для измерения функции отклика прибора (IRF) нашей системы. Как и ожидалось, для сигнала, генерируемого лазером с синхронизацией мод менее 200 фемтосекунд, и детектором MCP, измеренная полная ширина на половине максимального отклика была менее 40 пс.Этот измеренный IRF также использовался SPCImage (Becker and Hickle Gmbh, Германия) для более точного расчета среднего спада времени жизни ACA (с использованием двойной экспоненциальной модели) и флуоресцеина (с использованием одной экспоненциальной модели).

Спектры излучения

Спектральные изображения клеток, трансфицированных Cerulean, Cerulean-Amber или Cerulean-Venus, получали на лазерном сканирующем микроскопе Zeiss 510 META / NLO с водным объективом 40 × NA 0,8. Спектры от трех разных ячеек загружали в Igor Pro (Wavemetrics, США).После вычитания фона каждый спектр был нормализован к пику Cerulean при 481 нм и усреднен.

Измерения затухания анизотропии многофотонной флуоресценции

Измерения затухания анизотропии проводились, как описано ранее [41]. Вкратце, для получения измерений затухания анизотропии с временным разрешением использовался лазерный сканирующий микроскоп Zeiss 510 META / NLO, модифицированный для коррелированного по времени счета одиночных фотонов [12]. Трансфицированные клетки визуализировали с использованием водяного объектива 40 × NA 0,8.Конструкции возбуждали лазером с синхронизацией мод, настроенным на 950 нм. Излучаемые фотоны фильтровались через фильтр BG39, полосовой фильтр 535 ± 15 нм, короткопроходный фильтр 700 нм (Chroma Optical, США), куб поляризационного светоделителя (Linos AG, Германия), дополненный двумя линейными поляризаторами (Medowlark Optics). , США), установленный на каждом пути излучения от кубического делителя, и обнаруженный на двух микроканальных пластинчатых фотоумножителях (Hamamatsu R3809U-52, Япония), расположенных на параллельной (I _VV ) и перпендикулярной (I _VH ) поляризации. пути.Фотоны, обнаруженные параллельными или перпендикулярными детекторами, мультиплексировались с помощью четырехканального маршрутизатора HR-41 (Becker and Hickl, Германия) и подсчитывались (и коррелировались с импульсами лазера возбуждения) с помощью модуля SPC830 (Becker and Hickl, Германия). Кривые затухания анизотропии флуоресценции с временным разрешением были построены на основе кривых затухания времени жизни флуоресценции, полученных от фотонов, детектированных каждым фотоумножителем, с использованием следующего уравнения [13] для анизотропии ( r ): обнаружение фотонов в путях I _VV и I _VH . G был измерен с помощью подгонки хвоста I _VV и I _VH кривые спада времени жизни флуоресцеина, образца, который, как известно, быстро деполяризуется [42], и оказалось, что он составляет ~ 1,2.

FRET Скорость передачи и вычисления ошибок

скорости FRET ( k _{D → A} ) были рассчитаны на основе индивидуальных эффективностей FRET, как определено анализом E-FRET, с использованием следующего уравнения: где τ _D — время жизни конструкции ACA (2.95 нс). Ошибки в этих кинетических скоростях были рассчитаны с использованием распространения ошибок [43] с помощью программного обеспечения Maple (Maplesoft, Ватерлоо, Канада): где — измеренная ошибка в измерениях эффективности FRET, а — измеренная ошибка во времени жизни донора в отсутствие акцепторов. .

Прогнозы кинетической модели и распространение ошибок

Кинетическая модель с несколькими акцепторами (уравнение 2) может быть выражена в терминах наблюдаемых эффективностей FRET, E _i , для передачи энергии от одного донора к акцептору i как: где n = 2 , 3 при наличии двух или трех акцепторов.Обратите внимание, что время жизни донора, τ _D , отсутствует в этом уравнении, и поэтому время жизни донора (а также неопределенность его значения) не влияет на значение или ошибку в прогнозе эффективности ансамбля FRET.

Ошибка в прогнозируемой эффективности ансамбля FRET с использованием кинетической модели, была получена с использованием распространения ошибок [43] с программным обеспечением Maple (Maplesoft, Ватерлоо, Канада). Ошибка в прогнозе эффективности FRET для VCV составляет:

Расчет, используемый для оценки ошибки в прогнозе эффективности FRET для донора с тремя акцепторами, например для VCVV, значительно сложнее, чем расчет для донора только с двумя акцепторами: где выполняются следующие замены:

Благодарности

Авторы благодарят докторов наук.Кристоферу Талеру, Стивену Икеде и Туану Нгуену за критическое прочтение нашей рукописи и благодарность за многочисленные стимулирующие обсуждения и переписку, относящиеся к этому исследованию, от множества коллег, которых слишком много, чтобы их можно было упомянуть.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: SSV. Проведены эксперименты: СВК. Проанализированы данные: СВК ПСБ ССВ. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: SVK. Написал статью: SSV.

Ссылки

1. 1.Förster T (1948) Межмолекулярная миграция энергии и флуоресценция. Annalen der Physik 2: 55–75.
2. 2. Стейнберг И. З. (1971) Безызлучательный перенос энергии электронного возбуждения на большие расстояния в белках и полипептидах. Анну Рев Биохим 40: 83–114.
3. 3. Страйер Л. (1978) Перенос энергии флуоресценции как спектроскопическая линейка. Анну Рев Биохим 47: 819–846.
4. 4. Cantor CR, Schimmel PR (1980) Биофизическая химия, часть II: методы исследования биологической структуры и функции.Сан-Франциско: W.H. Freeman & Co. 846 с.
5. 5. Клегг Р.М. (1996) Перенос энергии резонанса флуоресценции. В: Ван XF, Герман Б., редакторы. Флуоресцентная визуализация, спектроскопия и микроскопия. Чичестер: John Wiley & Sons, Inc., стр. 179–252.
6. 6. Лакович Дж. Р. (1999) Принципы флуоресцентной спектроскопии. Нью-Йорк: Kluwer Academic / Plenum Publishers. 698 с.
7. 7. Валер Б. (2002) Молекулярная флуоресценция. Вайнхайм: Wiley-VCH. 387 с.
8. 8. Фогель С.С., Талер С., Кушик С.В. (2006) Причудливый FRET. Sci STKE 2006: re2.
9. 9. Rizzo MA, Springer GH, Granada B, Piston DW (2004) Улучшенный вариант голубого флуоресцентного белка, полезный для FRET. Nat Biotechnol 22: 445–449.
10. 10. Нагаи Т., Ибата К., Парк Э.С., Кубота М., Микошиба К. и др. (2002) Вариант желтого флуоресцентного белка с быстрым и эффективным созреванием для клеточно-биологических применений. Nat Biotechnol 20: 87–90.
11. 11. Koushik SV, Chen H, Thaler C, Puhl HL 3rd, Vogel SS (2006) Эталонные стандарты Cerulean, Venus и VenusY67C FRET. Biophys J 91: L99 – L101.
12. 12. Беккер В. (2005) Продвинутые методы коррелированного по времени подсчета одиночных фотонов ;. В: Castleman AW, Toennies JP, Zinth W, редакторы. Берлин, Гейдельберг, Нью-Йорк: Springer. 401 с.
13. 13. Фогель С.С., Талер С., Бланк П.С., Кушик С.В. (2009) Анизотропия флуоресценции с временным разрешением. В: Periasamy A, Clegg RM, редакторы.FLIM-микроскопия в биологии и медицине. 1-е изд. Лондон: Тейлор и Фрэнсис (CRC Group). С. 245–288.
14. 14. Malo GD, Pouwels LJ, Wang M, Weichsel A, Montfort WR, et al. (2007) Рентгеновская структура Cerulean GFP: хромофор на основе триптофана, полезный для визуализации времени жизни флуоресценции. Биохимия 46: 9865–9873.
15. 15. Rekas A, Alattia JR, Nagai T., Miyawaki A, Ikura M (2002) Кристаллическая структура венеры, желтый флуоресцентный белок с улучшенным созреванием и пониженной чувствительностью к окружающей среде.J Biol Chem 277: 50573-50578.
16. 16. Талер С., Кушик С.В., Бланк П.С., Фогель С.С. (2005) Количественная многофотонная спектральная визуализация и ее использование для измерения резонансной передачи энергии. Biophys J 89: 2736–2749.
17. 17. Фогель С.С., Бланк П.С., Кушик С.В., Талер С. (2009) Спектральная визуализация и ее использование для измерения резонансной передачи энергии Ферстера в живых клетках. В: Гадела TWJ, редактор. Технологии FRET и FLIM. ПЕРВЫЙ изд. Амстердам: Эльзевир. С. 351–394.
18. 18. Зал Т., Гаскойн Н.Р. (2004) Визуализация живых клеток с поправкой на фотообесцвечивание FRET. Biophys J 86: 3923–3939.
19. 19. Chen H, Puhl HL 3rd, Koushik SV, Vogel SS, Ikeda SR (2006) Измерение эффективности FRET и отношения концентрации донора к акцептору в живых клетках. Biophys J 91: L39–41.
20. 20. Sarkar P, Koushik SV, Vogel SS, Gryczynski I, Gryczynski Z (2009) Фотофизические свойства флуоресцентных белков Cerulean и Venus.J Biomed Opt 14: 034047.
21. 21. Ясуда Р., Харви С.Д., Жонг Х., Собчик А., ван Элст Л. и др. (2006) Сверхчувствительная активация Ras в дендритах и ​​шипах, выявленная с помощью визуализации времени жизни двухфотонной флуоресценции. Nat Neurosci 9: 283–291.
22. 22. Клегг Р. (2009) Резонансная передача энергии Форстера -FRET, что это такое, зачем это делать и как это делается. В: TWJ G, редактор. Методы FRET и FLIM. 1-е изд. Амстердам: Эльзевир. С. 1–57.
23. 23. Hettich C, Schmitt C, Zitzmann J, Kuhn S, Gerhardt I, et al.(2002) Нанометровое разрешение и когерентное оптическое дипольное взаимодействие двух отдельных молекул. Наука 298: 385–389.
24. 24. Кушик С.В., Фогель С.С. (2008) Миграция энергии изменяет время жизни флуоресценции Cerulean: последствия для визуализации времени жизни флуоресценции Измерения резонансного переноса энергии Форстера. Дж. Биомед Опт 13: 031204.
25. 25. Zacharias DA, Violin JD, Newton AC, Tsien RY (2002) Разделение липид-модифицированных мономерных GFP на мембранные микродомены живых клеток.Наука 296: 913–916.
26. 26. Эндрюс Д.Л., Демидов А.А., ред. (1999) Резонансная передача энергии. 1-е изд. Чичестер: Джон Уайли и сыновья. 468 с.
27. 27. Страйер Л., Хаугланд Р.П. (1967) Передача энергии: спектроскопическая линейка. Proc Natl Acad Sci U S A 58: 719–726.
28. 28. Ву П, Брэнд Л. (1994) Резонансный перенос энергии: методы и приложения. Аналитическая биохимия 218: 1–13.
29. 29. Jares-Erijman EA, Jovin TM (2006) Визуализация молекулярных взаимодействий в живых клетках с помощью микроскопии FRET.Curr Opin Chem Biol 10: 409–416.
30. 30. Периасамы А, Дэй Р.Н., ред. (2005) Молекулярная визуализация: FRET-микроскопия и спектроскопия. 1-е изд. Оксфорд, Нью-Йорк: Издательство Оксфордского университета. 312 с.
31. 31. Gadella TWJ (2009) FRET и FLIM Techniques ;. В: Pillai S, van der Vliet PC, редакторы. Амстердам: Эльзевир. 534 с.
32. 32. Ормо М., Кубитт А.Б., Каллио К., Гросс Л.А., Цзянь Р.Й. и др. (1996) Кристаллическая структура зеленого флуоресцентного белка Aequorea victoria.Наука 273: 1392–1395.
33. 33. Мац М.В., Фрадков А.Ф., Лабас Ю.А., Савицкий А.П., Зарайский А.Г. и др. (1999) Флуоресцентные белки небиолюминесцентных видов Anthozoa. Nat Biotechnol 17: 969–973.
34. 34. Heikal AA, Hess ST, Baird GS, Tsien RY, Webb WW (2000) Молекулярная спектроскопия и динамика внутренне флуоресцентных белков: кораллово-красный (dsRed) и желтый (цитрин). Proc Natl Acad Sci U S A 97: 11996–12001.
35. 35. Garcia-Parajo MF, Koopman M, van Dijk EM, Subramaniam V, van Hulst NF (2001) Природа флуоресцентного излучения в красном флуоресцентном белке DsRed, выявленная с помощью детектирования одной молекулы.Proc Natl Acad Sci U S A 98: 14392–14397.
36. 36. Лунис Б., Дейч Дж., Розелл Ф.И., Боксер С.Г., Моернер В.Е. (2001) Фотофизика DsRed, красного флуоресцентного белка, от ансамбля до уровня одной молекулы. J. Phys Chem B 105: 5048–5054.
37. 37. Visser NV, Hink MA, Borst JW, van der Krogt GN, Visser AJ (2002) Спектроскопия кругового дихроизма флуоресцентных белков. FEBS Lett 521: 31–35.
38. 38. Гилмор Дж, Маккензи Р.Х. (2008) Квантовая динамика электронных возбуждений в биомолекулярных хромофорах: роль белкового окружения и растворителя.J. Phys Chem. A 112: 2162–2176.
39. 39. Shaner NC, Steinbach PA, Tsien RY (2005) Руководство по выбору флуоресцентных белков. Нат методы 2: 905–909.
40. 40. Denk W, Strickler JH, Webb WW (1990) Двухфотонная лазерная сканирующая флуоресцентная микроскопия. Наука 248: 73–76.
41. 41. Thaler C, Koushik SV, Puhl HL 3rd, Blank PS, Vogel SS (2009) Структурная перестройка каталитических доменов CaMKIIα кодирует активацию. Proc Natl Acad Sci U S A 106: 6369–6374.
42. 42. Hess ST, Sheets ED, Wagenknecht-Wiesner A, Heikal AA (2003) Количественный анализ флуоресцентных свойств собственно флуоресцентных белков в живых клетках. Biophys J 85: 2566–2580.
43. 43. Bevington PR, Robinson DK (1992) Обработка данных и анализ ошибок для физических наук Нью-Йорк: McGraw-Hill, Inc. 328.

Динамическая структурная биология на основе FRET: проблемы, перспективы и призыв к практикам открытой науки

Понимание того, как биомолекулы соединяют структурную динамику с функцией, лежит в основе нескольких дисциплин и остается выдающейся целью биологии.Связывание конформационных состояний и их переходов с биохимической функцией требует способности точно определять структуру и динамику биологической системы, которая часто изменяется при связывании лиганда или под влиянием химических и физических свойств окружающей среды. Наиболее хорошо зарекомендовавшие себя инструменты структурной биологии предоставили с высоким разрешением «снимки» состояний в кристаллизованной или замороженной форме (например, рентгеновская кристаллография и криоэлектронная микроскопия одиночных частиц, криоЭМ) или усредненное по ансамблю всех конформаций. (е.g., ядерный магнитный резонанс, ЯМР; малоугловое рассеяние рентгеновских лучей, МУРР; малоугловое рассеяние нейтронов, МУРН; двойной электронно-электронный резонанс, DEER; поперечно-сшивающая масс-спектрометрия, XL-MS; ансамбль-FRET). В последние годы дальнейшие разработки позволили этим традиционным структурным инструментам обнаруживать конформационную динамику и промежуточные продукты реакции. Например, методы ЯМР (Anthis and Clore, 2015; Clore and Iwahara, 2009; Palmer, 2004; Ravera et al., 2014; Sekhar and Kay, 2019) и методы электронного парамагнитного резонанса (Jeschke, 2018; Jeschke, 2012; Krstić). и другие., 2011) были продвинуты для изучения конформационной динамики и захвата временных промежуточных соединений. Кристаллографические исследования с временным разрешением использовались для определения функционально значимых структурных смещений, связанных с биологической функцией (Kupitz et al., 2014; Moffat, 2001; Schlichting et al., 1990; Schlichting and Chu, 2000; Schotte et al., 2003). ). Достижения в микрожидкостных устройствах для смешивания и распыления позволили использовать криоЭМ с временным разрешением (Feng et al., 2017; Kaledhonkar et al., 2018) и масс-спектрометрию с поперечными связями (XL-MS или CL-MS) (Braitbard et al., 2019; Brodie et al., 2019; Чен и др., 2020; Якобуччи и др., 2019; Мураками и др., 2013; Славин, Калисман, 2018). Прогресс в вычислительных методах также предоставил новые инструменты для изучения биомолекулярной структуры и динамики. Каждое из этих достижений подчеркивает возросшее понимание того, что необходимо напрямую и непрерывно отслеживать динамические свойства отдельных биомолекул, чтобы понять их функции и регуляцию.

В этом контексте FRET (называемый резонансным переносом энергии флуоресценции или резонансным переносом энергии Фёрстера [Braslavsky et al., 2008]) исследования на ансамблевом и одномолекулярном уровнях стали важными инструментами для измерения структурной динамики по крайней мере на 12 порядков во времени и картирования конформационных и функциональных неоднородностей биомолекул в условиях окружающей среды. Исследования FRET, исследующие затухание флуоресценции на уровне ансамбля (Grinvald et al., 1972; Haas et al., 1975; Haas, Steinberg, 1984; Hochstrasser et al., 1992) (FRET с временным разрешением) позволили уже в начале 1970-х годов исследование структурных неоднородностей на временах, превышающих время жизни флуоресценции (несколько нс).Этот подход используется до сих пор (Becker, 2019; Orevi et al., 2014; Peulen et al., 2017) и перенесен в исследования одиночных молекул. Возможность измерения FRET в отдельных молекулах (Deniz et al., 1999; Ha et al., 1996; Lerner et al., 2018a) сделала этот метод еще более привлекательным. Одномолекулярный FRET (smFRET) широко используется для изучения конформационной динамики и биомолекулярных взаимодействий в стационарных условиях (Dupuis et al., 2014; Larsen et al., 2019; Lerner et al., 2018а; Lipman et al., 2003; Маргиттай и др., 2003; Мазаль и Аран, 2019; Michalet et al., 2006; Ореви и др., 2014; Ray et al., 2019; Sasmal et al., 2016; Schuler et al., 2005; Schuler et al., 2002; Steiner et al., 2008; Zhuang et al., 2000). Примечательно, что во многих механистических исследованиях достаточно использовать FRET для различения различных конформаций и определения кинетических скоростей, так что абсолютные эффективности FRET и, следовательно, расстояния не нужно определять. Однако возможность точного измерения расстояний и кинетики с помощью smFRET привела к его появлению в качестве важного инструмента в эту новую эру «динамической структурной биологии » для картирования биомолекулярных неоднородностей и измерения структурной динамики в широком диапазоне временных масштабов (Lerner и другие., 2018а; Мазаль и Аран, 2019; Санабрия и др., 2020; Шулер и Хофманн, 2013; Weiss, 1999).

Одномолекулярные методы FRET (smFRET) имеют много преимуществ в качестве метода структурной биологии, в том числе:

• чувствительность к макромолекулярным расстояниям (2,5–10 нм),

• способность разрешать структурные и динамические неоднородности,

• высококачественных измерений с низким потреблением образцов интересующих молекул (низкие концентрации и низкие объемы), поскольку образец анализируется по одной молекуле за раз,

• определение структурных переходов в равновесии, следовательно, без необходимости синхронизации,

• возможность обнаружения (очень) редких событий.Действительно, в биологии наиболее интересными молекулами для изучения часто являются редкие, функционально активные молекулы среди моря неактивных молекул,

• высокая чувствительность и специфичность для меченых молекул. Поскольку только меченая молекула вносит уникальный вклад в детектируемый сигнал, эти индикаторы также могут применяться в качестве FRET-репортеров в тесноте (Dupuis et al., 2014; Soranno et al., 2014; Zosel et al., 2020b) (отсюда smFRET может использоваться для проверки результатов, определенных изолированно, или обнаружения модуляции конформационных предпочтений и / или структурной динамики посредством так называемых пяти взаимодействий [Guin and Gruebele, 2019]), и

• высокая специфичность в отношении остатков / доменов за счет специфического мечения.Биомолекулы могут быть специально помечены уникальной парой красителей, что позволяет проводить измерения smFRET для всех размеров молекул, включая большие сложные сборки (см. Рисунок 1 [Kilic et al., 2018]), активные биологические машины (например, рибосомы) ( Dunkle et al., 2011) и даже на целых нативных вирионах (Lu et al., 2019; Munro et al., 2014).

Рабочий процесс моделирования динамических структур по измерениям FRET.

( A ) Интеграционное моделирование требует структурной и динамической информации. Предварительная информация из традиционных подходов (рентген, ЯМР, криоЭМ) вместе с вычислительными инструментами определяет пространство возможных решений для структурного моделирования с помощью FRET. Комбинация структурной (расстояния между красителями) и динамической информации (кинетическая связь и обменные курсы) позволяет идентифицировать непротиворечивую модель. ( B ) Изучение структуры и динамики хроматиновых волокон.Комбинированное TIRF и конфокальное FRET исследование структуры и динамики хроматиновых волокон с использованием трех позиций маркировки FRET (DA1-3) для двух пар красителей с различными расстояниями Ферстера. Расстояния Фёрстера (определены в разделе Расстояния между красителями, уравнение 6). Предварительная структурная информация, полученная с помощью криоэлектронной микроскопии (вверху слева) (Song et al., 2014) и рентгеновской кристаллографии (вверху, справа PDB ID: 1ZBB Schalch et al., 2005), объединена со структурной и динамической информацией. полученные в результате экспериментов FRET на иммобилизованных молекулах, измеренных с помощью микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF), и на свободно диффундирующих молекулах с помощью конфокальной микроскопии (Kilic et al., 2018). На основе объединенной информации получена согласованная модель конформаций хроматиновых волокон со смещенными регистрами, которые связаны медленными (> 100 мс) и быстрыми процессами декомпакции (150 мкс), которые протекают не напрямую, а скорее через открытое волокно. конформация. Рисунок 1B был воспроизведен с рисунков 1, 3 и 6 в Kilic et al., 2018, Nature Communications с разрешения, опубликованном под Международной общественной лицензией Creative Commons Attribution 4.0 (CC BY 4.0; https: // creativecommons.org / licenses / by / 4.0 /).

© 2018, Kilic et al. Панель B была воспроизведена с рисунков 1, 3 и 6 в Kilic et al., 2018 с разрешения, опубликованного в соответствии с Международной общественной лицензией Creative Commons Attribution 4.0.

Несколько методов были использованы для определения структурных ансамблей, таких как ЯМР, одночастичная криоЭМ или XL-MS, а недавно также smFRET в интегративном / гибридном (I / H) подходе с компьютерным моделированием для преодоления разреженности экспериментальных данных. относительно атомистического описания (Берман и др., 2019; де Соуза и Пикотти, 2020; Димура и др., 2020; Gauto et al., 2019; Кукос и Бонвин, 2020; На и Пэк, 2020; Тан и Гонг, 2020; Webb et al., 2018). Структурные модели I / H, полученные из экспериментов smFRET с использованием расстояний между красителями в качестве ограничений, были описаны для гибких свернутых белков (Brunger et al., 2011; Hellenkamp et al., 2017; Margittai et al., 2003; McCann et al., 2012). ), конформационные ансамбли неупорядоченных / неструктурированных и развернутых белков (Borgia et al., 2018; Holmstrom et al., 2018; Schuler et al., 2020), нуклеиновые кислоты и комплексы белок-нуклеиновая кислота (Craggs et al., 2019; Craggs, Kapanidis, 2012; Kalinin et al., 2012; Lerner et al., 2018b; Muschielok et al., 2008). ; Возняк и др., 2008).

Еще одним уникальным аспектом исследований smFRET является то, что структурная, кинетическая и спектроскопическая информация о больших и сложных системах может быть записана одновременно в одном измерении. Это облегчает объединение динамической и структурной информации в интегративный подход к (рис. 1A) (Hellenkamp et al., 2017; Килич и др., 2018; Ли и др., 2020b; Санабрия и др., 2020; Вассерман и др., 2016; Янез Ороско и др., 2018):

• определяют количество возможных структур, согласующихся с данными,

• потенциально снижает неоднозначность между различными структурными моделями, совместимыми с экспериментальными данными, а

• раскрывают структурно разрешенные динамические пути обмена.

В качестве примера на рисунке 1B показан результат мультимодального исследования smFRET конформационного ландшафта 12-мерного массива хроматина (~ 2.5 MDa) (Kilic et al., 2018) с динамикой, происходящей во временных масштабах от наносекунд до часов. SmFRET эксперименты могут обнаруживать гибкие конформации хроматина (рис. 1B, средняя панель), показывая их динамическую структурную неоднородность (рис. 1B, нижняя панель), в отличие от хорошо упорядоченных статических структур хроматиновых волокон (рис. 1B, верхняя панель). Эти гибкие, частично открытые и открытые конформации, которые довольно многочисленны в растворе (популяция> 70%; Рисунок 1B, нижняя панель), не были разрешены ранее, хотя они необходимы для правильной организации и функции гена.Они представляют собой центральный узел взаимопревращений для отдельных регистров стэкинга хроматина и их трудно обнаружить с помощью других структурных методов. Такой подход к визуализации биомолекул в действии в условиях окружающей среды подчеркивает важность их динамической природы, разрешая переходы между различными конформационными состояниями, что во многих случаях способствует их функции (Aviram et al., 2018; Henzler-Wildman et al., 2007; Iljina et al., 2020; Lerner et al., 2018b; Sanabria et al., 2020; Tassis et al., 2020).

SmFRET обычно выполняются с использованием двух подходов: с использованием иммобилизованных на поверхности молекул с использованием флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRFM) и обнаружения на основе камеры или со свободно диффундирующими молекулами в растворе с использованием конфокальной микроскопии и точечных детекторов. Экспериментальные системы имеются в продаже, но обычно их изготавливают самостоятельно. Образцы подготавливаются, а данные собираются с использованием протоколов для конкретных лабораторий, где данные хранятся в различных форматах файлов и анализируются с использованием набора все более мощного программного обеспечения.Для области в целом и для структурных исследований в частности важно продемонстрировать, что smFRET как метод воспроизводим и надежен независимо от того, где и как измеряется образец. С этой целью под руководством Торстена Хугеля двадцать лабораторий объединились для измерения smFRET на нескольких конструкциях дцДНК (Hellenkamp et al., 2018a). Изучая шесть различных образцов с разными красителями и различными расстояниями между красителями, средняя эффективность FRET, полученная участвующими лабораториями, показала удивительно высокую степень согласия (ΔE между 0.02 и 0,05 в зависимости от деталей образца). Количественная оценка и воспроизводимость измерений smFRET на основе интенсивности и обсуждение анализа данных стали важной вехой. Эти стандарты дцДНК FRET теперь доступны для ежедневной калибровки и особенно полезны для новых групп, присоединяющихся к сообществу.

Вдохновленный идеями, полученными в ходе вышеупомянутой попытки FRET (Hellenkamp et al., 2018a), были начаты новые многолабораторные слепые исследования.Следующее сравнительное исследование FRET, проведенное Thorben Cordes, исследует надежность и надежность экспериментов smFRET на белках, претерпевающих индуцированные лигандом конформационные изменения (Gebhardt et al., В стадии подготовки). В этом исследовании используются два различных модельных белка для оценки воспроизводимости и точности smFRET на основе белков для измерения расстояния между красителями. Белковые системы ставят новые задачи, включая статистическую маркировку красителей, специфичные для сайта свойства красителей, стабильность белков, транспортировку, хранение и конформационную динамику.Следовательно, в исследовании также оценивается способность smFRET обнаруживать и количественно оценивать динамику в различных временных масштабах от микросекунд до секунд. Еще одна задача FRET, инициированная Соней Шмид, — это программа kinSoftChallenge (http://www.kinsoftchallenge.com, Götz et al., В стадии подготовки), которая оценивает существующие инструменты для извлечения кинетической информации из временных траекторий одиночных молекул. Эта задача направлена ​​на: (1) продемонстрировать способность кинетического анализа на основе smFRET точно выводить динамическую информацию и (2) предоставить сообществу средства оценки различных доступных программных инструментов.

Одним из важных результатов различных исследований FRET в нескольких лабораториях было то, что, хотя согласие было хорошим, его можно было улучшить еще больше. В частности, анализ данных и, в частности, исправления могут повлиять на определенную эффективность FRET и результирующие расстояния. Следовательно, открытое обсуждение того, какие подходы работают наиболее надежно, при каких условиях необходимо. Доступ к первичным данным и возможность их обработки с помощью различных подходов к анализу были и останутся наиболее прозрачным способом продвижения вперед в этой области.В настоящее время это сложно, учитывая множество вариантов используемых методов, их документации, форматов файлов и экспериментальных процедур, применяемых в разных лабораториях, для установления оптимальных условий, рабочего процесса и передовых практик даже для существующих, хорошо протестированных методов, поскольку сравнение этих методов затруднительно. требует много времени, а необходимая информация во многих случаях недоступна. С расширением открытых научных практик и представлением опубликованных данных в репозитории необходим консенсус относительно того, какие данные и метаданные следует хранить и в каких возможных форматах, чтобы их могло легко использовать сообщество.

В связи с этими соображениями и множеством возможностей для роста сообщества smFRET, несколько лабораторий, обладающих опытом в FRET, без претензии на исчерпывающий или исключительный характер, собрались, чтобы поддержать эти усилия и предложить шаги по организации сообщества вокруг последовательной и открытой науки. практики. Это действие переводится в общие методологические рекомендации или предложения, которые мы представляем после типичного рабочего процесса эксперимента smFRET, включая подготовку и определение характеристик образцов, описание установки, сбор и сохранение данных, а также анализ данных.Эти рекомендации о том, как «практиковать» smFRET, являются , а не попыткой систематизировать сообщество, а скорее первоначальным предложением, которое направлено на поощрение открытого диалога о существующих практиках в нашей области и приводит к более высокой воспроизводимости результатов экспериментов smFRET. Затем мы обсуждаем практику открытой науки, а также первые шаги, которые были предприняты для формирования международного сообщества FRET. В заключение мы выделим несколько областей, в которых smFRET окажет большое влияние в различных областях науки в ближайшем будущем.

Динамическая настройка FRET в биосенсоре зеленого флуоресцентного белка

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Кристаллическая структура Twitch-2B

Мы расшифровали структуру с разрешением 2,5 Å (таблица S1A). Асимметричный блок состоит из двух мономеров (рис. S1A). Они представляют идентичные конформации отдельных доменов [среднеквадратичные отклонения (RMSDs) ниже 0,2 Å] и несколько иную междоменную конформацию (RMSD 0,992 Å), хотя, по-видимому, не собираются как симметричный гомодимер.Их интерфейс (рис. S1B), покрывающий 630 Å ² ( 11 ), на самом деле значительно меньше, чем интерфейс стабильного димера ( 12 ). Кроме того, данные малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР) показывают, что в растворе Twitch-2B является мономерным (рис. S2). Поэтому мы сфокусируем наше описание здесь на мономере A. Кристаллическая структура показывает расположение донора и акцептора относительно минимального кальций-связывающего домена TnC, а также структуру оптимизированных линкеров (рис.1). Структура кальций-связывающего домена очень похожа на C-концевой глобулярный домен куриного TnC (RMSD 0,84 Å) ( 13 ), на структуру ЯМР, решенную ранее ( 8 ), и на структуру кальмодулина. (RMSD 1,08 Å) ( 14 ). Главные оси двух бочкообразных β-доменов флуоресцентного белка ориентированы почти под перпендикулярным углом друг к другу. Стволы β практически не контактируют друг с другом (рис. 2A) с очень маленькой общей границей раздела (150 Å ² ).Интерфейсы минимального кальций-связывающего домена с mCerulean3 и cpVenus ^cd также относительно малы, охватывая только 257 и 351 Å ² соответственно (см. Ниже). Взаимодействия в основном носят гидрофильный характер (рис. 2А).

( A ) Полярные взаимодействия между остатками минимального домена TnC, mCerulean3 и cpVenus ^cd показаны пунктирными линиями. Остатки показаны в виде палочек.( B ) Полярные взаимодействия, опосредованные остатками (показаны в виде палочек) от линкеров между mCerulean3 и кальций-связывающим доменом (у лосося), а также взаимодействия между cpVenus ^cd и кальций-связывающим доменом (пурпурный) . ( C ) Гидрофобные взаимодействия между остатками (показаны в виде палочек) линкеров между mCerulean3 и кальций-связывающим доменом (у лосося), а также линкером между cpVenus ^cd и кальций-связывающим доменом (пурпурный) с остатками (серым цветом) из ядра минимального домена TnC.( D и E ) Крупный план области вокруг N532 Twitch-2B и мутанта N532F Twitch-2B (Twitch-6).

Линкер между mCerulean3 и кальций-связывающим доменом (V ₂₃₂ ADA) образует спираль 3 ₁₀ , которая прочно удерживается на месте водородными связями основной цепи от V232 и S236 в mCerulean3 до E301 и E239 кальция. -связывающий домен (рис. 2Б). Затем линкер между кальций-связывающим доменом и cpVenus ^cd (P ₃₀₅ IYPEL) образует полтора α-спиральных витка (рис.2, B и C), карбонилы основной цепи E309 и L310 образуют водородные связи с боковой цепью R551 (рис. 2B) cpVenus ^cd . Боковая цепь E309 также образует водородную связь с Y152 mCerulean3, плотно связывая три домена вместе. Остатки I306, Y307 и L310 этой короткой спирали участвуют в сети гидрофобных контактов (рис. 2C). Очевидно, что скрининг оптимальных линкеров ( 8 ) привел к последовательностям со спиральными элементами, очень хорошо интегрирующимися в структуру минимального домена TnC, в то время как эти линкеры удерживают на месте донорный и акцепторный домены в основном за счет полярных взаимодействий.

Расчет эффективности FRET на основе структуры

Структура предоставила важную информацию для расчетов FRET. Во-первых, расстояние между центрами масс флуорофоров составляет 3,65 нм (рис. 1B). Затем внутри структуры флуорофоры mCerulean3 и cpVenus ^cd выровнены в конфигурации «голова к голове». Таким образом, мы могли точно определить относительную ориентацию дипольных моментов флуорофоров (рис. 1C; см. Материалы и методы), которые доступны из расчетов теории функционала плотности ( 15 ).Используя эту объединенную информацию, мы вычислили коэффициент ориентации κ ² , равный 1,98 (уравнение 1; Материалы и методы), и расстояние Ферстера, R ₀ , 6,9 нм для mCerulean3 / cpVenus ^cd . Пара FRET (уравнение 3; материалы и методы). С этими параметрами, используя уравнение Фёрстера, E = R06 / (R06 + r6), теоретическая эффективность FRET, E , Twitch-2B была определена как 0,98. Эффективность FRET, экспериментально определенная с помощью деканшинга донора, равна 0.78 (рис. S3A), что значительно ниже, чем полученное из кристаллической структуры.

Два мономера Twitch-2B в асимметричном блоке (рис. S1A) не только имеют очень похожую конформацию (RMSD основной цепи 0,992 Å), но также образуют очень похожие контакты упаковки кристаллов (рис. S1C). Таким образом, мы делаем вывод, что ориентация доменов в мономере сама по себе не ограничивается кристаллической упаковкой, а в основном внутримономерными взаимодействиями, описанными выше (рис. 2А), и очень вероятно выбрана из пула уже существующих конформаций в растворе.Поскольку междоменные интерфейсы в мономере Twitch-2B относительно малы (рис. 2A), высокая гибкость решения может быть причиной наблюдаемого снижения эффективности FRET. Чтобы исследовать эту гипотезу, мы затем обратили внимание на передовые методы ЯМР.

ЯМР-исследование динамики биосенсора

Чтобы получить представление о возможной динамике, мы использовали парамагнитный ЯМР ( 16 ) с образцом Twitch-2B, где два сайта связывания кальция TnC были загружены диспрозием (Dy).Анизотропная магнитная восприимчивость комплекса TnC-Dy ₂ индуцирует парамагнитный тензор выравнивания, который может быть определен из структуры ( 17 ) (см. Материалы и методы). Мы использовали спектрометры на 900 МГц и 1,1 ГГц, поскольку тензор юстировки квадратично зависит от магнитного поля. Если данный флуоресцентный белок является жестким по отношению к TnC, то тензор выравнивания, который он испытывает, идентичен TnC. Если, однако, флуоресцентный белок является динамическим по отношению к TnC, то это движение уменьшит тензор выравнивания первого ( 16 , 18 ).Это позволяет количественно оценить динамику флуоресцентных белков по отношению к TnC. В то время как диполярные связи усредняются в изотропном растворе из-за случайного изотропного переворачивания, парамагнитно-индуцированные тензоры выравнивания приводят к анизотропному распределению ориентации TnC и, следовательно, прикрепленных зеленых флуоресцентных белков в растворе, что приводит к неполному усреднению диполярного муфты, позволяющие наблюдать остаточные диполярные связи (RDC). Мы определили RDC метильных групп парамагнитно выровненного Twitch-2B ( 19 ) (см. Материалы и методы).Наблюдаемый диапазон RDC достаточен для измерения размера тензора выравнивания ( 20 ), так что отнесение метильных групп не было необходимым.

Мы обнаружили, что диапазон значений RDC и, таким образом, тензор выравнивания, испытываемый флуоресцентными белками, в 10 раз меньше, чем рассчитанные на основе жесткой рентгеновской структуры (рис. 3; см. Материалы и методы). Таким образом, динамика должна быть причиной несоответствия между расчетной и экспериментальной эффективностями FRET.Кристаллическая структура может быть только частью динамического конформационного ансамбля в растворе.

Прогнозирование RDC метильных групп в двух доменах флуоресцентного белка и TnC с использованием рентгеновской структуры (выделено пурпурным цветом). Тензор выравнивания, индуцированный двумя ионами диспрозия, связанными с TnC, является результатом трансляции тензора, полученного из кальмодулина (см. Материалы и методы). Экспериментальные RDC от парамагнитного ЯМР Twitch-2B (зеленый) и Twitch-6 (пурпурный).Дальность действия уменьшается в 10 и 5 раз для Twitch-2B и Twitch-6 соответственно.

Конструирование мутанта на основе структуры с улучшенной эффективностью FRET

Предполагая структурную целостность отдельных доменов, мы предположили, что линкерные области являются стержнем этой динамики. На границах раздела между доменом TnC и донорным и акцепторным доменами преобладают полярные взаимодействия (рис. 2А). Мы предположили, что замена этих взаимодействий гидрофобными контактами сделает линкеры жесткими и увеличит экспериментальную эффективность FRET.С этой целью мы разработали мутацию N532F (рис. 2, D и E) на поверхности cpVenus ^cd , создавая новое взаимодействие с F249 кальций-связывающего домена (рис. 2D). Как и ожидалось, эта мутация вызвала существенное увеличение максимального изменения отношения FRET с 800 до 1100% in vitro (рис. S4). В кристаллической структуре этого мутанта (Twitch-6; таблица S2) боковая цепь F532 действительно связывается в гидрофобный карман, образованный боковыми цепями F249, Asp262 и Y338 (рис. 2E).В остальном структуры Twitch-6 и Twitch-2B очень похожи (RMSD 0,25 Å), что приводит к почти идентичной теоретической эффективности FRET (см. Дополнительные материалы). Благодаря этой конструкции экспериментальная эффективность FRET Twitch-6 увеличилась до 0,90, с 0,78 для Twitch-2B (рис. S3B), а диапазон RDC, измеренных с Twitch-6, удвоился по сравнению с Twitch-2B (рис. 3). . Это указывает на сужение интерфейса между доменом TnC и cpVenus ^cd , и, таким образом, снижение динамики между доменами является причиной увеличения FRET.

Конформационные ансамбли в решении

Определив динамику как причину снижения эффективности FRET Twitch-2B в решении, мы хотели получить представление о конформационном пространстве, возникающем в результате этой динамики. Для этой цели мы выбрали конформационные ансамбли, исследующие динамику скелета исключительно на динамических линкерных областях между доменами флуоресцентного белка и доменом TnC (см. Материалы и методы), оценивая более 1 миллиона шестичленных ансамблей в сравнении с наблюдаемыми RDC и эффективностью FRET (Таблица 1, рис.4 и Материалы и методы). Среди всех возможных ансамблей мы выбрали тот, который лучше всего воспроизводит как экспериментальную эффективность FRET, так и диапазон RDC (Таблица 1). Этот ансамбль полностью объясняет, как гибкость неупорядоченных остатков линкерных областей приводит к наблюдаемому снижению эффективности FRET и диапазона RDC.

Ансамбли для Twitch-2B (слева) и Twitch-6 (справа) содержат по шесть структур каждый, причем самые большие отклоняющиеся структуры показаны зеленым и красным.Состояния, которые не являются этими крайними конформациями, прозрачны.

Влияние на улучшенную конструкцию датчика FRET

Таким образом, мы получили кристаллическую структуру флуоресцентного биосенсора кальция Twitch-2B и вместе с динамикой линкеров, определенной с помощью парамагнитного ЯМР, мы количественно оценили эффективность FRET. Поскольку динамика ограничивала эффективность FRET, мы успешно сконструировали ригидифицированный мутант с увеличенным FRET. Таким образом, структурные и динамические характеристики ратиометрических датчиков FRET обеспечили принципы проектирования, которые могут быть применимы к другим системам, в которых эффекты FRET используются для восприятия сигналов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клонирование, экспрессия и очистка Twitch-2B и Twitch-6

Конструкция Twitch-2B была описана ранее ( 8 ). Для настоящего исследования кодирующую последовательность трехдоменного слитого белка клонировали в модифицированный вектор pET16b, кодирующий слитый белок с N-концевой меткой His ₇ и последовательностью расщепления, распознающей вирус травления табака (TEV). Мутант Twitch-2B N532F (Twitch-6) был создан с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза QuikChange (Agilent).Экспрессионные конструкции pET16bTEV-Twitch-2B и pET16bTEV-Twitch-6 трансформировали в штамм Escherichia coli BL21 (DE3). Экспрессию белка проводили при 303 К индукцией 0,5 мМ изопропил-β-d-1-тиогалактопиранозидом. Клетки собирали через 7 часов после индукции. Меченый селенометионином белок Twitch-2B был сверхэкспрессирован в штамме метионин-ауксотроф E. coli B834 в минимальной среде с добавлением (+) — l-селенометионина в соответствии с группой по экспрессии белка EMBL (Европейская лаборатория молекулярной биологии) (www.embl.de).

Осадок клеток из 1 литра встряхиваемой культуры ресуспендировали в 60 мл лизирующего буфера [20 мМ трис-HCl (pH 7,9), 300 мМ NaCl, 20 мМ имидазол, 0,5 мМ фенилметилсульфонилфторид с одной таблеткой полного количества ЭДТА- свободных ингибиторов (Roche) на 100 мл лизирующего буфера]. Клетки лизировали ультразвуком с последующим центрифугированием при 27000 g и 277 К. Из супернатанта рекомбинантный белок очищали с помощью аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом на 3 мл агарозной смолы Ni-нитрилотриуксусной кислоты (NTA) (Qiagen).Метку слияния His ₇ отщепляли протеазой TEV и удаляли инкубацией с 1 мл Ni-NTA агарозной смолы. Белок диализовали против 20 мМ трис (pH 7,0) и 150 мМ NaCl. После доведения концентрации сульфата аммония в растворе белка до 1 М белок дополнительно очищали с помощью хроматографии гидрофобного взаимодействия на колонке с фенилсефарозой (GE Healthcare) объемом 10 мл. Белок элюировали с этой колонки 50-мл градиентом от 1 до 0 М сульфата аммония.Фракции, содержащие белок, объединяли и концентрировали до объема 2,5 мл с помощью концентратора для ультрафильтрации с MWCO 30 кДа (отсечение молекулярной массы) (Vivascience). Наконец, белок очищали эксклюзионной хроматографией на гель-фильтрационной колонке HiLoad 26/60 Superdex 200 мкг. Фракции пика объединяли, диализовали против 20 мМ трис-HCl (pH 7,0), 100 мМ NaCl и 5 мМ CaCl ₂ , и концентрацию белка доводили до 20 мг / мл.

Флуоресцентная спектроскопия

Для спектроскопии рекомбинантного Twitch-2B in vitro белок был очищен от E.coli с использованием смолы Ni-NTA, как описано ( 6 ). Спектроскопию выполняли на спектрофотометре Cary Eclipse (Varian). Донорское расщепление Twitch-2B проводили путем переваривания Twitch-2B в связанном с кальцием состоянии в течение ночи при комнатной температуре с химотрипсином (70 Ед / мл; Sigma-Aldrich) при записи FRET. Небольшая оставшаяся эмиссия cpVenus ^cd после расщепления химотрипсина была выборочно фотообесцвечена (5 мин) с помощью массива из шести светодиодов Luxeon Lumiled с пиком на длине волны 530 нм, с общей рассеиваемой мощностью 14.7 Вт и 870 люмен. Для защиты mCerulean3 от обесцвечивания использовали LP (длиннопроходный) фильтр с длиной волны 500 нм. Связанный с кальцием Twitch-6 был очень устойчив к расщеплению протеазой. Следовательно, EGTA (конечная концентрация, 5 мМ) добавляли во время переваривания химотрипсина, чтобы получить спектр деквенированного mCerulean3.

Кристаллизация, сбор данных и определение структуры

Кристаллы Twitch-2B и Twitch-6 были получены путем диффузионного смешивания паров 1 мкл раствора белка с 1 мкл раствора для лунок [0.2 M Na-формиат (pH 7,0), 5 мМ CaCl ₂ и от 18 до 20% полиэтиленгликоля 3350]. Кристаллы были подвергнуты криозащите, перенеся их в хорошо раствор с добавлением от 16 до 18% глицерина на 1 мин и быстро охладив, погрузив их в жидкий азот.

Сбор данных производился в PXII, SLS, Швейцария, с использованием детектора PILATUS 6M (Dectris). Собственные данные собирали при 100 К на длине волны 1 Å. Данные по производному селенометионина были измерены при 0,98 Å. Все данные были обработаны с помощью программного обеспечения для детектора рентгеновских лучей (XDS) ( 21 ) и масштабированы с помощью SADABS (Bruker AXS).Определение пространственной группы и статистический анализ выполняли с использованием XPREP (Bruker AXS). Фазирование выполняли с помощью AutoSol ( 22 ).

Первоначальная модель была построена с помощью AutoBuild и дважды уточнена с помощью phenix.refine ( 23 ) с промежуточным созданием модели вручную с помощью Coot ( 24 ). Окончательная модель была получена путем комбинированного ручного отслеживания (Coot) и уточнения с использованием Refmac5 ( 25 ). На графике Рамачандрана 96,69% ​​остатков располагались в предпочтительной области 2.72% в разрешенной области и 0,58% остатков были выбросами. Кристаллическая структура Twitch-6 была решена с помощью PHASER ( 26 ) с использованием PDB (Protein Data Bank) запись 6GEL в качестве модели поиска. Построение и уточнение модели выполнялись, как описано для Twitch-2B. Для этого мутанта 96,68% остатков попали в предпочтительную область графика Рамачандрана, 2,83% попали в разрешенную область и 0,49% были выбросами.

Расчеты FRET

Фактор ориентации κ ² может быть извлечен из структурной информации следующим образом: κ2 = (cos θT — 3 cos θD cos θA) 2 (1) где θ _T — угол между эмиссионным переходом диполь донора и диполь перехода поглощения акцептора; θ _D и θ _A — углы между этими диполями и вектором r , соединяющим донорный и акцепторный флуорофоры ( 27 ).Ориентация дипольных моментов перехода относительно вектора связи C → O (ω) в градусах ωD = 73 ° ωA = 76 ° была взята из Ansbacher et al. ( 15 ), а угловые параметры были извлечены из кристаллографических координат в угловых единицах θT = 152,95 ° θD = 149,17 ° θA = 26,79 °

Подробные расчеты поясняются в файле данных S1. Интеграл перекрытия J (λ) был рассчитан из экспериментальных спектров поглощения и излучения изолированных доменов cpVenus и mCerulean3 соответственно (рис.S5) со сценарием Python, включенным в качестве дополнительной информации. J (λ) был определен как 2,052 × 10 ¹⁵ M ⁻¹ см ⁻¹ нм ⁴ , следующим образом: J (λ) = ∫0∞FD (λ) εA (λ) λ4dλ = ∫0∞FD (λ) εA (λ) λ4dλ∫0∞FD (λ) dλ (2) где F _D (λ) — нормированная интенсивность флуоресценции донора в диапазоне длин волн от λ до λ + Δλ. ε _A (λ) — коэффициент экстинкции акцептора при λ.

Расстояние Ферстера, R ₀ , может быть вычислено из ранее полученных экспериментальных параметров R0 = 0.211 (κ2n − 4QDJ (λ)) 1/6 (3) где Q _D (0,87) — квантовый выход донора в отсутствие акцептора ( 4 ) и n , (1,33) показатель преломления водной среды.

Наконец, эффективность передачи энергии, E , может быть рассчитана как отношение скорости передачи к общей скорости распада донора в присутствии акцептора E = R06R06 + r6 (4)

Следуя этой процедуре, эффективность FRET была определена как E = 0.979, из кристаллографической структуры Twitch-2B. Эквивалентный расчет, выполненный со структурой мутанта Twitch-6, дает E = 0,983 (см. Файлы данных S1 и S2).

ЯМР-спектроскопия

Мы экспрессировали белки Twitch-2B и Twitch-6 в минимальной среде Toronto, приготовленной из 100% D ₂ O и пердейтерированной d-глюкозы и дополненной предшественниками аминокислот α-кетомасляной кислотой (метил-13C , 3,3-D2) и α-кетоизовалериановой кислоты (3-метил-13C, 3,4,4,4-D4), таким образом, селективно мечение атомами ¹³ C и ¹ H только метильных групп остатки валина, лейцина и изолейцина, сохраняя при этом остальные атомы C равными ¹² C и протонами ² H ( 19 ).

Сначала изотропные спектры образцов получали в буфере A [20 мМ Mops (pH 7,0), 100 мМ NaCl и 5 мМ CaCl ₂ в 100% D ₂ O]. Затем белки диализовали против буфера B [20 мМ Mops (pH 7,0), 100 мМ NaCl и 10 мМ EDTA] с последующим диализом против буфера C [20 мМ Mops (pH 7,0) и 100 мМ NaCl] и, наконец, заменяли на буфер С, приготовленный на 100% D ₂ O, содержащем три эквивалента диспрозия, перед измерениями ЯМР. Концентрация белка в образцах была примерно 0.5 мМ.

Образцы были протестированы с помощью экспериментов с метил-TROSY ( 19 , 28 ) (рис. S7) при 900 МГц и 1,1 ГГц, а связи J и J + RDC были определены с использованием J -модулированного Эксперимент с метил-TROSY ( 29 ), изображенный на рис. S6 в виде матриц 2048 × 128 комплексных точек данных с 96 переходными процессами на приращение ( t ₁ ). Общие задержки модуляции J были следующими: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 и 20 мс (рис.S8). ЯМР-эксперименты проводились с использованием 5-мм TCI (криозонда тройного резонанса с инверсным детектированием) на спектрометре 900 МГц и 3-мм криозонда TCI на спектрометре 1,1 ГГц, оба оснащены консолями NEO (Bruker). Интенсивности (максимальная амплитуда) сигналов были извлечены с помощью CARA (компьютерное определение резонанса) ( 30 ) в экспериментах с обработкой NMRPipe ( 31 ) и проанализированы с помощью скриптов Python (рис. S8), следуя Pederson et al. ( 29 ).

Расчет парамагнитного тензора

Мы взяли парамагнитный тензор из комплекса кальмодулин-IQ, связанного с диспрозием, из ( 18 ) и рассчитали суммарный тензор дважды занятого кальций-связывающего домена TnC. Сайт связывания кальция 1 TnC перекрывается с сайтом связывания лантанидов кальмодулина (CaM N60D). Мы повернули матрицу выравнивания с сайта связывания кальция из CaM на второй сайт связывания кальция TnC и добавили его к тензору сайта связывания кальция 1, таким образом получив общий тензор TnC.Затем этот тензор использовался для расчета RDC из парамагнитных белков Twitch ACaM = (1,05 10−31−1,92 10−322,04 10−31−1,92 10−32−1,22 10−316,46 10−322,04 10−316,46 10−321,67 10−32 ) ATwitch = (1,46 10-318,39 10-323,46 10-318,39 10-32-1,06 10-312,26 10-323,46 10-312,26 10-32-3,92 10-32)

Тензоры даны в м ³ M ⁻¹ .

Генерация ансамбля

Сначала мы индивидуально смоделировали все возможные двугранные углы основной цепи (ϕ и ψ; выборка с шагом 60 °) линкерных остатков (от Arg ²²⁹ до Gln ²³¹ для mCerulean3 и Met ³¹¹ до Gly ^{313 ​​} для cpVenus), что не привело к стерическому конфликту между одним из модифицированных доменов флуоресцентного белка и доменом TnC.Каждую из двух линкерных областей моделировали независимо. Из всех возможных комбинаций ϕ, ψ (117 649) вращение mCerulean3 привело к 477 возможным конформациям, в то время как cpVenus допустил 84 конформации, обеспечивая в целом 40 086 возможных конформаций.

Во-вторых, мы случайным образом объединили возможные структуры для mCerulean-TnC и TnC-cpVenus в ансамбли из шести членов. Мы произвольно отобрали 1 миллион шестичленных ансамблей из 40 068 возможных ϕ, ψ комбинаций линкеров между mCerulean и TnC и между TnC и cpVenus, чтобы гарантировать правильное исследование конформационного пространства Twitch.

В-третьих, мы рассчитали диапазон RDC (используя тензор, полученный, как описано выше) и FRET ансамблей и сравнили их с экспериментальными значениями, определив коэффициент качества ансамбля Qens = ∑i = 1i = 6 (RDCi − RDCeRDCe) 2+ (FRETi-FRETeFRETe) 2, где RDC _i — это диапазоны распределения, субиндекс e указывает экспериментальное значение, а i указывает значение из члена ансамбля. Такое значение добротности отличается от 0, если согласования предсказанных откликов RDC и FRET от ансамбля отклоняются от экспериментальных данных, и 0 в случае полного согласия.Наконец, ансамбли были отсортированы по их Q _Ens , и был выбран самый низкий из них.

Измерения SAXS

SAXS были собраны на канале BM29 Европейского центра синхротронного излучения (ESRF) в Гренобле, Франция, с использованием автоматического устройства смены образцов ( 32 ). Белок диализовали либо против буфера A [20 мМ Mops (pH 7,0), 100 мМ NaCl и 5 мМ CaCl ₂ ] (связанное с кальцием состояние), либо против буфера B [20 мМ Mops (pH 7,0), 100 мМ NaCl и 10 мМ ЭДТА] (без кальция).Перед измерением белок центрифугировали для удаления более крупных частиц. Образцы измеряли при концентрациях 2,5, 10 и 20 мг / мл. Буфер для диализа использовали для коррекции эталонного буфера. Данные собирали при 293 К с использованием длины волны 0,995 Å и расстояния от образца до детектора 2,867 м. Загружали сто микролитров каждой концентрации образца, собирали и объединяли 10 кадров. Образцы непрерывно подавались в кювету, чтобы свести к минимуму эффекты радиационного повреждения.Изображения детектора были объединены и преобразованы в одномерные кривые рассеяния, а вклады буфера в рассеяние были вычтены с использованием программного обеспечения BsxCuBE. Дальнейшая обработка данных выполнялась автоматически с использованием онлайн-конвейера EDNA ( 33 ) для оценки качества образца и эффектов радиационного повреждения. Агрегации белков или радиационного повреждения не наблюдалось.

Данные были дополнительно проанализированы с помощью программного пакета ATSAS ( 34 ). Вкратце, первичная обработка и анализ данных были выполнены с использованием программ PRIMUS ( 35 ) и GNOM ( 36 ).

Теоретическое рассеяние от кристаллической структуры было рассчитано с использованием программы CRYSOL ( 37 ) (рис. S2), а молекулярные массы рассчитаны с использованием образца бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта.

Благодарности: Мы благодарим персонал компании SLS, X10SA за поддержку при сборе рентгеновских данных и ESRF, BM29 за поддержку при сборе данных SAXS. Мы благодарим M. Paulat, C. Schwiegk и A. Moritz за техническую помощь в производстве белка и K.Оверкамп для масс-спектров электроспрея. С. благодарит T. Gruene и G. Sheldrick за советы по уточнению кристаллической структуры и структурному анализу. К.Г. и П.Т.-М. поблагодарить R. Kuemmerle (Bruker Biospin) за измерения ЯМР на частоте 1,1 ГГц. Источник: Эта работа была поддержана Обществом Макса Планка и DFG SFB 870 (O.G.). П.Т.-М. был поддержан докторской стипендией Гумбольдта. Вклад авторов: P.T.-M. выполнен ЯМР. П.Т.-М. и К.Г. разработал парамагнитный метод ЯМР.П.Т.-М. рассчитаны структурные ансамбли. П.Т.-М. и С. выполнены измерения SAXS. К.Г. рассчитал FRET по рентгеновским структурам. T.T. и O.G. определили экспериментальные эффективности FRET. С. кристаллизовал Twitch-2B и Twitch-6 и решил кристаллические структуры. Рукопись написана всеми авторами. С. разработал проект. Конкурирующие интересы: Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов. Доступность данных и материалов: Структуры депонированы с кодом 6GEL для биосенсора Twitch-2B и 6GEZ для мутанта Twitch-2B N532F (Twitch-6).Все данные, необходимые для оценки выводов в статье, представлены в документе и / или дополнительных материалах. Дополнительные данные, относящиеся к этой статье, могут быть запрошены у авторов.

Interbase FRET в РНК: от А до Я | Исследование нуклеиновых кислот

Аннотация

Interbase FRET может предоставить очень подробную информацию о расстоянии, ориентации и динамике нуклеиновых кислот, дополняя существующие методы структуры и динамики.Здесь мы сообщаем о первой паре аналогов основания РНК FRET, состоящей из донора tC ^O и неэмиссионного акцептора tC _nitro . Акцепторный рибонуклеозид здесь синтезирован и впервые включен в РНК. Эта пара FRET точно сообщает среднюю структуру РНК A-формы, и ее полезность для исследования структурных изменений РНК демонстрируется путем мониторинга перехода от A- к Z-форме РНК. Наконец, измеренные данные FRET сравнивали с теоретическими паттернами FRET, полученными из двух ранее описанных структур Z-RNA PDB, чтобы пролить новый свет на эту неуловимую конформацию РНК.

ВВЕДЕНИЕ

Биологические роли различных РНК жизненно важны и разнообразны и включают кодирование, регуляцию и экспрессию генов, а также катализ. Это отражает важность вторичной и третичной структуры и динамики для их функции, что подчеркивает необходимость разработки инструментов, которые могут исследовать такие параметры (1). Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET) — это процесс, в котором энергия передается без излучения между донорным и акцепторным хромофором.Эффективность этого процесса сильно зависит как от расстояния, так и от ориентации между хромофорами; следовательно, может быть получена информация о структуре и / или относительном положении различных меченных донорами и акцепторами биомолекул в физиологических условиях in vitro, или даже в живых клетках (2, 3). FRET особенно ценен для изучения больших и гибких структур, таких как РНК и комплексы РНК-белок, которые трудно поддаются традиционным методам высокого разрешения, таким как ЯМР и рентгеновская кристаллография (4).Этот метод также можно использовать для получения более подробной информации о структуре и динамике, например, путем объединения измерений FRET одиночных молекул с подробным анализом и моделированием (5).

На сегодняшний день внешние хромофоры с (предположительно) случайной ориентацией использовались в большинстве исследований FRET для определения совместной локализации и расстояний, что означает, что используется только зависимость от расстояния. Например, индуцированное ионами сворачивание изломов в РНК было исследовано с использованием мечения концов флуоресцеином и Cy3 (6).Одним из способов повышения уровня информации, получаемой от FRET в системах РНК, могло бы быть использование аналогов флуоресцентных оснований, которые прочно расположены внутри нуклеиновой кислоты и, следовательно, сообщают как о расстоянии, так и об относительной ориентации между донором и акцептором. Было показано, что это позволяет с высокой точностью исследовать структурные изменения в ДНК (7,8). До сих пор сообщалось об ограниченном количестве FBA для РНК, например tC ^O (9), тиено [3,4- d ] пиримидины ( ^th A, ^th C, ^th G и ^th U) (10) и изотиазоло [4,3 — d ] пиримидинов ( ^tz A, ^tz C, ^tz G и ^tz U) (11), суррогат U, применяемый в исследованиях связывания малых молекул РНК (12), аналог пиримидина для G-квадруплексные исследования (13) и нуклеозиды расширенной РНК (кРНК) (14).Однако межосновной FRET был исследован только для ДНК с использованием либо неэмиссионного акцептора (FRET-пары tC ^O –tC _nitro (15), qAN1 – qA _nitro (8) и pA – qA _nitro ). (16)) или эмиссионного акцептора ( ^th dG – tC) (17). Использование эмиссионного акцептора теоретически может обеспечить простое колориметрическое считывание и простой и полезный внутренний контроль эффективности FRET при условии, что полосы эмиссии донора и акцептора существенно разделены.Однако большинство FBA с высокой эмиссией излучают в довольно узком диапазоне длин волн (400–500 нм), и результирующее перекрытие эмиссии может добавить дополнительный уровень сложности и неопределенности к анализу FRET. Напротив, неэмиссионный акцептор позволяет количественно оценить эффективность FRET просто как уменьшение флуоресценции (или времени жизни) донора по сравнению с флуоресценцией одного донора, что значительно упрощает анализ данных и повышает точность.

Здесь мы сообщаем о первых исследованиях межосновного FRET в РНК с использованием пары FRET tC ^O –tC _nitro (Рисунок 1).Неэмиссионная акцепторная молекула tC _nitro впервые синтезирована и охарактеризована для использования в контексте РНК. В сравнительном исследовании мы видим отличное соответствие между наблюдаемыми и теоретически предсказанными значениями эффективности FRET для РНК А-формы без существенных признаков структурных нарушений по сравнению с дуплексом РНК естественной формы А, что указывает на то, что эту пару FRET можно использовать для исследования структурные изменения внутри РНК с высокой точностью. Более того, общее использование межосновного FRET для исследования структурных изменений в РНК продемонстрировано здесь с использованием конформационного изменения от A- к Z-форме.

Рисунок 1.

Структура эмиссионного донора FRET tC ^O и неэмиссионного акцептора FRET tC _nitro .

Рисунок 1.

Структура эмиссионного донора FRET tC ^O и неэмиссионного акцептора FRET tC _nitro .

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Синтез и характеристика рибо-tC _нитро фосфорамидита представлены в дополнительных данных.Фосфорамидит рибо-tC ^O был синтезирован согласно литературным данным (9). Твердофазный синтез tC ^O / tC _нитро -модифицированных олигорибонуклеотидов и их характеристика описаны в дополнительных данных.

Все использованные образцы, если не указано иное, были приготовлены в 10 мМ натрий-фосфатном буфере, pH 7,4, с добавлением 100 мМ NaCl и 1 мМ EDTA. Все образцы были смешаны и обработаны в стерильной среде, свободной от РНКазы. Концентрацию олигонуклеотида определяли путем измерения поглощения при 260 нм.Молярную поглощающую способность немодифицированных одиночных цепей олигонуклеотидов при 260 нм рассчитывали с использованием онлайн-анализатора олигонуклеотидов IDT (Integrated DNA Technologies; http://eu.idtdna.com/calc/analyzer). Молярная абсорбционная способность модифицированных цепей была рассчитана таким же образом с заменой модифицированного основания на цитозин и с поправкой на разницу молярной абсорбции между цитозином (ϵ = 7400 M ^-1 см ^-1 ) и tC ^O ( ϵ = 11000 M ⁻¹ см ⁻¹ ) или tC _nitro (ϵ = 9700 M ⁻¹ см ⁻¹ ) на длине волны 260 нм.

Гибридизация образцов РНК А-формы, используемых для УФ-плавления и кругового дихроизма, была достигнута путем смешивания каждой донорной цепи с равным количеством акцепторной цепи при 22 ° C с последующим быстрым нагреванием до 95 ° C и, через 10 мин, охлаждение до 5 ° C при 7,5 ° C h ^-1 . Концентрация донорных нитей при отжиге составляла 4 мкМ. Образцы РНК в форме A – Z, используемые для УФ-плавления и кругового дихроизма, были приготовлены аналогичным образом, за исключением того, что каждая донорная цепь была смешана с 30% избытком ее комплементарной цепи (для обеспечения полной гибридизации донорных цепей) и что концентрация доноров при отжиге составляла 5.08 мкМ.

Образцы для эталонного исследования A-РНК FRET были гибридизованы, как указано выше, с 30% избытком его комплементарной цепи (для обеспечения полной гибридизации донорных цепей) и концентрацией донорной цепи 2 мкМ во время отжига.

Гибридизация образцов для исследования FRET от A- до Z-РНК была достигнута путем смешивания каждой донорной цепи со 100% избытком ее комплементарной цепи при 22 ° C с последующим быстрым нагреванием до 75 ° C и, через 10 мин, охлаждением. до 55 ° C при 1,7 ° C h ^-1 с последующим охлаждением до 5 ° C при 60 ° C h ^-1 .Концентрация донорной нити во время отжига составляла 20 мкМ (была выбрана более высокая концентрация, чтобы способствовать гетеродуплексному отжигу по сравнению с самоотжигом в шпильки).

Все образцы, использованные для измерения РНК A-формы, были впоследствии разбавлены до 2 мкМ фосфатным буфером, тогда как образцы Z-формы были разбавлены фосфатным буфером и достаточным количеством NaClO ₄ · H ₂ O (Sigma-Aldrich) для получения результата. в желаемой концентрации NaClO ₄ (8 M, если не указано иное), принимая во внимание результирующее изменение плотности раствора (18), а также корректируя разницу в концентрации образца (определяемую поглощением при 260 нм) .

Все образцы измеряли сразу после отжига или хранили при -20 ° C между измерениями.

РНК УФ-плавление и круговой дихроизм

РНК в УФ-диапазоне регистрировали на приборе Cary 4000 (Varian Technologies) с программируемым блоком температуры, состоящим из нескольких ячеек, путем нагревания от 20 ° C до 90 ° C и последующего охлаждения до 20 ° C со скоростью 0,5 ° C мин. ^-1 . Поглощение при 260 нм регистрировали каждые 0,5 ° C в течение двух циклов. Концентрация дуплекса во всех измерениях составляла 2 мкМ.Температуры плавления рассчитывались как максимум первой производной кривых плавления в УФ-диапазоне после сглаживания с помощью FFT-фильтрации.

Спектры кругового дихроизма (КД) регистрировали на спектрометре КД Chirascan (Applied Photophysics), сканирование которого составляло от 200 до 600 нм, с использованием времени интегрирования 0,5 с и трех повторов. Концентрация дуплекса составляла 2 мкМ, и все спектры корректировались на фоновый вклад.

Измерения флуоресценции

Спектры стационарного излучения регистрировали на SPEX Fluorolog 3 (Jobin Yvon Horiba) с длиной волны возбуждения 377 нм.Концентрация дуплекса во всех образцах составляла 2 мкМ в стационарном режиме и при измерении срока службы. Эмиссия регистрировалась между 385 и 745 нм при скорости сканирования 600 нм мин ^-1 .

Квантовые выходы были измерены для дуплексов только с tC ^O (т.е. без tC _nitro ) с длиной волны возбуждения 356 нм с использованием сульфата хинина (Φ _f = 54,6%) в 0,5 MH ₂ SO ₄ в качестве справки. Эмиссия регистрировалась в диапазоне от 360 до 690 нм при скорости сканирования 600 нм мин ^-1 .

$$ \ begin {уравнение *} \ langle \ tau \ rangle = \ frac {{\ mathop \ sum \ nolimits_i {\ alpha _i} {\ tau _i}} } {{\ mathop \ sum \ nolimits_i {\ alpha _i}}} \ end {формула *} $$

$$ \ begin {уравнение *} E = 1 — \ frac {{{I _ {{\ rm DA }}}}} {{{I _ {\ rm D}}}} \ end {уравнение *} $$

$$ \ begin {уравнение *} E = 1 — \ frac {{{\ tau _ {{\ rm DA}}}}} {{{\ tau _ {\ rm D}}}} \ end {формула *} $$

Рисунок 2.

( A ) Общие трехмерные структуры A- и Z-формы РНК. ( B ) Иллюстрация шести основных ступенчатых параметров, используемых при построении структур нуклеиновых кислот. Рисунок адаптирован из Lu et al. (20).

Рисунок 2.

( A ) Общие трехмерные структуры A- и Z-формы РНК. ( B ) Иллюстрация шести основных ступенчатых параметров, используемых при построении структур нуклеиновых кислот.Рисунок адаптирован из Lu et al. (20).

А-форма

Z-образная форма

Чтобы обеспечить возможность сравнения между тремя ранее описанными Z-образными структурами (1T4X, 2GBX и 1QBJ), которые являются 6-мерными, и нашей структурой, которая представляет собой 14-мерную структуру, мы использовали метод, в котором мы расширили 6меров ранее описанной PDB- файлы на 14меров с использованием усредненных параметров базового шага. PDB-файлы сначала были проанализированы с помощью Web 3DNA для получения параметров базового шага для каждой структуры (24). Каждый параметр был усреднен для создания усредненных параметров базового шага GC и CG для конкретной структуры.Используя эти параметры, для каждой структуры был создан новый файл базовых шагов, содержащий 14 вместо исходных 6 базовых пар. Наконец, с использованием этих файлов базовых шагов, стандартной геометрии пар оснований Уотсона-Крика, квантового выхода tC ^O в Z-РНК (Φ _f = 21,3%) и спектрального перекрытия между эмиссией tC ^O и абсорбция tC _нитро в Z-РНК ( J _DA = 1,4 × 10 ¹⁴ нм ⁴ M ^-1 см ^-1 ), теоретическая эффективность FRET при различных разделениях для каждой структуры рассчитывались с помощью FRETmatrix (19).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Синтез tC

Недавно мы сообщили о синтезе и включении в РНК tC ^O -рибонуклеозида и пришли к выводу, что рибо-tC ^O сохраняет дуплекс A-формы, поддерживает высокий квантовый выход независимо от контекста последовательности и, следовательно, является отличным FRET. кандидат в доноры для межосновного FRET в РНК (9). В этом исследовании мы сообщаем о синтезе неэмиссионного акцептора FRET tC _нитро -рибонуклеозида и его фосфорамидитного субстрата 5 (схема 1).2′-O-TBS-защищенный рибонуклеозид tC _nitro ( 4 , схема 1) был синтезирован в масштабе нескольких граммов по пятиэтапному протоколу. Силильная защитная группа соединения 1 , включая защиту 2′-OH TBS, необходимую для конечного строительного блока, была введена на первом этапе на основе ранее опубликованной методологии (25). Затем соединение 1 было подвергнуто кросс-сочетанию CS-катализатора с тиолом 2 , что позволило избирательно формировать связь CS при сохранении защитных групп и стереохимии нуклеозидного фрагмента с получением соединения 3 в Доходность 81%.Трициклическая ароматическая система tC _nitro была сконструирована с конденсацией с замыканием цикла, для которой PyBOP оказался уникально активным. В мягких условиях продукт внутримолекулярной конденсации был получен с высокой селективностью по межмолекулярной реакции. Затем с полученного полностью защищенного нитро- рибонуклеозида tC _{снимали защиту с получением соединения 4 . Две стандартные стадии защиты (26,27) дали желаемый строительный блок tC нитро -фосфорамидита 5 для включения олигорибонуклеотида.}

Схема 1.

Синтез tC _нитро фосфорамидита 5 . Реагенты и условия: ( A ) t -Bu ₂ Si (OTf) ₂ , DMF, 0 ° C, 1 час; затем имидазол, 0 ° C, 30 мин; затем TBS-Cl, RT, 12 ч. ( B ) NH ₂ NH ₂ (водн.), EtOH, КТ, 18 ч. ( C ) CuI, Cs ₂ CO ₃ , ДМСО, 60 ° C, 24 ч. ( D ) PyBOP, DBU, MeCN, 0 ° C, 1 ч; затем КТ, 4 ч.( E ) Py · (HF) _x , CH ₂ Cl ₂ , 0 ° C -> RT, 6 ч. ( F ) DMTr-Cl, Py, 0 ° C, 30 мин; затем КТ, 4 ч. ( G ) CEP-Cl, DIPEA, THF, RT, 20 ч.

Схема 1.

Синтез tC _нитро фосфорамидита 5 . Реагенты и условия: ( A ) t -Bu ₂ Si (OTf) ₂ , DMF, 0 ° C, 1 час; затем имидазол, 0 ° C, 30 мин; затем TBS-Cl, RT, 12 ч. ( B ) NH ₂ NH ₂ (водн.), EtOH, КТ, 18 ч. ( C ) CuI, Cs ₂ CO ₃ , ДМСО, 60 ° C, 24 ч. ( D ) PyBOP, DBU, MeCN, 0 ° C, 1 ч; затем КТ, 4 ч. ( E ) Py · (HF) _x , CH ₂ Cl ₂ , 0 ° C -> RT, 6 ч. ( F ) DMTr-Cl, Py, 0 ° C, 30 мин; затем КТ, 4 ч. ( G ) CEP-Cl, DIPEA, THF, RT, 20 ч.

Тест FRET А-формы РНК

Для изучения FRET в РНК с использованием tC ^O и tC _nitro , мы синтезировали три донорные последовательности, содержащие tC ^O , и четыре комплементарные акцепторные последовательности, содержащие tC _nitro (рис. 3A), а также их немодифицированные аналоги, названные D0 и A0 соответственно.Эти нити позволяют формировать дуплексы с 2–13 п.н., разделяющими донор и акцептор. Спектры КД дуплексов, модифицированных tC _нитро , очень похожи на спектры соответствующего немодифицированного дуплекса, что указывает на то, что tC _nitro не нарушает A-форму (дополнительный рисунок S1). Кроме того, свойства УФ-плавления дуплексов tC _{, модифицированных нитро} , показывают, что tC _nitro , как и tC ^O , оказывает немного стабилизирующее действие на А-форму РНК, причем степень стабилизации зависит от ближайших соседей (1 .4–1,7 ° C для 5′-C tC _нитро U-3 ‘; 3,9–4,2 ° C для 5’-U tC _нитро C-3 ‘; Дополнительная таблица S1) (9).

Рисунок 3. Последовательности

( A ) РНК, используемые для исследования характеристик межосновного FRET в А-форме РНК. ( B ) Последовательности РНК, используемые для исследования перехода от A- к Z-форме РНК. Обозначения последовательностей DX и AY отражают положения донора, tC ^O (синий), и неэмиссионного акцептора, tC _nitro (оранжевый), в последовательности, считая от ( A ) 5′- конец или ( B ) 5′-конец GC-повтора донорсодержащей последовательности.Каждая комбинация последовательностей содержала только один донор и максимум один акцептор. Абазовые сайты обозначены нижним подчеркиванием. Полный список всех дуплексов, используемых в этом исследовании, см. В дополнительных таблицах S1 и S7.

Рисунок 3. Последовательности

( A ) РНК, используемые для исследования характеристик межосновного FRET в А-форме РНК. ( B ) Последовательности РНК, используемые для исследования перехода от A- к Z-форме РНК. Обозначения последовательностей DX и AY отражают положения донора, tC ^O (синий), и неэмиссионного акцептора, tC _nitro (оранжевый), в последовательности, считая от ( A ) 5′- конец или ( B ) 5′-конец GC-повтора донорсодержащей последовательности.Каждая комбинация последовательностей содержала только один донор и максимум один акцептор. Абазовые сайты обозначены нижним подчеркиванием. Полный список всех дуплексов, используемых в этом исследовании, см. В дополнительных таблицах S1 и S7.

Флуоресцентные свойства tC ^O и tC _nitro в A-форме РНК приведены в таблице 1. Важно отметить, что tC ^O сохраняет высокий и стабильный квантовый выход флуоресценции независимо от контекста последовательности (9), а также представляет собой отличное перекрытие между длинноволновой полосой излучения tC ^O и полосой поглощения tC _nitro (рис. 4).Предполагая свободное вращение дипольных моментов перехода (κ ² = 2/3), теоретическое расстояние Ферстера для tC ^O –tC _нитро FRET-пары в РНК составляет 28 Å, что соответствует почти одному полному обороту спираль А-формы РНК.

Абсорбционные и флуоресцентные свойства tC ^O и tC _nitro внутри двухцепочечной А-формы РНК

Рис. 4.

Спектральное перекрытие между испусканием tC ^O и поглощением tC _нитро в А-форме РНК. Спектры нормированы на их длинноволновые максимумы. Измерения проводили при комнатной температуре в фосфатном буфере, pH 7,4, 123 мМ Na ⁺ .

Рис. 4.

Спектральное перекрытие между испусканием tC ^O и поглощением tC _нитро в А-форме РНК. Спектры нормированы на их длинноволновые максимумы. Измерения проводили при комнатной температуре в фосфатном буфере, pH 7,4, 123 мМ Na ⁺ .

Для исследования применимости межосновного FRET с использованием tC ^O и tC _nitro в системах РНК, измеренная эффективность FRET сравнивалась с теоретическим значением для РНК A-формы, которое было рассчитано на основе установленной структуры РНК и свойств зонда.Для сравнения также были рассчитаны теоретические значения, основанные на B-форме РНК. В этом исследовании эффективность FRET как функция расстояния донор-акцептор была измерена с использованием измерений стационарного излучения и времени жизни флуоресценции tC ^O в дуплексах с tC _нитро и без него (дополнительные таблицы S2 и S3; дополнительный рисунок S2). На рисунке 5 показана средняя эффективность переноса этих двух методов вместе с теоретической эффективностью FRET для tC ^O –tC _nitro внутри статической A-формы и B-формы нуклеиновой кислоты.Пунктирные кривые, показывающие эффективность переноса также при неестественном нецелочисленном разделении, добавлены к рисунку для направления взгляда. Локальные минимумы этих кривых происходят от разделений, где диполи перехода донора и акцептора должны быть перпендикулярны друг другу и, следовательно, составляют геометрию, в которой передача энергии не может происходить в этом статическом теоретическом представлении структуры нуклеиновой кислоты.

Рисунок 5. Эффективность

FRET между tC ^O и tC _nitro в A-форме РНК как функция разделения пар оснований.Голубые ромбики отмечают усредненные данные измерений в установившемся режиме и в течение всего срока службы. Черными ромбами отмечена прогнозируемая эффективность FRET для tC ^O –tC _nitro внутри А-формы РНК, а пунктирная кривая показывает прогнозируемую эффективность FRET при нецелочисленных разделениях. Серые ромбы обозначают прогнозируемую эффективность FRET для tC ^O –tC _нитро внутри нуклеиновой кислоты B-формы, а пунктирная кривая показывает прогнозируемую эффективность FRET при нецелочисленных разделениях. Измерения проводили при комнатной температуре в фосфатном буфере, pH 7.4, 123 мМ Na ⁺ .

Рис. 5.

Эффективность FRET между tC ^O и tC _nitro в А-форме РНК как функция разделения пар оснований. Голубые ромбики отмечают усредненные данные измерений в установившемся режиме и в течение всего срока службы. Черными ромбами отмечена прогнозируемая эффективность FRET для tC ^O –tC _nitro внутри А-формы РНК, а пунктирная кривая показывает прогнозируемую эффективность FRET при нецелочисленных разделениях. Серые ромбы обозначают прогнозируемую эффективность FRET для tC ^O –tC _нитро внутри нуклеиновой кислоты B-формы, а пунктирная кривая показывает прогнозируемую эффективность FRET при нецелочисленных разделениях.Измерения проводили при комнатной температуре в фосфатном буфере, pH 7,4, 123 мМ Na ⁺ .

Измеренные данные точно соответствуют предсказанному паттерну FRET А-формы, показывая, что аналоги оснований прочно укладываются внутри РНК, и убедительно предполагая, что они не вызывают значительного возмущения структуры РНК. Следовательно, это эталонное исследование показывает, что пара tC ^O – tC _nitro FRET отлично подходит для измерения межосновного FRET в РНК, особенно при разделении 4–12 п.н. Ранее мы показали, как связывание нетропсина с ДНК и переход от B к Z в ДНК можно изучать с помощью межосновного FRET (7,8).Поскольку фотофизические свойства tC ^O и tC _nitro хорошо известны (см. Таблицу 1 выше), аналогичные исследования внутри РНК теперь должны быть возможны, что делает межосновный FRET с использованием tC ^O –tC _nitro мощным дополнением к существующие методы изучения структуры РНК, конформационных изменений и динамики.

Форма от A до Z FRET

Чтобы проиллюстрировать возможности этого метода, мы разработали исследование, в котором tC ^O –tC _нитро межбазовый FRET применяли для исследования конформационных изменений в РНК, в данном случае перехода от A- к Z-РНК.Структура правой B-формы ДНК и A-формы РНК хорошо охарактеризована. Однако и ДНК, и РНК также могут принимать левую структуру, называемую Z-формой. Z-форма ДНК была впервые кристаллизована и охарактеризована с помощью рентгеновской кристаллографии в 1979 г. (28), тогда как первая левосторонняя структура РНК была описана в 1984 г. (29). Как и в случае с Z-формой ДНК, переход от A- к Z-форме РНК происходит предпочтительно в чередующихся GC-повторах, но для индукции трансформации необходимы более экстремальные солевые условия.Биологическая роль Z-формы РНК до сих пор неясна, но окрашивание антителами к Z-РНК указывает на ее присутствие в цитоплазме и ядрышке (30), а некоторые белки интерферонового ответа имеют домены, которые могут стабилизировать Z-форму РНК (31). Однако не хватает инструментов, которые могли бы отслеживать структурные изменения Z-РНК в системах живых клеток, а структурные исследования Z-РНК немногочисленны; только две 6-мерные структуры были представлены в базе данных PDB: исследование ЯМР, в котором Z-форма индуцируется высокой концентрацией соли (6 M NaClO ₄ , PDB ID: 1T4X), и кристаллографическое исследование Z-формы РНК вместе с фермент ADAR1 (PDB ID: 2GXB) (31,32).

Чтобы сравнить структуры, депонированные в PDB, и структуры, использованные в этом исследовании, мы применили теорию FRET для прогнозирования паттернов FRET, ожидаемых от tC ^O –tC _нитро при вставке в разные положения в два олигорибонуклеотида, каждый с структура, соответствующая одной из упомянутых выше записей PDB (рисунок 6A). Поскольку некоторые исследования указывают на сильное сходство между Z-формой ДНК и РНК, теоретический паттерн FRET, полученный с использованием структуры Z-формы ДНК, связанной с ADAR1 (PDB ID: 1QBJ), был включен в качестве дополнительного сравнения (31,33).Как видно на рисунке 6A, теоретический паттерн FRET для трех указанных структур демонстрирует общее сходство, но также и значительные различия из-за структурных различий между ними. Поскольку Z-форма в основном встречается в GC-повторах, наши аналоги цитозина предоставляют прекрасную возможность изучить конформационные изменения от A- к Z-форме РНК. Наша цель в этом исследовании РНК из A- в Z-форму была двоякой: во-первых, установить, можно ли использовать FRET между основаниями для исследования перехода РНК из A- в Z.Это конформационное изменение обычно контролируется с помощью CD, для чего требуются приборы, которые реже используются в научно-исследовательских лабораториях, значительно большее количество образцов, чем при измерениях флуоресценции, и несовместимо с измерениями в целлюлозе . Во-вторых, чтобы получить новую структурную информацию о Z-РНК и поместить ее в контекст ранее определенных структур Z-РНК.

Рисунок 6.

( A ) Измеренная эффективность FRET между tC ^O и tC _nitro для GC-повтора в Z-форме (зеленые кружки), вместе с прогнозируемыми значениями FRET ранее описанных структур Z-формы. : Записи PDB 1T4X (синие треугольники, структура ЯМР Z-формы РНК в 6 M NaClO ₄ ), 2GXB (оранжевые ромбы, кристаллическая структура Z-формы РНК, связанная с ADAR1) и 1QBJ (красные квадраты, кристаллическая структура Z -форма ДНК, связанная с ADAR1) (31–33).( B ) Измерена эффективность FRET между tC ^O и tC _nitro для GC-повтора в A-форме (черные квадраты) и Z-форме (зеленые кружки). Стрелки указывают направление изменения при переключении с A- на Z-форму. Измерения проводили при комнатной температуре в фосфатном буфере, pH 7,4, 123 мМ Na ⁺ (A-форма) или с добавлением 8 M NaClO ₄ (Z-форма) и представляют собой усредненные данные из измерений в установившемся состоянии и в течение срока службы.

Рисунок 6.

( A ) Измеренная эффективность FRET между tC ^O и tC _nitro для GC-повтора в Z-форме (зеленые кружки) вместе с прогнозируемыми значениями FRET ранее сообщенной Z-формы структуры: записи PDB 1T4X (синие треугольники, структура ЯМР Z-формы РНК в 6 M NaClO ₄ ), 2GXB (оранжевые ромбы, кристаллическая структура Z-формы РНК, связанная с ADAR1) и 1QBJ (красные квадраты, кристаллическая структура Z-форма ДНК, связанная с ADAR1) (31–33).( B ) Измерена эффективность FRET между tC ^O и tC _nitro для GC-повтора в A-форме (черные квадраты) и Z-форме (зеленые кружки). Стрелки указывают направление изменения при переключении с A- на Z-форму. Измерения проводили при комнатной температуре в фосфатном буфере, pH 7,4, 123 мМ Na ⁺ (A-форма) или с добавлением 8 M NaClO ₄ (Z-форма) и представляют собой усредненные данные из измерений в установившемся состоянии и в течение срока службы.

Последовательности с GC-повторами очень склонны к самодимеризации и образованию шпилек, и поэтому требуют другого и более тщательного дизайна последовательности по сравнению с нашим первоначальным эталонным исследованием (рис. 3A).Чтобы уменьшить помехи от образования шпильки, GC-повтор был сохранен как можно короче (14-член), но при этом позволял исследовать полный виток спирали, то есть донорно-акцепторное разделение до 10 п.н., без истирания концов. Кроме того, GC-повтор фланкирован одним базовым сайтом и восемью основаниями с каждой стороны. Восемь фланкирующих оснований были введены, чтобы удерживать концы вместе в А-форме на протяжении всего эксперимента и для повышения стабильности согласованного дуплекса в рамке считывания, тогда как базовые сайты служат гибким линкером, позволяющим формировать GC-повтор. Z-РНК, пока концы остаются в А-форме.

Для этого исследования использовали 8 M NaClO ₄ для индукции Z-формы. Исследования CD показывают, что Z-форма стабильна при комнатной температуре в течение> 18 часов в этих условиях и что донор и акцептор не препятствуют ее образованию (дополнительный рисунок S3), что является дополнительным признаком того, что модифицированные основания РНК служат хорошими аналогами их естественные аналоги цитозина. Чтобы исследовать разницу между FRET в A- и Z-форме РНК, измерения с использованием времени жизни как стационарного излучения, так и флуоресценции были выполнены для обеих конформаций (Рисунок 6B, дополнительный рисунок S4 и дополнительные таблицы S5 и S6).Поскольку донор и акцептор в последовательностях GC находятся в одной цепи для нечетных разделений и в противоположных цепях для четных разделений, FRET-паттерн GC-повтора в A-форме отличается от эталонного исследования, в котором донор и акцептор являются в противоположных прядях для всех разделений (дополнительный рисунок S5). В данных Z-формы есть расхождение между эффективностями FRET в установившемся режиме и на основе срока службы для седьмого и девятого разделения (дополнительная таблица S7). Эти два разделения были измерены с использованием последовательностей, меченных одной и той же цепью, где образование шпильки сближало донор и акцептор в пространстве (0–2 п.н.).На таких коротких расстояниях тушение донора может иметь непосредственный контакт (например, перенос электронов по Декстеру) и, следовательно, происходить в масштабе времени, который невозможно разрешить с помощью нашей настройки времени жизни флуоресценции. При таких обстоятельствах только время жизни правильно свернутой фракции образца, то есть дуплексов Z-формы РНК, будет видно в затухании флуоресценции, в то время как стационарная эмиссия будет дополнительно подавляться и, следовательно, приведет к кажущемуся более высокому FRET. ценить. Поскольку наши результаты показывают разницу между установившимся режимом FRET и FRET на протяжении всей жизни на седьмом и девятом разделении и, следовательно, указывают на частичное образование «темных частиц» (например,грамм. шпильки) в этих образцах, для этих точек данных в последующей оценке использовались только значения эффективности FRET на основе срока службы (рисунок 6).

Во-первых, мы исследовали, можно ли использовать FRET между основаниями РНК для исследования перехода РНК из A- в Z. Разница в паттерне FRET между A- и Z-формами РНК поразительна, с изменением эффективности переноса на 25% -87% для семи из восьми исследованных разделений (рис. 6B), что указывает на то, что система достаточно чувствительна для изучения изменений между РНК в A- и Z-форме путем отслеживания изменения FRET только при одном или нескольких разделениях.Квантовый выход tC ^O по существу одинаков в обеих конформациях (дополнительная таблица S8), что убедительно свидетельствует о том, что наблюдаемые изменения эффективности переноса обусловлены структурными изменениями в РНК, а не вариациями в микроокружении зонда. Взятые вместе, это показывает, что межосновная РНК FRET между tC ^O и tC _nitro , разделенными 4–10 п.н., может с высокой чувствительностью исследовать структурные изменения A- в Z-РНК, что дополнительно иллюстрирует общую адаптивность этого метода для исследование структурных изменений нуклеиновых кислот.Существенные различия в продолжительности жизни флуоресценции между соответствующими дуплексами РНК в A- и Z-форме указывают на возможные применения микроскопии для визуализации времени жизни флуоресценции (FLIM), в которой РНК конкретно в Z-форме может контролироваться с помощью микроскопии живых клеток.

Во-вторых, мы сравнили наши данные FRET с теоретически полученным паттерном FRET из нескольких существующих структур PDB. Паттерн FRET, который мы получили для Z-формы РНК, хорошо согласуется с паттернами ранее описанных структур на коротких и длинных расстояниях (рис. 6А).Однако на промежуточных расстояниях (6–8 п.н.) наблюдаемая эффективность FRET значительно ниже, чем значения, рассчитанные на основе опубликованных средних параметров 6-мерных структур PDB. Одним из объяснений этих расхождений может быть то, что структура Z-РНК отличается для ранее описанной короткой и по своей природе менее стабильной 6-членной РНК по сравнению с нашей 14-мерной системой, где концы удерживаются на месте фланкирующими основаниями РНК A-формы. Структуры 6-мерной Z-РНК, определенные с помощью методов ЯМР или рентгеновского излучения, также могут немного отличаться от структуры в растворе при более физиологически значимых концентрациях РНК.Учитывая очень мало отчетов, содержащих структурную информацию для Z-формы РНК, слишком рано давать подробные комментарии о структурной однородности этой дуплексной формы РНК. Для этого потребуется более широкий набор сравнительных исследований, посвященных таким аспектам, как длина олигорибонуклеотида и тип связывающего белка.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Мы показали, что пара tC ^O – tC _nitro FRET хорошо подходит для мониторинга межосновного FRET в дуплексах РНК.Зонды прочно расположены внутри РНК, и паттерн FRET точно соответствует предсказанным значениям для A-РНК. Мы наблюдаем большое изменение эффективности FRET, поскольку Z-РНК образуется из A-формы с использованием высокой концентрации NaClO ₄ , что показывает, что, как и в ДНК, межосновная РНК FRET может использоваться для исследования структурных изменений в физиологических условиях. с высокой чувствительностью, а также универсальностью в отношении интервала tC ^O –tC _nitro . При сравнении нашего измеренного паттерна FRET с несколькими существующими структурами PDB Z-формы РНК, мы обнаруживаем общие сходства, но также и существенные различия.Сходные по величине различия также могут быть обнаружены между структурами PDB, подразумевая, что необходимо исследовать больше структур Z-РНК, чтобы определить, имеет ли РНК Z-формы одну однородную структуру с уникальным набором параметров для извлечения. Учитывая более высокое структурное разнообразие и динамику РНК и комплексов РНК-белок по сравнению с ДНК, это представляет собой значительный шаг вперед не только для межосновного FRET как общей методологии нуклеиновых кислот, но, что важно, для быстрорастущей области структуры и динамики РНК. исследования в частности и исследования РНК в целом.В отличие от большинства методов исследования структуры и динамики, межбазовый FRET может выполняться в физиологических условиях. Следовательно, мы предполагаем, что основная полезность этого метода заключается в мониторинге структурных изменений РНК в системах живых клеток, либо отдельно, либо в гибридных подходах вместе с рентгеновскими лучами или ЯМР, для выявления ценной новой информации об основных молекулах жизни, РНК. .

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ДАННЫЕ

Дополнительные данные доступны в NAR Online.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарим Афаф Х. Эль-Сагира и профессора Тома Брауна (Оксфордский университет, Великобритания) за обучение A.F.F. и М. в очистке РНК.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Шведский фонд стратегических исследований [SSF, IS14-0041, IRC15-0065 до L.M.W., ID14-0036 до M.G.]; Шведский исследовательский совет [VR, 2017-03707 к L.M.W.]. Финансирование платы за открытый доступ: Шведский исследовательский совет [VR, 2017-03707].

Заявление о конфликте интересов .Ничего не объявлено.

ССЫЛКИ

Dethoff

E.A.

Chugh

J.

Mustoe

A.M.

Аль-Хашими

Х.М.

Функциональная сложность и регуляция через динамику РНК

Природа

2012

482

322

330

Harpur

A.G.

Wouters

F.S.

Bastiaens

P.I.H.

Визуализация FRET между спектрально подобными молекулами GFP в отдельных ячейках

Nat. Biotechnol.

2001

19

167

169

Hillger

F.

Hanni

D.

Nettels

D.

Geister

S.

Grandin

M.

Textor

M. Шулер

Б.

Исследование взаимодействий белок-шаперон с помощью флуоресцентной спектроскопии одиночных молекул

Angew. Chem. Int. Эд.

2008

47

6184

6188

Губаев

A.

Klostermeier

D.

Klostermeier

D.

Hammann

C.

Структура и складывание РНК: биофизические методы 9000

2013

Берлин

Де Грюйтер

181

214

Peulen

T.O.

Опанасюк

O.

Seidel

C.A.M.

Сочетание графических и аналитических методов с молекулярным моделированием для точного анализа измерений FRET меченых макромолекул с временным разрешением

J. Phys. Chem. В

2017

121

8211

8241

McPhee

S.A.

Huang

L.

Lilley

D.M.

Критическая пара оснований в k витках, которая придает характеристики сворачивания и коррелирует с биологической функцией

Nat. Commun.

2014

5

5127

Dumat

B.

Larsen

A.F.

Wilhelmsson

L.M.

Изучение переходов Z-ДНК и B- в Z-ДНК с использованием аналога цитозина FRET-пары

Nucleic Acids Res.

2016

44

e101

Wranne

M.S.

Füchtbauer

AF

Dumat

B.

Bood

M.

El-Sagheer

AH

Brown

T.

H.

Grøtli

M.

Wilhelmsson

LM

На пути к полной гибкости последовательности аналога основания нуклеиновой кислоты FRET

J. Am. Chem. Soc.

2017

139

9271

9280

Füchtbauer

A.F.

Preus

S.

Börjesson

K.

McPhee

S.A.

Lilley

D.M.

Wilhelmsson

L.M.

Флуоресцентный аналог цитозина РНК — внутренний зонд для подробных исследований структуры и динамики

Sci. Отчет

2017

7

2393

Shin

D.

Sinkeldam

R.W.

Tor

Y.

Эмиссионный алфавит РНК

J. Am. Chem. Soc.

2011

133

14912

14915

Ровира

А.Р.

Fin

A.

Tor

Y.

Химический мутагенез алфавита эмиссионной РНК

J. Am. Chem. Soc.

2015

137

14602

14605

Xie

Y.

Dix

A.V.

Tor

Y.

FRET позволяет в реальном времени обнаруживать связывание малых молекул РНК

J. Am. Chem. Soc.

2009

131

17605

17614

Tanpure

A.A.

Srivatsan

S.G.

Конформационно-чувствительные аналоги нуклеозидов в качестве зондов включения флуоресценции, специфичных для топологии, для G-квадруплексов ДНК и РНК

Nucleic Acids Res.

2015

43

e149

Эрнандес

A.R.

Kool

E.T.

Компоненты xRNA: Синтез и флуоресценция полного генетического набора расширенных по размеру рибонуклеозидов

Org. Lett.

2011

13

676

679

Börjesson

K.

Preus

S.

El-Sagheer

A.H.

Brown

T.

Albinsson

B.

Wilhelmsson

L.M.

Аналог основания нуклеиновой кислоты FRET-Pair, облегчающий подробные структурные измерения в системах, содержащих нуклеиновые кислоты

J. Am. Chem. Soc.

2009

131

4288

4293

Bood

M.

Füchtbauer

A.F.

Wranne

M.S.

Ro

J.J.

Sarangamath

S.

El-Sagheer

A.H.

Rupért

D.L.M.

Фишер

Р.С.

Magennis

S.W.

Джонс

A.C.

Пентациклический аденин: универсальный и исключительно яркий флуоресцентный аналог основания ДНК

Chem. Sci.

2018

9

3494

3502

Хан

J.H.

Yamamoto

S.

Park

S.

Sugiyama

H.

Разработка системы Vivid FRET на основе высокоэмиссионной аналоговой пары dG-dC

Chem. Евро. J.

2017

23

7607

7613

Миллер

М.Л.

Доран

M.

Концентрированные солевые растворы.II. Вязкость и плотность тиоцианата натрия, перхлората натрия и йодида натрия

J. Phys. Chem.

1956

60

186

189

Preus

S.

Kilså

K.

Miannay

FA

Albinsson

B.

Wilhelmsson

LM

Метод моделирования FR и общий анализ FR FRET в нуклеиновых кислотах

Nucleic Acids Res.

2013

41

e18

Лю

X.J.

Олсон

W.K.

3DNA: программный пакет для анализа, восстановления и визуализации трехмерных структур нуклеиновых кислот

Nucleic Acids Res.

2003

31

5108

5121

Олсон

W.K.

Бансал

М.

Берли

S.K.

Дикерсон

R.E.

Gerstein

M.

Harvey

S.C.

Heinemann

U.

Lu

X.J.

Neidle

S.

Shakked

Z.

Стандартная система координат для описания геометрии пары оснований нуклеиновых кислот

J. Mol. Биол.

2001

313

229

237

Sandin

P.

Börjesson

K.

Li

H.

Mårtensson

J.

Brown

T.

Wilhelm4

Albinsson

B.

Характеристика и использование беспрецедентно яркого и структурно не возмущающего флуоресцентного аналога основания ДНК

Nucleic Acids Res.

2008

36

157

167

Preus

S.

Börjesson

K.

Kilså

K.

Albinsson

B.

Wilhelmsson 9 acceptor

LM

J. Phys. Chem. Б.

2010

114

1050

1056

Чжэн

Г.Х.

Лю

X.J.

Olson

W.K.

Web 3DNA — веб-сервер для анализа, реконструкции и визуализации трехмерных структур нуклеиновых кислот

Nucleic Acids Res.

2009

37

W240

W246

Серебряный

В.

Бейгельман

Л.

Эффективный препарат защищенных рибонуклеозидов для синтеза фосфорамидитной РНК

Tetrahedron Lett.

2002

43

1983

1985

Sinha

ND

Biernat

J.

McManus

J.

Köster

H.

Полимерный носитель, олигонуклеотидный синтез 909-C279 β-N-909, 909, β-N-279, 909, бета-N-909 , N -Диалкиламино- / N -Морфолинофосфорамидит дезоксинуклеозидов для синтеза фрагментов ДНК, упрощающих снятие защиты и выделение конечного продукта

Nucleic Acids Res.

1984

12

4539

4557

Xu

Y.

Ishizuka

T.

Kimura

T.

Komiyama

M.

U-Tetrad стабилизирует структуру теломерной РНК человека 9 G -9.

J. Am. Chem. Soc.

2010

132

7231

7233

Ван

А.H.J.

Quigley

G.J.

Kolpak

F.J.

Crawford

J.L.

Vanboom

J.H.

Vandermarel

G.

Rich

A.

Молекулярная структура левостороннего двухспирального фрагмента ДНК при атомном разрешении

Природа

1979

282

680

686

Холл

К.

Cruz

P.

Tinoco

I.

Jovin

T.M.

Vandesande

J.H.

Z-РНК — двойная спираль левой РНК

Природа

1984

311

584

586

Зарлинг

Д.А.

Calhoun

C.J.

Feuerstein

B.G.

Сена

E.P.

Цитоплазматическая микроинъекция иммуноглобулина Gs, распознающего спирали РНК, подавляет рост клеток человека

J. Mol. Биол.

1990

211

147

160

Placido

D.

Коричневый

B.A.

Lowenhaupt

K.

Rich

A.

Athanasiadis

A.

Левая двойная спираль РНК, связанная Z-альфа-доменом редактирующего РНК фермента ADAR1

Структура

2007

15

395

404

Popenda

M.

Milecki

J.

Adamiak

R.W.

Структура высокосолевого раствора двойной спирали левой РНК

Nucleic Acids Res.

2004

32

4044

4054

Schwartz

T.

Rould

M.A.

Lowenhaupt

K.

Herbert

A.

Rich

A.

Кристаллическая структура Z-альфа-домена редактирующего фермента человека ADAR1, связанного с левой Z-ДНК

Наука

1999

284

1841

1845

Заметки автора

© Автор (ы) 2019. Опубликовано Oxford University Press от имени Nucleic Acids Research.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.