Переключатель п38: П38УХЛ Переключатель света с регулировкой шкалы ГАЗ,ЗИЛ ОСВАР — П38-У-ХЛ П38

Лучшая цена, квалифицированный продавец, полезные обучающие видео, быстрая доставка.

Патрик Б.
Данидин, Флорида

5-12-21

Отличные запчасти, сервис и поддержка клиентов

Исаак Х.
Суррей, Британская Колумбия

5-12-21

Отличное обслуживание клиентов и выбор запчастей. Мой торговый представитель мне очень помог!

ДЖЕЙМС П.
Винтон, Вирджиния

5-10-21

Отличный сервис и фантастическая продукция

джеймс з.
Tucson, AZ

5-8-21

Отличный сервис и фантастическая продукция

джеймс з.
Tucson, AZ

5-8-21

Это моя вторая покупка у вас, ребята.Мой первый опыт обеспечил мне второй. Также спасибо за то, что получили мой заказ в тот же день.

Майкл Л.
Портленд, ИЛИ

5-6-21

Очень легко найти то, что я искал, и даже было видео, показывающее мне, как заменить деталь. На высшем уровне!

Джозеф Х.
Кармель, IN

5-4-21

Лучший источник запчастей и информации о Land Rover в США.

Ян Г.
Bellevue, WA

4-30-21

Непревзойденный выбор запчастей и скорость их доставки. Запчасти заказывались в воскресенье вечером и прибыли в среду утром. Не могу и просить большего.

Дэвид Г.
Рочестер, Нью-Йорк

4-30-21

быстрый корабль, отличный сайт и разумная цена

Марк К.
Шарлотта, NC

4-29-21

Купить по автомобилю Магазин по категориям

отзывов наших клиентов …

Предыдущий слайд ◀ ︎ Следующий слайд ▶ ︎

• БЫСТРАЯ Доставка! Назовите этих людей, у них есть все ответы на ваши вопросы по установке.

  — Билл М. (Бойдтон, Вирджиния)

  Отличное обслуживание клиентов, очень знающий персонал. Все, с кем я работал, являются владельцами Land Rover, что очень помогает в знании автомобилей.

  У вас всегда есть запчасти, которые мне нужны по отличной цене, и все, с кем я когда-либо говорил, прекрасно знают все Land Rover

  .

  — Кейт Б. (Блю Ридж, Вирджиния)

  Профессионализм.Мой торговый представитель — рок-звезда, и я ценю как его технические знания, так и его знания о вашей линейке продуктов.

  -Алан Р. (Н. Челмсфорд, Массачусетс)

• БЫСТРАЯ Доставка! Назовите этих людей, у них есть все ответы на ваши вопросы по установке.

  — Билл М. (Бойдтон, Вирджиния)

  Отличное обслуживание клиентов, очень знающий персонал.Все, с кем я работал, являются владельцами Land Rover, что очень помогает в знании автомобилей.

  У вас всегда есть запчасти, которые мне нужны по отличной цене, и все, с кем я когда-либо говорил, прекрасно знают все Land Rover

  .

  — Кейт Б. (Блю Ридж, Вирджиния)

  Профессионализм. Мой торговый представитель — рок-звезда, и я ценю как его технические знания, так и его знания о вашей линейке продуктов.

  -Алан Р. (Н. Челмсфорд, Массачусетс)

• У вас всегда есть запчасти, которые мне нужны по отличной цене, и все, с кем я когда-либо говорил, прекрасно знают все Land Rover

  .

  — Кейт Б. (Блю Ридж, Вирджиния)

• Профессионализм. Мой торговый представитель — рок-звезда, и я ценю как его технические знания, так и его знания о вашей линейке продуктов.

  -Алан Р. (Н. Челмсфорд, Массачусетс)

Системы охлаждения для автомобилей LAND ROVER RANGE ROVER CLASSIC & P38 ЛАМПОЧКА И ДЕРЖАТЕЛЬ ПЕРЕКЛЮЧАТЕЛЯ ОРАНЖЕВЫЙ НАБОР ИЗ 2

Найдите много отличных новых и подержанных опций и получите лучшие предложения на LAND ROVER RANGE ROVER CLASSIC и P38 НАБОР ИЗ 2 ЛАМПОЧЕК И ДЕРЖАТЕЛЕЙ ПЕРЕКЛЮЧАТЕЛЯ ОРАНЖЕВЫЙ ИЗ 2 по лучшим онлайн-ценам! Бесплатная доставка для многих товаров !.Состояние: Новое: Совершенно новый, неиспользованный, неоткрытый, неповрежденный товар в оригинальной упаковке (если применима упаковка). Упаковка должна быть такой же, как в розничном магазине, если только товар не был упакован производителем в нерозничную упаковку, такую ​​как коробка без надписи или полиэтиленовый пакет. См. Список продавца для получения полной информации. См. Все определения условий ： Бренд: ： Land Rover ， Гарантия: ： 90 дней ： Спецификация оригинального оборудования или характеристики / индивидуальный заказ: ： Спецификация оригинального оборудования ， Страна / регион производства: ： Великобритания ： Номер детали производителя: ： STC1877 ， Номер сменной детали: ： Выключатель лампы и держателя оранжевый STC1877, Подсветка приборной панели, Range Rover 4. 0, 4.6 (P38) Лампа и держатель, Range Rover Classic Лампа и держатель, Набор ламп и держателей из 2 ，。

LAND ROVER RANGE ROVER CLASSIC & P38 ЛАМПОЧКА И ДЕРЖАТЕЛЬ ВЫКЛЮЧАТЕЛЬ ОРАНЖЕВЫЙ НАБОР ИЗ 2

LAND ROVER RANGE ROVER CLASSIC & P38 НАБОР ЛАМПЫ И ДЕРЖАТЕЛЯ ОРАНЖЕВЫЙ ИЗ 2

Очарование из 100% американского олова. Обувь для ходьбы. Мужские кроссовки без шнуровки. Уличная спортивная мода. Легкая обувь: Одежда. Помимо того, что они невероятно плотно прилегают к своему плюшевому флисовому материалу, они созданы, чтобы плотно прилегать к ее ступням и удерживать их ровно для правильного контроля мышц, они созданы вручную канадской компанией / Eugene Cloutier Inc.КУПИТЬ С УВЕРЕННОСТЬЮ: мы снабдили наш серебряный кулон для женщин и девочек 100% гарантией возврата денег от Glitzs Jewels. Это один из самых особенных подарков для женихов. Купите Victoria’s Secret Pink NEW Oversize Lace Up Varsity Crew Color Blue (Средний): Магазин одежды ведущих модных брендов, ACORN Engineering 2555-021-299 Acorn Valve Body Female by Female. LAND ROVER RANGE ROVER CLASSIC & P38 НАБОР ЛАМПОЧКИ И ДЕРЖАТЕЛЯ ОРАНЖЕВЫЙ НАБОР ИЗ 2 , Фактический цвет элемента может незначительно отличаться от отображаемого изображения из-за различных настроек монитора или отраженного света во время съемки.Продукт MB7926-2 Michael Berman Кухонный смеситель с боковой струей и металлической ручкой-рычагом, с симпатичным внешним видом и продуманным дизайном, доступен в различных цветах текста:, Профиль молнии делится на 50 см темно-синий. Бесшовно сформированный из 100% стали (. Вертикальный 3D стикер на стену окна — Восходящее солнце под окном планеты Земля. Это уникальное колье состоит из цепочки из стерлингового серебра и мужской футболки среднего размера для музыкального концерта 80-х годов Vintage Van Halen band. LAND ROVER RANGE ROVER CLASSIC & P38 НАБОР ЛАМПОЧКИ И ДЕРЖАТЕЛЯ ОРАНЖЕВЫЙ НАБОР ИЗ 2 , Зимняя шапка из оливково-зеленого мериноса и натуральной шетландской шерсти, В нижней части боковых сторон и в верхней левой части дерева есть трещины, соответствующие возрасту из которых добавляет красоты этому удивительному куску, он содержит только несколько очень мелких песчинок. Есть 12 зажимов и 14 пряжек (еще одна пряжка добавлена ​​посередине), которые делают стирку и подвешивание намного более эффективными. 【Простое использование】 Как пользоваться картой. Загляните в наш огромный каталог — у нас есть все, что вам нужно, 4 бутылки и бутылка из стекла. но стоимость доставки дороже. Отличная производительность в экстремальных зимних условиях, LAND ROVER RANGE ROVER CLASSIC & P38 НАБОР ОРАНЖЕВЫХ ЛАМПОЧЕК И ДЕРЖАТЕЛЯ ИЗ 2 , 1 пара японских палочек для еды. BEIGAIXLSBZ Юбка для ванны Обертывание для тела Мода Леди Девушки Носимое Быстросохнущее Волшебный лук Вышивка Прикрытие для ванны Пляжные полотенца: Электроника.

LAND ROVER RANGE ROVER CLASSIC & P38 ЛАМПОЧКА И ДЕРЖАТЕЛЬ ПЕРЕКЛЮЧАТЕЛЯ ОРАНЖЕВЫЙ НАБОР ИЗ 2

границ | Перекрестные помехи и переключатели сигналов в митоген-активированных протеинкиназных каскадах

1. Введение

Отличительным признаком рака является нарушение регуляции решений судьбы стержневых клеток, ведущее к аберрантной пролиферации и снижению апоптоза (Hanahan and Weinberg, 2011). Решения о судьбе здоровых клеток зависят от правильного восприятия клеточной внутри- и внеклеточной среды в процессе, называемом сигнальной трансдукцией (Kholodenko et al., 2010). Сигналы воспринимаются рецепторами, которые связывают свои родственные внеклеточные лиганды, что приводит к конформационным изменениям, которые запускают образование мультибелковых комплексов и последующую активацию GTPases и киназ (Lemmon and Schlessinger, 2010).Таким образом, один рецептор обычно активирует несколько нисходящих путей. Основными преобразователями являются каскады MAPK, которые состоят из линейного массива из трех киназ, где GTPase активирует киназу киназы MAPK (MAPKKK; MAP3K), которая фосфорилирует и активирует киназу MAPK (MAPKK; MAP2K), которая, в свою очередь, активирует MAPK, доставляющий основной путь продуцирования — фосфорилирование множества субстратов (Kolch, 2005; Dhillon et al., 2007). MAPKs и MAP2Ks активируются посредством двойного фосфорилирования, которое может придавать переключатели сходные свойства кинетике активации (Kholodenko, 2000).Иногда MAP4K вставляется между GTPase и MAP3K. Конкретная судьба клетки не может быть отнесена к активности отдельного белка в отдельности, а скорее зависит от контекста, включая временные паттерны активации и структуры регуляторной обратной связи в сигнальной сети (Холоденко, 2006; Холоденко и др., 2010). ; Накакуки и др., 2010). Из-за этой сложности функция клеточной передачи сигналов часто ускользает от наивного интуитивного понимания, что требует использования математического моделирования и анализа (Kitano, 2002, 2010; Ireton et al. , 2009). В то время как другие подходят к проблеме с менее механистической точки зрения, используя регрессию (Miller-Jensen et al., 2007) или булевы и полулогические модели (Saez-Rodriguez et al., 2009, 2011), мы сосредотачиваемся на динамических моделях с использованием обыкновенного дифференциала. уравнения.

Динамическое моделирование играет ключевую роль в понимании того, как передача сигналов через каскад ERK регулирует судьбу клеток (Kholodenko et al., 2010; Sturm et al., 2010). Классическим примером является передача сигналов фактора роста в клетках феохромоцитомы крысы (PC12), где обработка эпидермальным фактором роста (EGF) или фактором роста нервов (NGF) активирует один и тот же сигнальный каскад (каскад RAF / MEK / ERK), но оказывает различное влияние на судьба клетки.EGF вызывает временную активацию ERK и пролиферацию из-за отрицательной обратной связи, тогда как NGF вызывает устойчивую активацию и дифференцировку ERK благодаря положительной обратной связи (Santos et al. , 2007; von Kriegsheim et al., 2009). Сходным образом, активированные стрессом MAPKs JNK и p38 опосредуют различные клеточные ответы. Например, индуцированная фактором роста временная активация JNK способствует выживанию и пролиферации клеток, тогда как индуцированная стрессом пролонгированная активность JNK способствует остановке роста и гибели клеток (Ventura et al., 2006). Однако механистические детали того, как генерируется этот переключатель, и факторы, определяющие переход от пролиферативной к апоптотической передаче сигналов JNK, плохо изучены, а математическое моделирование и анализ в значительной степени отсутствуют для стресс-активируемых киназ (Bagowski and Ferrell, 2001; Wagner and Nebreda, 2009 г.).

Здесь мы предоставляем динамическую модель обратной связи и перекрестных помех для трех основных MAPK (ERK, p38, JNK) и передачи сигналов протеинкиназы B (AKT). Модель включает в себя механистические детали положительной обратной связи от JNK к его собственным MAP3K и отрицательных перекрестных помех от и к другим путям. Используя математический анализ, модель используется для расшифровки того, как JNK переключается с пролиферативной на апоптотическую передачу сигналов и как это переключение регулируется перекрестными помехами пути.

2. Результаты

Мы представляем динамическую модель множественных каскадных взаимодействий MAPK с петлей положительной обратной связи JNK, которая генерирует пролиферативно-апоптотический переключатель. Кроме того, мы представляем подробный анализ факторов, контролирующих динамические свойства переключателя JNK, с особым акцентом на петли обратной связи и перекрестные помехи.

2.1. Номинальная модель взаимодействия MAPK

Хотя сигнальные каскады MAPK были тщательно изучены, возможность подключения систем MAPK до конца не изучена. MAPK имеют несколько изоформ, большое количество входов в виде различных GTPаз и протеинкиназ, несколько каркасных белков, которые направляют входящие сигналы в разные пути, и множество фосфатаз, которые модулируют динамику активации MAPK. Таким образом, в зависимости от состояния экспрессии и активности этих белков, MAPK-связи меняются между типами клеток и в ответ на патологические аберрации.Для анализа кинетического поведения и регуляции каскадов MAPK мы построили модель, которая представляет основную сеть взаимодействий MAPK на основе доступной литературы. Топология этой модели изображена на рисунке 1.

Рисунок 1. Схема штатной модели взаимодействия МАПК . Для простоты иллюстрации двойное фосфорилирование киназ MAP (K) изображено в одну стадию, а три неактивные формы ASK / MLK и MKK4 / 7 объединены в один компонент. U _i обозначают входы, которые моделируются как функции, зависящие от времени (не моделируются дифференциальными уравнениями). Черный: номинальные каскады; Синий: положительный отзыв JNK на собственные MAP3K; Красный: отрицательная перекрестная помеха от передачи сигналов AKT к JNK; Пурпурный: отрицательный перекрестный переход от p38 к передаче сигналов ERK, возникающий только в нетрансформированных клетках. Строчные и прописные буквы обозначают мРНК и белки соответственно. Одинарная и двойная звездочка обозначают одно- и дважды фосфорилированные активные формы соответственно.

Как правило, системы MAPK организованы в трехуровневый каскад, состоящий из MAPK (нижний уровень), MAPK-киназ (MAP2Ks, второй уровень) и MAPK-киназ-киназ (MAP3Ks, верхний уровень). Активация киназ на каждом уровне моделируется с помощью двойных циклов фосфорилирования, как описано в «Материалы и методы» (раздел 5), в которых расположенная выше киназа действует как фермент, катализирующий фосфорилирование и, следовательно, активацию нижестоящей киназы. Дополняя классические каскады, модель имеет несколько перекрестных помех и обратных связей (таблица 1).Во-первых, JNK фосфорилирует и активирует свой собственный MAP3K (Schachter et al., 2006; Furuhata et al., 2009), создавая петлю положительной обратной связи. Во-вторых, p38 ингибирует активность ERK, усиливая дефосфорилирование MEK либо за счет активации транскрипции, либо за счет фосфорилирования протеинфосфатазы 2 (PP2A; Westermarck et al., 2001; Li et al., 2003; Liu and Hofmann, 2004; Grethe and Pörn-Ares, 2006). ; Junttila et al., 2008). В-третьих, ERK ингибирует JNK посредством индукции фосфатаз двойной специфичности (DUSP), катализирующих дефосфорилирование JNK (Paumelle et al., 2000; Моник и др., 2006). Наконец, AKT ингибирует активность JNK путем фосфорилирования ингибирующих сайтов в JNK-MAP3Ks и -MAP2Ks (Kim et al., 2001; Park et al., 2002; Barthwal et al., 2003).

Таблица 1 . Перекрестные помехи и обратные связи в номинальной модели взаимодействия MAPK .

В следующем разделе мы рассмотрим экспериментальные данные для каждого механизма перекрестных помех и покажем, как они реализованы в динамической модели.Наконец, мы исследуем сложное кинетическое поведение и динамику трех каскадов MAPK.

2.1.1. Положительный отзыв JNK

Несколько исследований подтверждают идею петли положительной обратной связи JNK на системном уровне. Например, положительная обратная связь JNK имеет решающее значение для правильного стрессового ответа ооцитов Xenopus (Bagowski and Ferrell, 2001). В клетках млекопитающих JNK проявляет ответы типа «все или ничего» на уровне отдельных клеток после обработки анизомицином или сорбитолом (Bagowski et al., 2003), и была предложена петля положительной обратной связи (Bagowski et al., 2003; Xiong and Ferrell, 2003). На уровне популяции эти ответы типа « все или ничего » проявляют очень сверхчувствительное поведение с очевидными коэффициентами Хилла до 9 или 10 (таблица 2), что согласуется с наличием петли положительной обратной связи, которая увеличивает степень сверхчувствительности ( Баговский и др., 2003).

Таблица 2 . Сверхчувствительность ответа JNK на стресс в популяциях клеток млекопитающих (Bagowski et al., 2003) .

Литература содержит значительное количество доказательств, подтверждающих существование положительной обратной связи от JNK к его собственным MAP3K, в частности к киназам смешанного происхождения (MLK) и киназам, регулируемым апоптозом (ASK; Xu and Cobb, 1997; Phelan et al., 2001; Ventura et al. al., 2004; Schachter et al., 2006; Furuhata et al., 2009). Например, в клетках HEK 293, Hela и MCF-7 JNK фосфорилировал MLK3 непосредственно по сайтам в COOH-концевой области, что приводило к перераспределению MLK3 на нерастворимые в тритоне мембранные микродомены, увеличивало фосфорилирование петли активации и увеличивало MLK3. активность (Schachter et al., 2006). Сходным образом в клетках COS-7 JNK фосфорилирует C-концевой домен MLK2, который необходим для MLK2-индуцированного апоптоза (Phelan et al., 2001). Кроме того, JNK фосфорилировал фрагмент MEKK1 in vitro и коиммунопреципитировал с MEKK1 в клетках HEK 293 (Xu and Cobb, 1997). MEKK1 представляет собой MAP3K для пути JNK, который в зависимости от своего статуса фосфорилирования также может действовать как каркас для пути MEKK1-MKK4-JNK (Gallagher et al., 2002).

Другой, более непрямой путь обратной связи JNK с его собственными MAP3Ks включает производство активных форм кислорода (ROS).В фибробластах JNK продуцирует ROS после обработки TNF в процессе, который не включает транскрипцию генов и ингибируется NF-κB (Ventura et al., 2004). Интересно, что несколько сигнальных путей связывают ROS с активацией JNK, указывая тем самым на петлю положительной обратной связи JNK-ROS (Shen and Liu, 2006). ASK1, в частности, легко активируется ROS, посредством чего ROS индуцирует диссоциацию ASK от внутренних ингибиторов, таких как тиоредоксин или белки 14-3-3, что в конечном итоге приводит к олигомеризации ASK1 и фосфорилированию его петли активации (Saitoh et al., 1998; Goldman et al., 2004; Шен и Лю, 2006). Фактически, такая петля положительной обратной связи, зависящая от АФК, описана в клетках лимфомы мыши WEHI-231, где активность JNK продуцирует перекись водорода (H ₂ O ₂ ), которая, в свою очередь, активирует ASK1 (Furuhata et al. , 2009).

Молекулярные механизмы активации MAP3K довольно сложны. Например, активация MLK3 включает связывание GTPases, транслокацию к мембране, димер- или олигомеризацию и фосфорилирование петли активации MLK3 по Thr2277 и Ser281 (Schachter et al., 2006). Пренебрегая этой сложностью и в соответствии с более ранними моделями в литературе, мы моделируем активацию MAP3Ks как процесс фосфорилирования, катализируемый его входами (Kholodenko, 2000; Kholodenko et al., 2010). В модели разные JNK-MAP3K объединены в один компонент ASK / MLK. Активация этого компонента моделируется как двойной цикл фосфорилирования с двумя входами, представляющими активность вышестоящих GTPases u ₃ и активного JNK (см. Рисунок 1).Хотя наша модель упрощает вовлеченные молекулярные события, она отражает главную особенность активации MAP3K, а именно фосфорилирование двух консервативных остатков в петле активации.

2.1.2. p38 ингибирует передачу сигналов ERK в нетрансформированных клетках

Как правило, активность ERK способствует выживанию. Подавление этой активности с помощью p38 критично для индукции апоптоза в нетрансформированных клетках, и PP2A опосредует этот эффект (Junttila et al., 2008). В частности, опосредованное p38 дефосфорилирование MEK было необходимо для индуцированного арсенитом апоптоза в фибробластах кожи человека (HSF) и первичных нейронах крысы (CGN), но не в трансформированных и онкогенных клеточных линиях (HeLa, Jurkat, K562, HT-1080, WM266- 4, A2058; Li et al., 2003). Кроме того, PP2A опосредовал эту p38-MEK-негативную перекрестную помеху и был необходим как для цитокинового, так и для индуцированного стрессом апоптоза в клетках эндотелия человека и миоцитах желудочков сердца крысы, соответственно (Liu and Hofmann, 2004; Grethe and Pörn-Ares, 2006).

Неясно, как p38 регулирует PP2A. PP2A представляет собой гетеротример, состоящий из каркаса, каталитической субъединицы и различных регуляторных субъединиц. Его каталитическая активность может регулироваться на нескольких уровнях, включая сборку гетеротримеров с различными регуляторными субъединицами, а также фосфорилирование или метилирование каталитической субъединицы (Janssens and Goris, 2001; Nguyen et al., 2012). Поскольку механизм, с помощью которого p38 активирует активность PP2A, неизвестен, и поскольку динамика системы зависит от этого механизма, наша модель реализует две возможности, каждая на противоположных концах динамического спектра: медленная активация посредством транскрипции гена регуляторной субъединицы и быстрая активация. через фосфорилирование каталитической субъединицы.

2.1.3. ERK подавляет JNK

ERK сильно индуцирует несколько DUSP, некоторые из которых негативно регулируют активность JNK.Например, DUSP4 легко индуцируется в ответ на несколько факторов роста (Legewie et al., 2008; Cagnol and Rivard, 2012), а стабилизация DUSP16 посредством ERK-опосредованного фосфорилирования по Ser-446 наблюдалась как в COS-7 (фибробластный), так и в Клетки Hela (Катагири и др., 2005). Кроме того, ERK усиливает дефосфорилирование JNK за ​​счет индукции DUSP4 в эпителиальных клетках собачьей почки Madin-Darby (MDCK) (Paumelle et al., 2000), а ингибирование ERK в альвеолярных макрофагах человека (которые являются частью иммунной системы в легких) снижает уровни DUSP16. , что приводит к увеличению фосфорилирования JNK (Monick et al., 2006). Вместе эти данные показывают, что перекрестная помеха ERK-JNK, опосредованная DUSP4 / 16, сохраняется между клеточными линиями (эпителиальными, фибробластными, иммунными и раковыми клетками), на основании чего динамическая модель демонстрирует индуцированную ERK мРНК и экспрессию белка DUSP4 / 16, которые катализируют дефосфорилирование JNK.

2.1.4. AKT подавляет передачу сигналов JNK

В ответ на несколько факторов роста и инсулин AKT опосредует передачу сигналов выживания, частично за счет фосфорилирования и ингибирования апоптотических белков (Hers et al., 2011). Активный AKT фосфорилирует сайты ингибирования восходящих киназ JNK как на уровне MAP2K, так и на уровне MAP3K (см. Таблицу 1). На уровне MAP3K фосфорилирование ASK1 по Ser 83 с помощью AKT снижает активность JNK в ответ на окислительный стресс и сывороточное голодание и снижает зависимый от ASK1 апоптоз в клетках HEK 293 и L929 (Kim et al., 2001). Сходные результаты были получены в клетках HepG2, где активность AKT, индуцированная инсулином, приводила к фосфорилированию MLK3 по Ser 674 (Barthwal et al., 2003). На уровне MAP2K AKT фосфорилирует MKK4 по Ser 78 в ответ на инсулин или конститутивно активный AKT, что снижает активность JNK и индуцирует анизомицин апоптоз в клетках HEK 293T (Park et al., 2002).

В динамической модели не различаются разные MAP3K и MAP2K в пути JNK, но представлены комбинированные компоненты ASK / MLK и MKK4 / 7, как MAP3K и MAP2K соответственно. Мы моделируем оба компонента, используя доменно-ориентированный подход (Борисов и др., 2005, 2006; Кияткин и др., 2006; Конзельманн и др., 2008) и предполагая, что процессы фосфорилирования в петле активации и в ингибирующем сайте независимы, как подробно описано в Материалы и методы .

2.1.5. JNK подавляет ERK и p38

JNK может ингибировать ERK на нескольких уровнях, включая как непрямые вышестоящие механизмы, так и прямое дефосфорилирование при индукции транскрипции экспрессии DUSP (Junttila et al., 2008). Модель прямого дефосфорилирования ERK посредством индукции транскрипции DUSP подтверждается двумя исследованиями, показывающими, что перекрестные помехи JNK-ERK, по крайней мере, частично независимы от вышестоящих киназ ERK MEK и Raf. Во-первых, транскрипционная активность v-Jun снижала как базальное, так и индуцированное фактором роста фосфорилирование ERK, по крайней мере частично независимо от Raf (Black et al., 2002). Во-вторых, активность JNK, индуцированная церамидом, и TNF-α блокирует фактор роста, стимулирует фосфорилирование ERK, и это ингибирование требует транскрипционной активности c-Jun, но не затрагивает MEK (Shen et al., 2003).

Хотя точный механизм плохо изучен, а повышенная экспрессия DUSP1, DUSP4 и DUSP6 не может быть обнаружена в клетках COS-7, экспрессирующих активный MLK3, DUSP были предложены как потенциальные медиаторы перекрестного взаимодействия JNK-ERK (Shen et al., 2003; Junttila et al., 2008). JNK также может ингибировать p38, поскольку активность JNK ингибирует передачу сигналов как ERK, так и p38 в кардиомиоцитах мышей (Peng et al., 2009), а гепатоциты с дефицитом c-Jun обнаруживают повышенное фосфорилирование p38 (Stepniak et al., 2006). Перекрестная помеха JNK ⊣ ERK / p38 может включать p53-DUSP2-зависимый путь, поскольку c-Jun-опосредованное ингибирование p38, наблюдаемое в гепатоцитах, было зависимым от p53 (Stepniak et al., 2006), а DUSP2 был идентифицирован как транскрипционная мишень p53 в мышиные эмбриональные фибробласты и клеточные линии рака молочной железы (Yin et al., 2003). Кроме того, было показано, что DUSP2 дефосфорилирует ERK и p38 в клетках NIh4T3 и HeLa (Chu et al., 1996) и участвует в инактивации ERK2 во время p53-зависимого апоптоза в линиях клеток рака груди и толстой кишки (Yin et al., 2003; Дикинсон и Кейз, 2006). Основываясь на этих данных и игнорируя p53 как возможный промежуточный продукт, динамическая модель показывает JNK-индуцированную экспрессию мРНК и белка DUSP2 и дефосфорилирование ERK и p38, катализируемое DUSP2.

2.2. Динамика базовой сети

На основе структуры модели, представленной на рисунке 1, можно построить динамическую модель взаимодействий MAPK (Холоденко, 2006; Холоденко и др., 2010). Для подробного ознакомления с динамическим моделированием клеточных систем мы отсылаем к (Aldridge et al., 2006; Iglesias and Ingalls, 2009) и, в частности, в отношении передачи сигналов ERK / MAPK (Kholodenko, 2000; Kolch et al., 2005; Orton и др., 2005). Успешная стратегия моделирования сохраняет модель простой, но биологически релевантной и способной делать значимые прогнозы. С этой целью разработанная модель содержит несколько биологически разумных предположений, упрощений и обобщений, как описано в Материалы и методы (Раздел 5).В частности, модель объединяет изоформы и киназы, которые разделяют одни и те же вышестоящие активаторы и нижележащие субстраты, в один компонент, где это возможно (Рисунок 1, Таблицы 4 и 5). Важно отметить, что принятые упрощения сохраняют структуру обратной связи и перекрестных помех в сети, снижают риск чрезмерной параметризации и облегчают математический анализ модели.

2.2.1. Динамика MAPK в ответ на факторы роста или стресс

Разработанная модель отражает текущее понимание того, как системы p38 и JNK реагируют на стресс (Junttila et al., 2008), и согласуется с более ранними моделями MAPK в литературе, которые, хотя и не касаются p38 и JNK, показали передачу сигналов ERK, индуцированную фактором роста (von Kriegsheim et al., 2009; Kholodenko et al., 2010; Nakakuki et al. ., 2010). На рисунке 2 представлен обзор динамики системы, иллюстрирующий, как наша модель реагирует на факторы роста и сигналы стресса. Вообще говоря, факторы роста активируют преимущественно ERK и JNK, а также AKT, хотя и в разной степени. Динамика активации может быть постоянной или временной, в зависимости от типа и контекста стимуляции (von Kriegsheim et al., 2009; Накакуки и др., 2010). Например, клетки PC12 демонстрируют устойчивую активацию ERK в ответ на NGF, тогда как EGF вызывает временную динамику ERK из-за активации нескольких петель отрицательной обратной связи (Marshall, 1995; Douville and Downward, 1997; von Kriegsheim et al., 2009). Эти отрицательные обратные связи действуют выше каскада ERK, на уровне рецепторов факторов роста и их адаптеров, и приводят к временному входному сигналу для системы MAPK. Мы можем моделировать эти переходные эффекты, используя модульный подход, в котором входные данные моделируются с помощью функций, зависящих от времени (Nakakuki et al., 2010). Таким образом, ступенчатый вход соответствует устойчивому сигналу, тогда как импульсный вход, который возвращается к низкому базальному уровню после определенного, относительно короткого периода времени, соответствует переходному сигналу. Рисунки 2A, B показывают, что в ответ на факторы роста, динамика ERK качественно следует входному сигналу, тогда как JNK реагирует временно и только на факторы роста, которые не активируют AKT. Сигналы стресса преимущественно активируют p38 и JNK, а иногда и ERK, но в гораздо меньшей степени.На рис. 2С показано, что реакция JNK на стресс сохраняется как при переходном, так и при длительном воздействии стресса.

Рисунок 2. Динамика опорной сети в ответ на различные стимулы . (A) Форма входных сигналов. Сплошной: постоянный вход, пунктир: переходный вход. (B – D) Ответы системы на разные стимулы. (B) Фактор роста сильно стимулирует входы ERK и JNK, но лишь слабо входы AKT и p38: (C) Фактор роста сильно стимулирует входы ERK, JNK и AKT, но не вход p38. (D) Сигнал стресса сильно стимулирует входы p38 и JNK, слабо стимулирует вход ERK и не стимулирует вход AKT.

, где ûi ( i = ERK, p38, JNK) обозначает максимальное значение входных сигналов ERK, p38 и JNK [см. (A) ].

2.2.2. Динамика стресс-индуцированного апоптоза в присутствии факторов роста

Основная модель отражает текущее понимание JNK-зависимой индукции апоптоза.В Junttila et al. (2008) была предложена концептуальная модель, в которой PP2A-опосредованное подавление ERK с помощью p38 является критическим для JNK-опосредованного апоптоза. Идея состоит в том, что вызванная стрессом активация p38 подавляет нормальную активность ERK пролиферирующих и дифференцирующихся клеток и, следовательно, эта потеря активности ERK делает клетки сенсибилизированными к апоптозу, опосредованному JNK. Наша динамическая модель представляет собой математическое представление этой идеи, поддающееся теоретическому анализу. Действительно, моделирование динамической модели с пошаговым вводом сигналов напряжения

в присутствии постоянного митотического сигнала u _ERK ( t ) = 1 имитирует данные и последовательность событий, описанных в Junttila et al.(2008). Таким образом, качественное поведение в значительной степени не зависит от точного механизма активации PP2A. Для обоих механизмов, либо усиление транскрипции PP2A, либо его активация с помощью фосфорилирования, индуцированного p38, переключение JNK происходит с задержкой 3-6 часов после апоптотического стимула (Figure 3). Задержка во многом определяется силой перекрестных помех p38-PP2A. Уменьшение скорости экспрессии PP2A в модели активации транскрипции или снижение каталитической активности p38 по отношению к PP2A в модели активации PP2A, индуцированной фосфорилированием, увеличивает время активации JNK (Фиг.3, пунктирные линии).Далее мы анализируем сеть взаимодействия MAPK, генерирующую эту сложную динамику, предоставляя анализ этих взаимодействий на системном уровне.

Рис. 3. Траектории основной модели имитируют последовательность событий (Junttila et al., 2008), которые происходят в ответ на стрессовый стимул u _p38 ( t ) = u _JNK ( t ) = 1 для t > 0 и наличие постоянного митотического сигнала u _ERK ( t ) = 1 для всех t .D2 и D4 / 16 обозначают DUSP2 и DUSP4 / 16, которые опосредуют перекрестные помехи JNK ⊣ ERK, p38 и ERK ⊣ JNK, соответственно (см. Также Таблицу 1). Качественное поведение не зависит от механистических деталей, реализующих взаимодействие p38-PP2A. Показаны два механизма: (A, B) p38 индуцирует экспрессию гена PP2A, при этом красная линия в (B) представляет общий уровень белка PP2A. (C, D) p38 фосфорилирует PP2A, при этом красная линия в (D) представляет собой фосфорилированный PP2A. (A – D) Время активации JNK зависит от силы активации PP2A: сплошные линии показывают уровни PP2A, сравнимые с уровнями других фосфатаз. Пунктирные линии указывают на пониженные уровни экспрессии PP2A, что задерживает активацию JNK.

2.3. Анализ структур обратной связи

MAPK демонстрируют сложное динамическое поведение в зависимости от топологии обратной связи и кинетических параметров. Хотя параметры важны для наблюдаемых ответов, топология сети с точки зрения петель обратной связи определяет, какое качественное поведение возможно (Холоденко, 2006).Вообще говоря, отрицательная обратная связь может генерировать (устойчивые) колебания, тогда как положительная обратная связь может генерировать бистабильность. Считается, что бистабильность важна для принятия решений о судьбе клеток, поскольку она характеризуется гистерезисом и может генерировать необратимые переключения (Novak and Tyson, 1993; Xiong and Ferrell, 2003). Примером может служить система каспаз, где положительная обратная связь порождает необратимое переключение между двумя стабильными устойчивыми состояниями; состояние выключения, соответствующее выживанию, и состояние включения, соответствующее апоптозу (Eissing et al., 2004). Поскольку в модели используется петля положительной обратной связи JNK, мы стремились определить, при каких условиях система проявляет бистабильность.

2.3.1. Положительный отзыв и бистабильность модуля JNK

Удобным инструментом для анализа бистабильности является метод разрыва петли (Angeli et al., 2004). Разрыв петли — это инструмент графического анализа, состоящий из двух шагов. Во-первых, разорвите контур обратной связи и постройте зависимость вход / выход (I / O) в установившемся состоянии для разомкнутой системы.Полученная кривая называется характеристикой установившегося режима разомкнутого контура. Во-вторых, замкните цикл графически, построив прямую линию через начало координат, при этом наклон линии представляет обратную силу обратной связи. Например, унитарная обратная связь u = y представлена ​​прямой наклонной линией. Точки пересечения двух линий представляют установившиеся состояния замкнутой системы. Чтобы оценить стабильность стационарных состояний (аналогично нулевым наклонам в классическом анализе фазовой плоскости), должны быть выполнены два технических условия; наличие четко определенной характеристики ввода-вывода и монотонности, которые могут быть выполнены для упрощенных каскадов MAPK (без отрицательной обратной связи).За подробностями обращайтесь к оригинальной литературе (Angeli et al., 2004).

Рассматривая модуль JNK номинальной модели, подход с разрывом контура показывает, что система JNK действительно является бистабильной для широкого диапазона сил обратной связи (рис. 4). Обратите внимание, что этот результат не зависит от точных параметров, а скорее от сигмоидальной характеристики ввода-вывода каскада JNK. В этом анализе сила обратной связи соответствует каталитической активности JNK по фосфорилированию ASK / MLK.Точнее, пусть x ₀ , x ₁ и x ₂ обозначают концентрации не-, одно- и дважды фосфорилированных ASK / MLK соответственно, и пусть далее k _f каталитическая активность входящего ASK / MLK u и k _b каталитическая активность активного JNK y , затем

описывает скорость фосфорилирования ASK / MLK.Таким образом, сила обратной связи 100% соответствует k _b = k _f , то есть равной каталитической активности входа и JNK. Рисунок 4 показывает, что для типичных значений параметров фосфорилирования и дефосфорилирования MAPK (Huang, Ferrell, 1996; Холоденко, 2000; Холоденко и др., 2010; Накакуки и др., 2010) сила положительной обратной связи может быть снижена до менее 40% до потери бистабильности.

Рисунок 4.Анализ положительной обратной связи JNK с использованием метода разрыва петли . Здесь g обозначает силу обратной связи, то есть отношение g = k _b / k _f в (1). (A – D) Сплошные синие линии представляют собой установившуюся характеристику системы ввода-вывода. Пунктирными линиями обозначены различные конфигурации обратной связи, причем наклон представляет силу обратной связи и сдвиг вправо, измеренный от источника стимула с прямой связью. (A) Иллюстрация метода разрыва петли (подробное объяснение см. В основном тексте). (B) В зависимости от силы обратной связи система JNK демонстрирует моностабильное или бистабильное поведение (u = 0). (C) Одновременная стимуляция с обратной связью и прямой связью может подтолкнуть систему из моностабильного выключения (белый) через бистабильный (светло-зеленый) в моностабильный (светло-красный) режим. (D) Бистабильное поведение невозможно для коэффициентов обратной связи, меньших, чем величина, обратная максимальной крутизне характеристики ввода-вывода.

Точка перехода от моностабильного к бистабильному поведению называется бифуркацией вил и зависит не только от силы обратной связи, но и от входного сигнала в восходящем направлении. Напомним, что ASK / MLK не только фосфорилируются с помощью обратной связи JNK, но также и входящие в восходящий поток входы (такие как киназы, рекрутируемые GTPase, или MAP4Ks). Для графического анализа предположение, что постоянный ввод соответствует сдвигу вправо линии обратной связи, при этом значение сдвига вправо указывает силу ввода (рисунок 4).Применение входного сигнала с прямой связью к системе обратной связи, которая изначально не была бистабильной (из-за низкого усиления обратной связи), может перевести ее в бистабильный режим и далее. Таким образом, система переходит из режима моностабильного выключения через бистабильный режим в режим моностабильного включения (Рисунок 4). Кроме того, комбинированный анализ обратной связи и входных данных с прямой связью показывает, что даже для соответствующих входных данных бистабильность теряется, если сила обратной связи слишком мала. Фактически, для существования бистабильного режима обратная величина силы обратной связи должна быть меньше максимального наклона сигмоидальной характеристики ввода-вывода (рисунок 4).

2.3.2. Отрицательная обратная связь через киназы двойной специфичности

Базовая модель, изображенная на рисунке 1, не содержит отрицательной обратной связи в модуле JNK. Однако отрицательная обратная связь не редкость в каскадах MAPK и часто зависит от контекста. Например, ERK обладает несколькими петлями отрицательной обратной связи, которые активируются зависимым от стимуляции образом в ответ на EGF, но не NGF или HRG (Santos et al., 2007; von Kriegsheim et al., 2009; Nakakuki et al., 2010). .Что касается передачи сигналов JNK, некоторые DUSP проявляют каталитическую активность по отношению к JNK и могут индуцироваться с помощью активного JNK (Dickinson and Keyse, 2006; Boutros et al., 2008). Одним из таких примеров является DUSP1 (Bokemeyer et al., 1996). Поэтому мы исследовали возможность отрицательной обратной связи, опосредованной DUSP1, в модуле JNK. Обратите внимание, что система не является монотонной из-за отрицательной обратной связи. Следовательно, графический анализ с использованием разрыва петли не может оценивать стабильность стационарных состояний, а только их существование, и должен быть дополнен анализом локальной устойчивости или моделированием.

Отрицательная обратная связь с вышестоящими компонентами JNK может снизить сверхчувствительность и привести к колебаниям (данные не показаны, см., Например, Kholodenko et al., 2010 для общего лечения). Напротив, медленная отрицательная обратная связь, опосредованная DUSP1, может отключить бистабильный переключатель, генерируемый быстрой положительной обратной связью (рис. 5). В зависимости от относительной силы обратной связи существует временный бистабильный режим, в котором система JNK отвечает длительной активностью в ответ на кратковременный стимул.Таким образом, положительная обратная связь поддерживает состояние во включенном состоянии после того, как входной сигнал спадает, но только до тех пор, пока медленная отрицательная обратная связь не вступит в силу, уменьшая (начальную) характеристику ввода-вывода системы, после чего JNK отключается (рисунок 5).

Рисунок 5. Модуляция бистабильного переключателя отрицательной обратной связью . (A) Схема расширенной модели JNK, в которой активный JNK индуцирует экспрессию мРНК DUSP1 ( mD ) и белка ( pD ). (B) Анализ разрыва контура, показывающий переходный бистабильный режим (светло-зеленый). Синий: начальная характеристика ввода-вывода разомкнутой системы при t = 30 мин до того, как сработает отрицательная обратная связь. Красный: характеристика ввода / вывода в установившемся режиме. (C – E) Траектории ответа JNK после стимуляции переходным импульсом продолжительностью 3 мин ( u ( t ) = 1 для 0 < t <3) для различной силы обратной связи: (C) г = 0, (D) г = 0.7, (E) г = 1,5. Пунктирными линиями показаны ответы без отрицательной обратной связи, сплошными линиями — отрицательная обратная связь.

2.4. Регулирование апоптотического переключателя JNK с помощью перекрестных помех

Митогенные сигналы и сигналы выживания регулируют апоптотический переключатель JNK посредством перекрестных помех, происходящих на нескольких уровнях (Рисунок 1). Мы можем выделить два механизма; во-первых, ингибирование активации JNK путем фосфорилирования вышележащих киназ JNK по ингибирующим остаткам и, во-вторых, усиление дефосфорилирования JNK за ​​счет активации фосфатаз.Первый механизм опосредуется AKT, классическим медиатором передачи сигналов выживания. Второй механизм опосредуется ERK, классическим медиатором передачи сигналов пролиферации и дифференцировки.

Далее мы используем номинальную модель, чтобы расшифровать, как перекрестные помехи MAPK интегрируют различные митотические сигналы, сигналы выживания и стресса, особенно с упором на бистабильное переключение. Во-первых, мы стимулируем модель с постоянными входами для митоза и выживания uERK (t) = ERK, uAKT (t) = ûAKT и позволяем траекториям расслабиться до устойчивого состояния.Затем мы применяем стрессовые стимулы в виде ступенчатых входов

Полезно определить порог переключения как значение ûJNK, при котором JNK переключается из выключенного состояния во включенное состояние.

2.4.1. Как AKT управляет переключателем JNK

AKT влияет на порог переключения и регулирует состояние включения JNK (рисунок 6). Увеличение активности AKT снижает значение включенного состояния JNK.В то время как бистабильное поведение все еще возможно для умеренной передачи сигналов AKT, сильная передача сигналов AKT отменяет апоптотический переключатель JNK и допускает только умеренную пролиферативную активность JNK.

Рисунок 6. Регулировка переключателя отрицательными перекрестными помехами AKT . (A – C) Схемы взаимодействия и моделируемые доза-отклики для перекрестных помех на разных уровнях: уровень MAP3K и MAP2K (A) ; MAP3K уровень (B) ; и MAP2K level (C) , посредством чего активный AKT фосфорилирует и ингибирует ASK / MLK и / или MKK4 / 7, как указано.Слева: схема взаимодействия. Справа: дозовые реакции относительно входа JNK и _JNK для различных уровней активации AKT ; uJNK (t) = ûJNKfort> 0; uAKT = ûAKTforallt; синие кривые указывают на низкую активность, красные линии — на высокую активность AKT; Пунктирные линии указывают на переключение с низкой активности JNK на высокую.

Регулирование переключателя JNK с помощью AKT не зависит от точной топологии перекрестных помех, поскольку изолированные перекрестные помехи на уровнях MAP2K или MAP3K демонстрируют аналогичные шаблоны управления (рис. 6).Одно небольшое отличие состоит в том, что перекрестные помехи на уровне MAP3K имеют немного большее влияние на порог переключения и допускают некоторую чувствительность пролиферативного режима по отношению к входу JNK, что означает, что изменение входа JNK изменяет уровень активности JNK (оранжевая и красная кривые на рисунке 6B). Напротив, кривые, возникающие в результате перекрестных помех MAP2K, почти плоские, что означает, что изменение входа JNK не влияет на активность JNK, кроме его включения или выключения (рис. 6C). Таким образом, модель перекрестных помех MAP2K быстро насыщается для всех уровней активности AKT, после чего изменение входа не влияет на выход.Напротив, модель перекрестных помех MAP3K не насыщается, когда активность AKT высока, и после пересечения определенного порога JNK линейно реагирует на изменения входного сигнала.

2.4.2. Как ERK и p38 управляют переключателем JNK

Увеличение входа сигнализации ERK смещает порог переключения в сторону более высоких входов JNK, но мало влияет на значение включенного состояния (рисунок 7). Важно отметить, что промежуточная активация JNK невозможна, JNK либо выключен, либо включен. Кроме того, мощность апоптотической передачи сигналов JNK после активации не зависит от входа ERK.

Рисунок 7. Регулировка переключателя JNK с помощью ERK и p38 . (А) Схема взаимодействия. (B, C) Смоделированные ответные реакции на дозу по отношению к входам JNK для различных уровней постоянной стимуляции пути ERK; uJNK (t) = ûJNKfort> 0; u _p38 ( t ) = 1 для t > 0; uERK = ERKforall t; синие кривые указывают на низкую стимуляцию ERK, красные линии — на высокую; Пунктирные линии указывают на переключение с низкой активности JNK на высокую. (B) Дозовые ответы для первичных / нетрансформированных клеток, демонстрирующих перекрестные помехи p38 ⊣ ERK. (C) Дозовые ответы для трансформированных / онкогенных клеток, лишенных перекрестной помехи p38 ⊣ ERK (в модели отсутствует повышающая регуляция PP2A).

Регулировка переключателя JNK с помощью ERK зависит от перекрестных помех p38-ERK, p38 → PP2A ⊣ ERK. Нормальные, нетрансформированные клетки могут инициировать апоптотический переключатель JNK в зависимости от уровня экспрессии PP2A и передачи сигналов p38. Здесь увеличение активации пути p38 и экспрессии PP2A увеличивает режим толерантных стимулов ERK, для которых входы JNK могут инициировать апоптотический переключатель (Рисунок 7B).Напротив, в трансформированных и онкогенных клетках, лишенных перекрестных помех p38-ERK, даже очень умеренная стимуляция пути ERK предотвращает апоптотический переключатель JNK (фиг. 7C).

2.4.3. Как различные модели перекрестных помех, опосредованные DUSP, влияют на динамику JNK

являются важными регуляторами деятельности МАПК. Основная функция DUSP — дефосфорилирование петли активации MAPK, часто с перекрывающейся субстратной специфичностью (Dickinson and Keyse, 2006; Boutros et al., 2008; Bermudez et al., 2010). Важно отметить, что несколько DUSP, в свою очередь, регулируются с помощью MAPK и индуцируются в ответ на митотические сигналы, сигналы дифференцировки и стресса. Следовательно, регуляция DUSPs может происходить на нескольких уровнях, включая регуляцию активности DUSP фосфатазы, субстратной специфичности, стабильности белков и экспрессии генов (Dickinson and Keyse, 2006; Boutros et al., 2008). Возникающие в результате структуры обратной связи и перекрестных помех сложны и не имеют полного понимания. Из-за этой сложности мы сформулировали несколько моделей, основанных на сообщениях о специфичности DUSP в литературе (Таблица 3; Dickinson and Keyse, 2006; Boutros et al., 2008; Паттерсон и др., 2009). Сосредоточив внимание на MAPK-индуцированной транскрипции генов и пренебрегая сложностью посттранскрипционных регуляций DUSP, эти модели используются для анализа эффектов различных структур перекрестных помех.

Таблица 3 . Индуцибельные ДУСП реализованы в модели .

Таблица 4 . Реакции, выражения скоростей и параметры процессов экспрессии фосфатазы в базовой модели .

Таблица 5 . Реакции, скоростные выражения и параметры процессов экспрессии фосфатазы в базовой модели .

DUSP1 может быть индуцирована активными p38 и JNK в зависимости от клеточного контекста (таблица 3), и она часто активируется при раке. JNK-индуцированная экспрессия DUSP1 и результирующая отрицательная обратная связь с JNK уже анализировались в разд. 2.3.2, рис. 5. В этом разделе мы сосредоточимся на индуцированной p38 экспрессии DUSP1 и результирующем перекрестном влиянии p38 ⊣ p38 / JNK.Мы уже видели в гл. 2.4.2, рисунок 7, перекрестные помехи p38 ⊣ ERK ⊣ JNK являются критическим регулятором переключателя JNK. Однако в базовой модели также присутствуют перекрестные помехи JNK ⊣ ERK / p38, опосредованные экспрессией DUSP2, и мы спрашиваем, являются ли эти перекрестные помехи также решающими для переключения JNK, удаляя DUSP2 в модели.

На рисунке 8 показаны отклики c-паттернов на пошаговые входные сигналы стресса,

при наличии постоянного митотического сигнала u _ERK ( t ) = 1 для всех t .Мы можем выделить два качественно разных поведения, независимо от наличия или отсутствия обратной связи ERK (опосредованной DUSP4 или DUSP5 / 6). Модели в первой группе не характеризуются индуцированной p38 экспрессией DUSP1, и делеция DUSP2 в этих моделях мало влияет на динамику активации JNK и переключение JNK (Фигуры 8A, B). В этой группе модель A является базовой, но модель B также включает опосредованную DUSP4 отрицательную обратную связь с ERK; ERK ⊣ ERK / JNK (Таблица 3), что приводит к ускоренной динамике активации JNK (Рисунок 8B).Напротив, модели во второй группе показывают индуцированную p38 экспрессию DUSP1, а делеция DUSP2 в этих моделях отменяет переключение JNK, что приводит к снижению, умеренной активности JNK (Фигуры 8C-E). Помимо основных взаимодействий, модель C включает эту индуцированную p38 экспрессию DUSP1, которая немного задерживает динамику активации JNK, но не уничтожает переключатель JNK (Figure 8C). Однако удаление DUSP2 в модели C отменяет переключение JNK и приводит только к умеренной активности JNK (рис. 8C).Подводя итог, эти модели предсказывают, что устранение JNK-зависимого апоптоза требует как индуцированной p38 экспрессии DUSP1, так и подавления или удаления DUSP2. Добавление отрицательной обратной связи ERK, опосредованной DUSP4 (модель D) или DUSP4 и DUSP5 / 6 (модель E), к модели C не изменяет динамику JNK или поведение делеции DUSP2 (Фигуры 8D, E).

Рис. 8. Динамика апоптотического переключения для различных паттернов перекрестных помех . В центральном и правом столбцах показаны траектории активации MAPK после стрессового стимула ( u _p38 = u _JNK = 1 для t > 0) в присутствии митотического сигнала ( u _ERK = 1 для всех t ) для указанных шаблонов взаимодействия.Слева вверху: схема взаимодействия MAPK. Черные дуги указывают на основные взаимодействия, зеленые дуги указывают на дополнительные опосредованные DUSP взаимодействия, проанализированные на панелях (A – E) . Вверху справа: таблица, обобщающая различные шаблоны взаимодействия DUSP, соответствующие (A – E) . (A) Модель сердечника (подробную схему см. На Рисунке 1). (B) Базовая модель и DUSP4 опосредовали отрицательную обратную связь по ERK. (C) Core модель и p38 индуцировали экспрессию DUSP1, опосредуя отрицательную обратную связь с ERK и перекрестную связь с JNK: p38 (p38 / JNK. (D) Модель C и DUSP4 опосредовали отрицательную обратную связь по ERK. (E) Модель D и DUSP5 / 6 опосредовали отрицательную обратную связь по ERK.

Устойчивость базовой модели в отношении либо (i) усиления индуцированного p38 DUSP1, либо (ii) потери изолированного DUSP2, индуцированного JNK, можно объяснить следующим образом. Чтобы заблокировать JNK в высокоактивном состоянии (при наличии ввода ERK), активность ERK должна подавляться либо активностью p38 через связь PP2A-ERK, либо активностью JNK через связь DUSP2-ERK.В отсутствие DUSP1 активность p38 достаточно высока для подавления ERK. В присутствии DUSP1 активность p38 снижается, и ERK недостаточно подавляется одним p38-PP2A. Здесь перекрестная помеха JNK-DUSP2-ERK становится решающей, поскольку она дополняет опосредованное p38-PP2A ингибирование ERK, что объясняет хрупкость переключения JNK, если одновременно происходит повышение уровня DUSP1, индуцированного p38, и потеря DUSP2, индуцированного JNK.

3. Обсуждение

Процесс построения модели с несколькими путями довольно сложен, как и последствия его анализа для клеточной биологии и рака.Оба обсуждаются ниже.

3.1. Теоретические соображения

Сеть, изображенная на рисунке 1, синтезирует информацию от различных типов ячеек из литературы. Однако полная картина перекрестных помех MAPK все еще отсутствует. Сеть взаимодействий DUSP особенно трудно вскрыть, т.к. DUSPs могут индуцироваться несколькими MAPKs и, в свою очередь, могут действовать на несколько субстратов (Boutros et al., 2008). Важно отметить, что рисунок 1 не является обзором, суммирующим все возможные взаимодействия, но изображает базовую модель взаимодействий MAPK, которые необходимы для реализации пролиферативно-апоптотического переключателя JNK.С теоретико-системной точки зрения решающим фактором, определяющим поведение модели, является наличие перекрестных помех и обратных связей, а не то, какие молекулы их опосредуют. Следовательно, хотя все взаимодействия в модели убедительно подтверждаются экспериментальными данными в литературе, конкретные участвующие изоформы DUSP могут различаться в зависимости от типа клеток и контекста. Связь DUSP2 в нашей модели основана на данных по линиям фибробластов и раковых клеток (см. Раздел 2.1.5), но особенно сомнительна.DUSP2 специфически дефосфорилирует ERK и p38 в клетках NIh4T3 и HeLa (Chu et al., 1996), но нацелен на JNK в макрофагах и тучных клетках (Jeffrey et al., 2006). Эти различия предполагают, что перекрестные помехи JNK ⊣ ERK / p38 могут опосредоваться в иммунных клетках по-разному по сравнению с фибробластами и эпителиальными раковыми клетками. В соответствии с нашей моделью макрофаги и тучные клетки демонстрируют перекрестные помехи JNK ⊣ ERK / p38, но, в отличие от нашей модели, эти перекрестные помехи не опосредованы DUSP2, поскольку делеция DUSP2 в макрофагах и тучных клетках увеличивает активность JNK и снижает фосфорилирование ERK и p38 (Джеффри и другие., 2006). Эти специфические различия типов ячеек подчеркивают важность гибких подходов к моделированию, которые облегчают анализ различных конфигураций моделей. Как показано в Разделе 2.4.3, тестирование топологий альтернативных моделей может быть легко выполнено путем установки параметров в текущей модели.

3.1.1. Модульность и запущенные компоненты

Номинальная модель не учитывает несколько контекстно-зависимых перекрестных помех и обратных связей MAPK, которые не являются необходимыми для реализации апоптотического переключателя JNK.Например, ERK имеет несколько (отрицательных) петель обратной связи (Birtwistle et al., 2007; von Kriegsheim et al., 2009). Как правило, эта обратная связь действует выше MEK (на компоненты, которые не включены в модель, такие как рецепторы факторов роста, их адаптеры и GTPases), тем самым временно формируя активацию Raf, то есть вход модели u ₁ . Таким образом, хотя модель не учитывает обратные связи ERK явно, она может учитывать различные паттерны активации Raf, выбирая соответственно и ₁ в качестве зависящей от времени входной функции (Nakakuki et al., 2010). Одним из преимуществ этого модульного подхода является то, что он облегчает дальнейшую разработку модели, поскольку входные функции могут быть заменены дополнительными наборами дифференциальных уравнений. При этом модель легко подключается к другим моделям, описывающим динамику различных рецепторов и ГТФаз.

Дальнейшая разработка модели будет касаться включения более механистических деталей, в частности, в отношении хорошо изученного каскада ERK. Например, ERK демонстрирует сильную отрицательную обратную связь с Raf-1 в ответ на EGF, который изменяет эффективность ингибирования MEK (Sturm et al., 2010) и могут влиять на перекрестные помехи p38-PP2A-MEK. Напротив, IGF преимущественно активирует ERK через B-Raf без отрицательной обратной связи (Fritsche-Guenther et al., 2011), демонстрируя, что эти расширения модели будут зависеть от контекста и стимула.

3.1.2. Пространственные аспекты

Математически модель описывает клетку как смешанный компартмент и не различает субклеточные компартменты. Это упрощение может не быть проблемой для перекрестных помех ERK-JNK, поскольку оно включает как ядерный (DUSP4), так и цитозольный (DUSP16) компонент, но может переоценить влияние перекрестных помех JNK-ERK / p38 и p38-JNK, поскольку они Медиаторы DUSP2 и DUSP1 локализованы исключительно в ядре.В целом, пространственная регуляция DUSP и MAPK сложна, поскольку DUSP могут как перемещать, так и изолировать MAPK в ядре и цитозоле (Masuda et al., 2001; Karlsson et al., 2004; Mandl et al., 2005; Caunt and Кейз, 2012). Кроме того, многие MAPKs и их MAP2Ks также перемещаются между цитозолем и ядром, и активация и дезактивация могут происходить в обоих компартментах (Plotnikov et al., 2011). Например, MKK3 / 6 расположены как в цитозоле, так и в ядре и могут опосредовать активацию p38 в ядре (Ben-Levy et al., 1998). И ERK, и MEK конститутивно перемещаются между цитозолем и ядром, и ERK может быть активирован в обоих компартментах (Fujioka et al., 2006). Сходным образом дезактивация ERK с помощью DUSP может происходить в ядре и цитозоле в зависимости от локализации конкретных изоформ DUSP. Ядерные DUSPs, по-видимому, служат якорными белками, которые удерживают дефосфорилированные ERK в ядре, чтобы предотвратить повторную активацию в цитозоле (Lenormand et al., 1998). Таким образом, пространственный контекст, по-видимому, играет сложную роль в модуляции активности MAPK, потребуется больше работы, чтобы расшифровать и смоделировать пространственные регуляции DUSP и их влияние на активность MAPK.

3.1.3. Зависимость параметра

Параметризация динамических моделей сложна, обычно требуя измерений динамики в нескольких различных условиях и подгонки модели с использованием глобальных алгоритмов оптимизации, в результате чего результирующие оценки параметров могут варьироваться в зависимости от типа ячейки и экспериментального контекста. Чтобы получить номинальную модель, мы выбрали значения параметров в соответствии с более ранними моделями передачи сигналов MAPK и кинетической информацией в литературе, такими как измерения периода полураспада DUSP (см. Материалы и методы).Для упрощения модель предполагала одинаковые параметры для разных MAPK. Мы не ожидаем, что это предположение выдержит экспериментальную проверку во время оценки параметров, поскольку оно было принято по теоретическим причинам. (Мы ссылаемся на von Kriegsheim et al., 2009; Cirit et al., 2010; Nakakuki et al., 2010 для компиляции кинетических параметров и Legewie et al., 2008 для скорости оборота.) Во-первых, предполагая равные константы связывания для киназ воздействие на общие субстраты установило симметрию в модели, которая дала упрощенные, подобные Михаэлису-Ментену кинетические выражения на этапе редукции модели (см. Материалы и методы ).Во-вторых, выбор одинаковых каталитических активностей для разных MAPK упрощает анализ модели, исходя из того, что в этом случае динамика системы определяется структурой системы и не смещается в сторону возможных дисбалансов определенных значений параметров. Тем не менее, важной особенностью модели является то, что бистабильная природа апоптотического переключателя JNK не зависит от точных значений используемых параметров, а зависит от структуры обратной связи и сигмоидальной формы характеристики ввода-вывода.Тем не менее, для достижения модели количественного прогнозирования потребуется дальнейшая работа по сбору данных и параметризации, особенно в отношении киназ, активируемых стрессом, где имеется мало кинетической информации.

3.2. Биологические последствия

Хотя идея петли положительной обратной связи JNK не нова (Ventura et al., 2006), детальное понимание того, как структуры обратной связи JNK и перекрестные помехи регулируют судьбу клеток, все еще отсутствует (Wagner and Nebreda, 2009).В более ранних исследованиях моделирования системы MAPK рассматривались изолированно друг от друга, либо с упором на передачу сигналов ERK и ее обратные связи (von Kriegsheim et al., 2009; Kholodenko et al., 2010; Nakakuki et al., 2010; Sturm et al., 2010). , или перекрестные помехи p38-JNK (Sundaramurthy et al., 2009; Sundaramurthy and Gakkhar, 2010). Напротив, в этой рукописи представлена ​​модель системного уровня положительной обратной связи JNK, ее регуляции путем перекрестных помех, включая передачу сигналов ERK и AKT, а также математический анализ того, как эта система объединяет различные стимулы пролиферации, выживания и проапоптотические стимулы, тем самым определяя судьбы клеток.Модель помогает нам понять экспериментальные наблюдения в литературе и включает в себя несколько идей. Во-первых, важны величина и временной профиль передачи сигналов JNK, поскольку антиапоптотический пролиферативный ответ связан с умеренной, но быстрой активацией JNK, тогда как проапоптотический ответ связан с более поздней, более устойчивой активацией JNK (Lamb et al., 2003; Сакон и др., 2003; Вентура и др., 2006). Во-вторых, как митотическая передача сигналов через ERK, так и передача сигналов выживания через AKT модулируют апоптотический переключатель JNK (Molton et al., 2003; Junttila et al., 2008). В-третьих, потеря негативных перекрестных помех от p38 к ERK нарушает регуляцию JNK-зависимого апоптоза, который является критическим для трансформации клеток (Arroyo and Hahn, 2005; Junttila et al., 2008). В целом, передача сигналов JNK с участием петли положительной обратной связи занимает центральное место в предлагаемой модели, которая объясняет, как ERK и AKT-опосредованные перекрестные помехи модулируют и переключают пролиферативную и проапоптотическую передачу сигналов JNK.

3.2.1. Различия в контроле ERK и AKT над апоптотическим переключателем JNK

В этой модели переключение на апоптотическую передачу сигналов JNK критически зависит от петли положительной обратной связи JNK, которая, будучи однажды активированной, вызывает высокие уровни устойчивой активности JNK.Этот переключатель модулируется сигналами ERK и AKT по-разному. Активность ERK сдвигает порог для апоптотического переключения JNK до более высоких значений, но не влияет на силу апоптотической передачи сигналов JNK. Механизм, лежащий в основе этого поведения, — усиленное дефосфорилирование JNK, посредством чего активность JNK либо достаточна для активации петли положительной обратной связи JNK и ингибирования передачи сигналов ERK, либо не достигает этого порогового уровня. Напротив, активность AKT преимущественно регулирует силу передачи сигналов JNK за ​​счет уменьшения значения включенного состояния JNK с небольшим влиянием на порог переключения.За этим стоит механизм фосфорилирования и ингибирования восходящих киназ JNK, что снижает силу как петли прямого распространения, так и петли обратной связи. Что особенно важно, уменьшенная сила обратной связи приводит к снижению уровня включенного состояния JNK.

3.2.2. Трансформированные клетки в сравнении с нормальными

Трансформированные клетки отличаются от нормальных клеток тем, что они лишены опосредованного PP2A негативного перекрестного взаимодействия от p38 к ERK (Junttila et al., 2008). В модели потеря p38-ERK отрицательного перекрестного взаимодействия серьезно увеличивает порог переключения JNK, тем самым снижая чувствительность клеток к индуцированному стрессом апоптозу.Взятые вместе, эти наблюдения подтверждают участие апоптотического переключателя JNK в клеточном старении следующим образом. С каждым клеточным циклом клетки накапливают повреждения ДНК и укорачивают хромосомные теломеры. Как только определенный порог повреждения ДНК или укорочения теломер преодолевается, происходит старение или индуцируется апоптоз. Потеря перекрестной помехи p38-ERK увеличит этот порог до нефизиологического уровня, таким образом делая трансформированные клетки биологически бессмертными. В этой модели старения AKT не участвует, поскольку перекрестные помехи AKT-JNK не изменяют апоптотический порог, а вместо этого предотвращают апоптотический переключатель в присутствии сигналов выживания.

4. Выводы

Разработанная модель объясняет, как перекрестные помехи пути гармонизируют ответы MAPK, приводя к решениям судьбы стержневых клеток, которые заметно различаются между трансформированными и нетрансформированными клетками. В предлагаемой модели JNK может переключаться с переходной на устойчивую активность из-за множества петель положительной обратной связи. После активации положительная обратная связь блокирует JNK в очень активном состоянии, которое способствует гибели клеток. Переключатель по-разному регулируется путями ERK, p38 и AKT.Активация ERK усиливает дефосфорилирование JNK, опосредованное двойной специфической фосфатазой (DUSP), и сдвигает порог апоптотического переключения в сторону более высоких входов. В нетрансформированных клетках активация p38 может восстанавливать порог путем ингибирования активности ERK через фосфатазы PP1 или PP2A. Наконец, активация AKT ингибирует положительную обратную связь JNK, тем самым отменяя апоптотический переключатель и разрешая только пролиферативную передачу сигналов. Модель наиболее ценна для понимания того, как раковые нарушения нарушают обработку сигналов внутренних и внешних сигналов, и дает возможные объяснения устойчивости к определенным лекарствам.Например, индуцированная онкогеном гиперактивность ERK предотвращает нормальное переключение апоптоза и обеспечивает возможные объяснения сложного и специфичного для опухоли поведения систем MAPK (Dickinson and Keyse, 2006; Wagner and Nebreda, 2009; Bermudez et al., 2010).

Что касается взаимодействий, необходимых для облегчения переключения между временной и устойчивой активностью JNK, наша модель предсказывает критическую роль паттернов экспрессии DUSP1 и DUSP2. В модели и экспрессия DUSP1, и делеция DUSP2 необходимы для предотвращения апоптотического переключения JNK (поскольку номинальная модель устойчива к нарушению регуляции любого DUSP в отдельности).Результат особенно интересен в контексте (а) рака, поскольку многие виды рака демонстрируют повышенную экспрессию DUSP1 и сниженную экспрессию DUSP2, и (б) состояния, связанные с опухолью, такие как гипоксия, когда низкие уровни кислорода активируют DUSP1 и подавляют DUSP2 (Паттерсон et al., 2009; Lin et al., 2011). Согласно нашей модели, эти условия будут препятствовать апоптотическому переключению JNK. Действительно, принудительная экспрессия DUSP2 устраняет индуцированную гипоксией химиорезистентность в линиях раковых клеток человека (Lin et al., 2011), а ингибирование DUSP1 сенсибилизировало несколько устойчивых линий раковых клеток к JNK-зависимому апоптозу (Laderoute et al., 1999; Sánchez-Pérez et al., 2000; Small et al., 2007; Wang et al., 2008).

Текущая модель представляет базовую сеть взаимодействий MAPK, критических для перехода от пролиферативной к апоптотической передаче сигналов. Модель является канонической в ​​том смысле, что она обобщает и интегрирует информацию из разных клеточных линий, фокусируясь на взаимодействиях, которые (а) легко наблюдаются в нескольких клеточных линиях и (б) важны для управления бистабильным переключателем JNK.Каноническая модель формирует основу для дизайна эксперимента и может быть адаптирована к различным экспериментальным системам на двух уровнях с помощью (а) оценки параметров (эпигенетический фон и фон болезни определенных типов клеток отражается в различных значениях параметров модели) и (б) расширение модели для включения различных изоформ MAPK, восходящей и нисходящей передачи сигналов и каркасов. Такие уточненные и проверенные модели обладают способностью количественного прогнозирования и не могут использоваться только для выявления пробелов в знаниях путем проверки прогнозов модели, но также для прогнозирования эффекта лекарств, тем самым создавая теоретическую основу для определения оптимальных стратегий лечения.

5. Материалы и методы

В этом разделе описывается математическое моделирование различных компонентов, изображенных на рисунке 1.

5.1. Модель активации киназы

Активация митоген-активированных протеинкиназ требует фосфорилирования двух консервативных аминокислотных остатков, в результате чего несколько вышележащих киназ могут действовать как ферменты, способствующие фосфорилированию. Рассмотрим схему реакции на рисунке 9, где мы предположили, что только один фермент может быть связан с киназой в любой момент времени.Скорость реакции описывается законом действия масс:

, а динамика системы определяется обыкновенными дифференциальными уравнениями

Рисунок 9.Схемы двойного цикла фосфорилирования двумя киназами . X обозначает белок, подлежащий фосфорилированию, с индексом, указывающим его статус фосфорилирования. U обозначают киназы, катализирующие фосфорилирование. (A) Полная механистическая схема, смоделированная с использованием кинетики массового воздействия. Для ясности изложения реакции дефосфорилирования не изображены. (B) Уменьшенная схема, смоделированная с использованием кинетики типа Михале-Ментен, полученной из основного текста; k ₁ и k ₂ обозначают каталитическую активность U ₁ и U ₂ соответственно. P обозначает фосфатазу, катализирующую дефосфорилирование.

Мы можем получить упрощенное описание этой системы, напоминающее классическую кинетику Михаэлиса Ментена, используя консервативные фрагменты для ферментов

, где ûi обозначает общую концентрацию фермента i , и предполагая быстрое равновесие для реакций связывания, решая систему r _i = 0 ( i = 1,…, 4) для комплексных состояний x _{0 u 1} , x _{1 u 1} , x _{0 u 2} , x _{1 u 2} .Подставляя раствор в реакции фосфорилирования v _i ( i = 1,…, 4) дает

с K _di = p _{— i} / p _i ( i = 1, 2), обозначающим константу диссоциации комплексов фермент-киназа. Мы можем дополнительно упростить модель, приняв равные константы диссоциации K _di = K _d , где

Предположение об одинаковых константах диссоциации является сильным предположением, особенно для разных ферментов, но снижает риск чрезмерной параметризации и облегчает теоретический анализ модели.

Дефосфорилирование киназ катализируется фосфатазами, и математическая модель может быть получена аналогичным образом, приводя к кинетическим выражениям, напоминающим уравнение (5). j) x2K − d + x1 + x2,

, где u _i обозначают концентрации вышестоящих киназ, v _j — концентрации фосфатаз.

5.2. Модель ингибирования киназ фосфорилированием

Некоторые киназы могут стать каталитически неактивными за счет фосфорилирования в ингибирующих сайтах. Примерами являются ASK1 и MKK4, которые могут фосфорилироваться AKT по Ser 83 и Ser 78, соответственно (Kim et al., 2001; Park et al., 2002). Имеется мало, в основном противоречивая информация о том, зависит ли фосфорилирование ингибирующего сайта от статуса фосфорилирования активирующих сайтов или, в свою очередь, влияет ли фосфорилирование в ингибиторном сайте на фосфорилирование / дефосфорилирование активирующих сайтов.Следовательно, мы применяем доменно-ориентированный подход, учитывающий все возможные комбинации статуса фосфорилирования (но игнорируя возможность тримерного комплекса), что приводит к модели, включающей шесть различных состояний (Borisov et al., 2005, 2006; Kiyatkin et al. , 2006; Conzelmann et al., 2008).

Предположим, что статус фосфорилирования активирующего сайта не влияет на связывание ингибирующего фермента и фосфорилирование ингибиторного сайта, и наоборот, что статус фосфорилирования ингибиторного сайта не влияет на связывание активирующего фермента и фосфорилирование активирующего сайта.Предположим далее, что только один фермент может быть связан с киназой в любой момент времени, то есть тримерный комплекс, состоящий из активирующего фермента, киназы и ингибирующего фермента, невозможен. Затем схему реакции на рисунке 9 можно расширить, чтобы учесть ингибирование киназы:

, где X _iI обозначает киназу, фосфорилированную в ингибирующем сайте, а U _i — фермент, катализирующий это фосфорилирование.

Аналогично уравнению (5) может быть получено математическое описание, дающее кинетику реакции (де-) фосфорилирования на активирующих сайтах формы

где ( y , z ) ∈ {( x ₀ , x ₁ ), ( x ₁ , x ₂ ), ( x _{0 I} , x _{1 I} ), ( x _{0 I} , x _{1 I} )} и кинетика реакции для (де-) фосфорилирования ингибиторный сайт формы

Национальный центр исследований кардиоваскулярных заболеваний (CNIC), возглавляемый доктором Валентином Фустером, посвящен исследованиям сердечно-сосудистой системы и преобразованию полученных знаний в реальную пользу для пациентов. CNIC, признанный правительством Испании центром передового опыта Северо-Очоа, финансируется за счет новаторского государственно-частного партнерства между правительством (через Институт здоровья Карлоса III) и Фондом Pro-CNIC, который объединяет 14 представителей самые важные испанские частные компании.

Заявление об отказе от ответственности: AAAS и EurekAlert! не несут ответственности за точность выпусков новостей, размещенных на EurekAlert! участвующими учреждениями или для использования любой информации через систему EurekAlert.

Роль киназ p38 MAP in vivo в ремоделировании сердца и рестриктивной кардиомиопатии

Реферат

Стресс-индуцированная митоген-активируемая протеинкиназа (MAP) p38 активируется при различных формах сердечной недостаточности, однако ее влияние на интактное сердце еще предстоит установить.Нацеленная активация киназы p38 MAP в желудочковых миоцитах была достигнута in vivo с использованием трансгенной стратегии переключения генов с активированными мутантами вышестоящих киназ MKK3bE и MKK6bE. Экспрессия трансгена приводила к значительной индукции активности киназы p38 и преждевременной смерти через 7–9 недель. Обе группы трансгенных сердец демонстрировали выраженный интерстициальный фиброз и экспрессию фетальных маркерных генов, характерных для сердечной недостаточности, но не имели значительной гипертрофии на уровне органов.Эхокардиографический анализ и анализ давления-объема выявили сходную степень систолической сократительной депрессии и рестриктивных диастолических аномалий, связанных с заметно повышенной жесткостью пассивной камеры. Однако сердца, экспрессирующие MKK3bE, имели увеличенные объемы конечных систолических камер и истонченную стенку желудочков, связанную с гетерогенной атрофией миоцитов, тогда как сердца MKK6bE имели уменьшенный размер конечной диастолической полости желудочка, умеренное увеличение размера миоцитов и отсутствие значительной атрофии миоцитов.Эти данные предоставляют доказательств in vivo отрицательного инотропного и рестриктивного диастолического эффекта от активации киназы p38 MAP в миоцитах желудочков и раскрывают специфическую роль пути p38 в развитии конечного систолического ремоделирования желудочков.

Сердечная недостаточность, развивающаяся в ответ на стойкую гемодинамическую перегрузку, является одним из наиболее распространенных заболеваний в развитых странах, особенно среди пожилого населения (1). Общепринятая парадигма развития неудач разделяет патологический процесс на две стадии (2, 3).Начальная компенсаторная стадия характеризуется гипертрофией сердца с сохранением или даже усилением систолической функции камеры и нормальным сердечным выбросом. Однако при постоянно повышенных нагрузках сердце переходит в более декомпенсированное состояние с угнетением сократимости, фиброзом миокарда и жесткостью камеры (4). Основные механизмы прогрессирования заболевания, включая его инициирование и переход к поздней стадии неэффективности, а также молекулярные компоненты, опосредующие гипертрофический фенотип по сравнению с дилатационным или рестриктивным фенотипами, остаются плохо изученными, но, вероятно, включают внутриклеточные сигнальные пути на разных этапах его развития (5).

Было показано, что подсемейство p38 митоген-активированных протеинов (MAP) киназ играет важную роль в передаче индуцированных стрессом сигналов в клетках млекопитающих (6). Мы и другие недавно сообщили, что киназы p38 MAP активируются во время развития гипертрофии и сердечной недостаточности в ответ на перегрузку давлением in vivo (7) и индуцируются ишемией / реперфузией как в сердце животных, так и в сердце человека (8, 9). В культивируемых миоцитах новорожденных активация киназы p38 MAP с помощью MKK6bE приводит к гипертрофическому ответу и выживанию клеток, тогда как экспрессия MKK3bE способствует апоптотическому ответу, опосредованному изоформой p38α (7, 10).Недавние данные нашей лаборатории также предполагают, что активация p38 опосредует отрицательный инотропный эффект в культивируемых кардиомиоцитах взрослых крыс (P.L., S. Wang, Y.W. и R.-P.X., неопубликованные результаты). Эти данные предполагают потенциально важную роль киназ p38 MAP и избирательной передачи сигналов в развитии сердечной недостаточности при патологических стрессах (11). Однако эффекты in vivo целевой активации p38 в интактных сердцах не изучались, в основном из-за трудностей создания трансгенных животных со специфической манипуляцией путей p38 в кардиомиоцитах.

В этом исследовании мы установили трансгенных животных, экспрессирующих два хорошо зарекомендовавших себя активатора пути p38 (MKK3bE или MKK6bE) (12, 13) в миоцитах желудочков, чтобы изучить эффекты активации киназы p38 MAP в интактном сердце. Подход с переключением генов был разработан на основе cre / loxP-опосредованной рекомбинации ДНК, чтобы ограничить экспрессию трансгена желудочковыми миоцитами и избежать потенциальных неблагоприятных эффектов экспрессии трансгена на выживаемость трансгенных животных-основателей (14-17).После того, как экспрессия MKK3bE и MKK6bE была генетически «включена» в миоцитах желудочков, полученные трансгенные животные умерли преждевременно от сердечной недостаточности. Сердечные фенотипы, индуцированные обоими вышестоящими активаторами p38, имеют несколько общих черт, включая индукцию экспрессии генов гипертрофических маркеров и фиброзное ремоделирование в миокарде, систоло-сократительную депрессию и глубоко нарушенную диастолическую функцию с повышенной жесткостью камеры и ограниченным заполнением камеры.Однако также наблюдались поразительные дифференциальные эффекты на ремоделирование камеры и конечное систолическое напряжение стенки, при этом MKK3bE приводил к гетерогенной атрофии миоцитов, конечному систолическому расширению и истончению стенки (более высокий стресс), тогда как MKK6bE приводил к легкой гипертрофии миоцитов с сохранением или уменьшением размер полости. Наши результаты показывают, что передача сигналов киназы p38 MAP может способствовать потере сократительной способности и жесткости миокарда, а также способствует специфическому процессу ремоделирования при сердечной недостаточности. Это исследование также демонстрирует полезность использования стратегии переключения генов для создания трансгенных линий с ранними летальными фенотипами.

Материалы и методы

Трансгенная конструкция и создание трансгенных животных.

Схематическая структура трансгенных конструкций показана на рис. 1, а подробности их конструкции опубликованы в качестве вспомогательной информации на веб-сайте PNAS www.pnas.org. Описаны активированные мутанты MKK3bE и MKK6bE человека, оба с гемагглютинином (HA) помечены на N-конце с заменой Ser и Thr на Glu (12, 13, 18).Генотипы были проверены с помощью ПЦР на хвостовой ДНК, как описано во вспомогательной информации.

Направленная экспрессия MKK3bE и MKK6bE в миоцитах желудочков in vivo . ( A ) Схематическое изображение трансгенных конструкций, используемых в создании флоксованных трансгенных мышей GFP / MKK3bE и GFP / Mkk6bE ( Upper ), и полученная структура на cre / loxP -опосредованной рекомбинации ДНК в клетках желудочковых мышц. после скрещивания с мышами MLC-2v / Cre.( B и C ) Типичные результаты вестерн-блоттинга для экспрессии рекомбинантных белков GFP, HA-MKK3bE / HA-MKK6bE в желудочках мыши. Генотипы трансгенных мышей и их однопометников указаны внизу. — / — представляет дикий тип; +/- и — / + представляют GFP-экспрессирующих MHC-flox-MKK3bE или MKK6bE- и CRE-экспрессирующих MLC-2v / cre одиночных трансгенных мышей; + / + представляет собой двойных трансгенных мышей, экспрессирующих MKK3bE- или MKK6bE. ( D ) Представлены характерные авторадиограммы анализов киназы р38.Все образцы были приготовлены от мышей аналогичного возраста от 6 до 8 недель.

Гистологический анализ.

Ткани вырезали и фиксировали в 4% параформальдегидном PBS в течение более 4 часов с последующей дегидратацией, заливкой парафином и делением на срезы толщиной 1 мкм. Окрашивание гематоксилином / эозином применяли в соответствии с установленными протоколами, а окрашивание трихромом выполняли, как описано, с использованием протокола, модифицированного по методике Массона (19).Площади поперечного сечения миофиламентов измеряли с помощью программного обеспечения Scion image (Frederick, MD) на записанных в цифровом виде микроскопических изображениях трех сердец в каждой группе, и скомпилированные данные были представлены с использованием сигмаплота.

Анализ белков, РНК и киназ.

Образцы белка были приготовлены из мгновенно замороженных сердец, как описано во вспомогательной информации. Иммуноблоттинг проводили с использованием антител против зеленого флуоресцентного белка (GFP) и mAb против НА (см. Дополнительную информацию).Затем проводили анализы киназы p38 при 30 ° C в присутствии [ ³² P] АТФ с использованием глутатиона S -трансферазы-ATF2 в качестве субстрата. Образцы РНК получали из тех же тканей сердца с использованием реагента Trizol (Life Technologies, Rockville, MD) в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем. Дот-блот-анализ РНК проводили на основе опубликованного протокола (20) с использованием набора олигонуклеотидных зондов. ПЦР с обратной транскриптазой проводили с использованием реагентов из набора Thermo-RT (GIBCO / Life Technologies).Подробная информация об этих протоколах и информация о праймерах доступны в качестве вспомогательной информации.

Гемодинамические измерения.

6-7-недельных мышей анестезировали и вентилировали перед измерением гемодинамики (см. Дополнительную информацию). Катетер давление-объем (Millar Instruments, Хьюстон, Техас) вводили в камеру левого желудочка (ЛЖ), как подробно описано во вспомогательной информации. Данные давление-объем были оцифрованы с частотой 2 кГц, а абсолютные объемы были откалиброваны, как описано (21).Гемодинамические параметры покоя определялись на основе 6–10 усредненных в цифровой форме сердечных циклов. Соотношение давление-объем было получено путем временной окклюзии нижней вены, как подробно описано во вспомогательной информации.

Эхокардиография.

Неинвазивные трансторакальные эхокардиограммы были выполнены у находящихся в сознании животных (Sequoia, Acuson, Mountain View, CA), как описано (22). В исследованиях эхокардиографии все одиночные трансгенные мыши дикого типа и Cre-положительные были сгруппированы вместе как контрольные, поскольку у мышей MLC-2v / Cre не обнаруживались сердечные аномалии (23).

Измерение сокращения клеток.

Взрослые кардиомиоциты были выделены из сердец крыс и инфицированы аденовирусными векторами, экспрессирующими MKK3bE, MKK6bE и β-галактозидазу в качестве контроля. Сокращение клеток измеряли, как описано, при комнатной температуре при электростимуляции (см. Дополнительную информацию).

Статистический анализ.

Для исследований гемодинамики и сокращения клеток, однофакторный дисперсионный анализ с экспериментальными группами (т.е., дикий тип, MKK3bE и MKK6bE, или контроль, Adv / lacZ, Adv / MKK3bE и Adv / MKK6bE) в качестве категориальной переменной выполняли с использованием теста множественных сравнений Тьюки для апостериорного тестирования различий между группами. P <0,05 считалось статистически значимым. Для эхокардиографического исследования был проведен двусторонний тест Стьюдента t между контрольными группами трансгенных и нетрансгенных однопометников.

Результаты

Направленная активация пути p38 в желудочковых миоцитах с помощью трансгенеза с переключением генов.

Флоксированные трансгенные линии были созданы с использованием конструкций, содержащих промотор мышиной тяжелой цепи α-миозина (MHC), управляющий минигеном GFP, фланкированным двумя сайтами loxP, за которым следует другой миниген, экспрессирующий мутантный белок MKK3bE или MKK6bE (мыши GFP с флоксами, рис. 1 A ). Были получены две линии-основатели для мышей floxed-GFP MKK3bE и три линии-основатели для мышей floxed-GFP MKK6bE. Белок GFP был обнаружен в миоцитах желудочков с помощью флуоресцентной микроскопии (данные не показаны) и вестерн-блоттинга (рис.1 B и C ). Напротив, экспрессия продуктов трансгена MKK3bE или MKK6bE, меченных НА, у этих животных не была обнаружена. Эти экспрессирующие GFP трансгены развивались нормально без значимого сердечного фенотипа (рис. 7 и 8, которые опубликованы в качестве подтверждающей информации). F ₂ трансгенных животных из линии 53 мышей floxed-GFP MKK3bE [GFP (MKK3bE)] и линии 8 мышей floxed-GFP MKK6bE [GFP (MKK6bE)] использовали для разведения с MLC-2v / cre ( Cre) гетерозиготные мыши (24, 25) с полностью нормальным сердцем по морфологии и функциям (см.23 и Рис. 7 и 8). У двойного трансгенного потомства, унаследовавшего как аллель MLC-2v / cre, так и аллели трансгена floxed-GFP (мыши MKK3bE или MKK6bE), события рекомбинации ДНК между двумя сайтами loxP привели к делеции последовательностей минигена GFP (данные не показаны ). Последующая потеря экспрессии GFP и экспрессия трансгена MKK3bE или MKK6bE была подтверждена на уровне белка (фиг. 1 B и C ), таким образом, в этих сердцах был достигнут «генный переход» с GFP на трансген.Нацеленная экспрессия белков MKK3bE и MKK6bE приводила к значительному увеличению активности киназы p38 в двойных трансгенных желудочковых миоцитах по сравнению с одиночными трансгенными (Cre или GFP) или контрольными животными дикого типа (фиг. 1 D ).

Патологическое ремоделирование в морфологии и экспрессии генов p38-активированных трансгенных сердец.

Активация активности киназы p38 MAP в трансгенных сердцах MKK3bE или MKK6bE привела к преждевременной смерти в возрасте от 5 до 7 недель с признаками одышки и отека легких.Гистологический анализ выявил грубые аномалии в этих двойных трансгенных сердцах по сравнению с нормальной гистологией дикого типа или контроля, экспрессирующего GFP. В сердце как MKK3bE, так и MKK6bE развились сильно увеличенные предсердия с увеличенной массой предсердий (рис. 2, таблица 1), которые часто были заполнены тромбозом. Однако внешние размеры, масса правого желудочка и ЛЖ, а также соотношение масса / тело существенно не отличались от контроля (таблица 1). Трансгены как MKK3bE, так и MKK6bE демонстрировали значительный интерстициальный фиброз (рис.2). Связанная с морфологическими изменениями, экспрессия эмбриональных маркерных генов, включая предсердный натрийуретический фактор, β-MHC и α-скелетный актин, была высоко индуцированной, тогда как α-MHC, SERCA-2a (саркоплазматическая ретикулярная кальциевая АТФаза-2a) и фосфоламбан были понижены (рис. 3). Между группами трансгенных MKK3bE и MKK6bE наблюдались небольшие различия в аномалиях экспрессии генов. Такие изменения в профиле экспрессии характерны для сердечной недостаточности на человеческих и экспериментальных моделях (20, 26–28), предполагая, что активации путей киназы p38 MAP было достаточно, чтобы вызвать патологические изменения на морфологическом и молекулярном уровнях, как это наблюдается при сердечной недостаточности.

Общая морфология трансгенных и контрольных сердец дикого типа ( A — C ) с указанными генотипами, полученными при одинаковом увеличении с использованием стереодиссекционного микроскопа. Отмечено увеличение предсердий в сердцах, экспрессирующих MKK3bE и MKK6bE, но отсутствие значительных изменений внешних размеров желудочков. ( D — F ) Окрашивание трихромом трансгенных сердец с разными генотипами, как указано. Фиброзная ткань показана темно-синим цветом.Отмечено пятнистое окрашивание в сердцах, экспрессирующих MKK3bE и MKK6bE, но отсутствующее в контрольном сердце дикого типа. (Увеличение: × 120.)

Зависимость массы сердца от массы тела

Относительные уровни экспрессии генов сердечных маркеров, измеренные методом дот-блоттинга. Значения представляют собой средние значения 4–6 образцов из каждой группы генотипов, а планки погрешностей представляют собой стандартные ошибки. АНФ, предсердный натрийуретический фактор; aMHC, α-MHC; bMHC, β-MHC; aSKAct, α-скелетный актин; CarAct, сердечный актин; SERCA, саркоплазматическая ретикулярная кальциевая АТФаза-2a; PLB, фосфоламбан.*, P <0,05 по сравнению с контрольными однопометниками дикого типа или GFP.

Дифференциальная камера и клеточное ремоделирование и ограничительное заполнение в активированных p38 трансгенных сердцах.

В отличие от гистологического анализа и анализа экспрессии генов, Эхокардиография в М-режиме (Рис. 4, Таблица 2) выявила поразительные различия, а также сходство в ремоделировании интактной камеры для двух трансгенных моделей. Активация p38 с помощью MKK3bE привела к ремоделированию левого желудочка с увеличенным конечным систолическим размером, но неизменным конечным диастолическим размером (по сравнению с контрольными однопометниками), что привело к снижению фракционного укорочения на ≈20% (Таблица 2).Эхокардиография также показала, что расширение камеры ЛЖ в сердце MKK3bE было связано с уменьшением толщины стенки. Напротив, сердца MKK6bE имели нормальный размер конечной систолической полости, снижение конечного диастолического размера ЛЖ на ≈11% и сохраненное укорочение фракции. Эхокардиография выявила большое сходство между моделями, в том числе увеличенное левое предсердие, которое подтвердило данные гистологии (рис.9, которая опубликована в качестве вспомогательной информации, и таблица 2), и ограничительное наполнение камеры (рис.4, Таблица 2), с повышенной пиковой скоростью E-волны и быстрым замедлением E-волны. Оба открытия предполагали повышенную жесткость диастолической камеры в трансгенных сердцах.

Эхокардиографическая оценка структуры и функции сердца у мышей дикого типа и трансгенных мышей. ( Upper ) Репрезентативные двумерные управляемые изображения ЛЖ в M-режиме демонстрируют минимально увеличенную относительную толщину стенки и минимально уменьшенное фракционное укорочение у трансгенных мышей MKK6bE (оба статистически незначимо) и значительно уменьшенную относительную толщину стенки и частичное укорочение у трансгенных мышей MKK3bE. по сравнению с контрольными однопометниками дикого типа.Следует отметить, что более крутой наклон движения эндокарда во время ранней диастолы указывает на повышенную скорость истончения стенок и расширения камеры ЛЖ у трансгенных мышей. AW, передняя стенка; IW, нижняя стенка; LVC, полость левого желудочка. ( Нижний ) Записи трансмитрального допплера показывают повышенную скорость и сокращенное время замедления раннего наполнения левого желудочка и уменьшенное время изоволюмической релаксации у трансгенных мышей, согласующихся с «рестриктивным» паттерном наполнения и нарушенной податливостью левого желудочка.

In vivo Эхокардиографический анализ трансгенных сердец

Дальнейшее понимание дифференциальных эффектов MKK3bE и MKK6bE на ремоделирование сердца было получено с помощью клеточной гистологии. Хотя ранее было показано, что экспрессия MKK3bE в кардиомиоцитах новорожденных индуцирует апоптоз, истончение стенки в сердце MKK3bE не было связано с усилением апоптоза, как было определено с помощью окрашивания опосредованной терминальной дезоксирибонуклеотидтрансферазой dUTP с меткой ник-конца (данные не показаны).Однако количественное исследование поперечных сечений сердца MKK3bE выявило заметную дисперсию площади поперечного сечения миоцитов, с большим количеством клеток при уменьшенном размере по сравнению с контролем и субпопуляцией увеличенных клеток (рис. 5). Это открытие предполагает наличие гетерогенной атрофии миоцитов и спорадической гипертрофии в сердце MKK3bE, которые могут способствовать истончению стенки камеры. Напротив, площади поперечного сечения миоцитов в сердцах MKK6bE были немного, но значительно больше, чем в контроле.Наличие клеточной гипертрофии в трансгенном сердце MKK6bE могло способствовать сохранению конечного систолического объема камеры.

Репрезентативные гематоксилин / эозиновые поперечные срезы LV из MKK3bE ( A ), MKK6bE ( B ) и контрольных сердец дикого типа ( C ). Площади поперечного сечения ( D ) отдельных миофиламентов соответствовали среднему значению ± стандартное отклонение для каждой группы, обозначенной вверху. *, n = 198; П <0.02 в сравнении с контролем; P <0,0001 по сравнению с MKK6bE. **, n = 102; P <0,001 по сравнению с контролем. ***, n = 100. Обратите внимание на размеры гетерогенных миоцитов филаментов как в срезе гематоксилин / эозин ( A ), так и при измерении площади ( D ) из сердца MKK3bE.

В отличие от ранних сообщений, которые документально подтверждали значительную экспрессию как изоформ p38 α, так и β в сердечной ткани (29, 30), только p38α был обнаружен на уровне белка в сердце мыши, тогда как p38β не обнаруживался ни на уровне белка, ни на уровне мРНК. (Рисунок.10, который публикуется в качестве вспомогательной информации). Следовательно, различие в сердечных фенотипах, наблюдаемое между трансгенными сердцами MKK3bE и MKK6bE, вряд ли связано с разной активностью в отношении изоформ p38α и β, а скорее связано с другими нижестоящими эффекторами.

Гемодинамическая оценка сердца, активированного p38.

Отношения давление-объем левого желудочка были получены для более прямого сопоставления дисфункции систолической и диастолической камер в трансгенных сердцах MKK3bE и MKK6bE (рис.6, таблица 3). Эти результаты подтвердили сходство, а также некоторые заметные различия между трансгенными мышами, экспрессирующими MKK3bE и MKK6bE, по сравнению с контрольными однопометными мышами. У обоих трансгенных людей наблюдалось значительно сниженный ударный объем (ширина петли), систолическое давление (высота петли) и сердечный выброс, заметно повышенное конечное диастолическое давление и более крутая кривая диастолического давления-объема (DPVR на рис. 6). Последний подтвердил пассивное диастолическое повышение жесткости, соответствующее ограничительному типу наполнения, выявленному с помощью допплеровского анализа.Анализ давления-объема независимо подтвердил значительные различия в объемах камер между двумя моделями, причем более высокие конечные систолические объемы наблюдались только в сердцах MKK3bE, а более низкие конечные диастолические объемы наблюдались только в сердцах MKK6bE. Это ремоделирование также было продемонстрировано с помощью V ₈₀ , конечного систолического объема при согласованном конечном систолическом давлении 80 мм рт. Ст. (Таблица 3). Хотя частота сердечных сокращений была несколько ниже у анестезированных трансгенных животных по сравнению с контрольной группой, обе мутантные группы имели схожие показатели, поэтому это наблюдение не могло объяснить различия между ними.Более того, эта небольшая разница в частоте не соответствовала заметному снижению сердечного выброса или фракции выброса. В дополнение к изменениям в геометрии камеры и диастолической жесткости, оба трансгенных сердца демонстрировали аналогичную глубокую систолическую депрессию, которая проявлялась в снижении пиковой скорости повышения давления на ≈40% (dP / dt _max ) и почти на 60%. в конечной систолической эластичности. В отличие от повышения жесткости диастолической камеры, постоянная времени релаксации изоволюмического давления (тау) не изменялась между контрольными и трансгенными животными.Однако dP / dt _мин , на которое также влияют разницы конечного систолического давления, было менее отрицательным в последних группах.

Типичные петли давление-объем во время базальной (толстая петля) и уменьшения предварительной нагрузки за счет окклюзии полой вены (тонкая петля). Сердца, экспрессирующие MKK3bE, демонстрировали сдвиг вправо отношения конечного систолического давления к объему, тогда как сердца, экспрессирующие MKK6bE, демонстрировали значительный сдвиг влево отношения диастолического давления к объему по сравнению с контрольными группами дикого типа.( Lower Right ) Воспроизведение диастолических отношений в увеличенном масштабе, демонстрирующее заметное увеличение пассивной жесткости камеры, измеренной у мутантов, экспрессирующих MKK. Этот пример взят от животного MKK6bE, но очень похожая жесткость была измерена у мышей MKK3bE.

Гемодинамическое измерение трансгенных мышей и контрольных животных

Отрицательные инотропные эффекты активации p38 в изолированных миоцитах.

Чтобы напрямую оценить и сравнить функциональные эффекты различных активаторов p38 выше по течению на сократимость миоцитов, взрослые миоциты были выделены из сердец крыс и инфицированы аденовирусами, экспрессирующими MKK3bE, MKK6bE или маркерный ген lacZ в качестве контроля, и было изучено укорочение клеток 24 ч. позже. Специфическая активация активности киназы p38 MAP была достигнута посредством опосредованной аденовирусом экспрессии трансгена в культивируемых миоцитах (фиг.11, которая опубликована в качестве подтверждающей информации) и привела к глубокой систолической депрессии, проявляющейся в уменьшении укорочения клеток как в клетках, экспрессирующих MKK3bE, так и MKK6bE ( 44% и 62% относительно необработанного контроля, 50% и 71% относительно клеток, инфицированных Adv-lacZ, соответственно, таблица 4).Скорость укорочения и повторного удлинения также снизилась, что согласуется с уменьшением величины укорочения. В соответствии с наблюдениями in vivo, (таблица 3), как MKK3bE-, так и MKK6bE-инфицированные клетки демонстрировали одинаковую степень систолической депрессии.

Сократимость изолированных взрослых миоцитов через 24 ч после трансфекции аденовирусом

Обсуждение

Мы создали трансгенных животных с направленной активацией киназ p38 MAP в желудочковых миоцитах с использованием подхода с переключением генов на основе cre / loxP для экспрессии двух активированных мутантов вышестоящих киназ для p38, MKK3bE и MKK6bE.В этой статье мы показываем, что специфическая для желудочков экспрессия белков MKK3bE и MKK6bE индуцирует активность киназы p38 MAP в трансгенных сердцах, что приводит к тяжелым фенотипам кардиомиопатии со следующими общими чертами: ( i ) индукция экспрессии генов гипертрофических маркеров и интерстициальный фиброз ; ( ii ) глубокое снижение систолической сократимости; и ( iii ) нарушенная диастолическая функция с повышенной жесткостью камеры и ограниченным наполнением.Однако мы также выявили существенные киназ-специфические различия в ремоделировании камер — с конечным систолическим расширением, истончением стенки и атрофией миоцитов, наблюдаемыми только в сердце, экспрессирующем MKK3bE. Эта комбинация поразительна, поскольку она похожа на наблюдаемую на более поздних стадиях декомпенсации / ремоделирования в хронически перегруженных желудочках. Мы продемонстрировали, что специфический сигнальный путь, связанный с перегрузкой, избирательно генерирует этот фенотип. Напротив, сердца, экспрессирующие MKK6bE, имели уменьшенный объем камеры, сопровождаемый умеренным увеличением площади поперечного сечения миоцитов, и, таким образом, имели почти нормальное конечное систолическое напряжение стенки по сравнению с контролем дикого типа и сердцами MKK3bE.Следовательно, в дополнение к предоставлению in vivo доказательств существенной роли киназ p38 MAP в развитии как систолической, так и диастолической сердечной недостаточности, настоящее исследование идентифицирует специфические для активаторов эффекты ремоделирования, касающиеся пути p38.

При устойчивых гемодинамических стрессах, таких как перегрузка давлением или ишемия / реперфузионное повреждение, длительная активация p38 может существенно способствовать снижению систолической функции и усугублять общие сердечно-сосудистые ограничения, ускоряя прогрессирование до явной недостаточности.Хотя лежащие в основе клеточные и молекулярные механизмы еще предстоит определить, несколько линий доказательств предполагают участие чувствительности миофиламентов к кальцию, а не самоуправление кальцием. Например, мы обнаружили, что специфическое ингибирование активности p38 в культивируемых кардиомиоцитах взрослых стимулирует сократительную способность за счет увеличения внутриклеточного pH, не влияя на переходные процессы кальция или кальциевые токи в мембране (P.L., S. Wang, Y.W. и R.-P.X., неопубликованная работа). В интактном сердце неизменный тау-белок как в сердце MKK3bE, так и в MKK6bE подтверждает мнение о том, что потребление кальция во время диастолы не изменилось, несмотря на замечательную жесткость миокарда.Потребуются дальнейшие исследования для определения молекулярных мишеней p38 в кардиомиоцитах, которые опосредуют наблюдаемый отрицательный инотропный эффект.

Хотя точная нижестоящая передача сигналов для MKK3b по сравнению с MKK6b в кардиомиоцитах остается неясной, предыдущие исследования выявили различия в спектре активации для изоформ p38, а также различные роли в других клеточных функциях, независимых от p38 (12, 31, 32). Наши данные показали, что p38α является преобладающей изоформой, экспрессируемой в сердцах взрослых мышей, тогда как p38β не обнаруживается ни на уровне белка, ни на уровне мРНК.На основании этого и наших клеточных исследований, упомянутых ранее, p38α и его последующие сигнальные события могут играть важную роль в развитии общих особенностей кардиомиопатии в трансгенных сердцах MKK3bE и MKK6bE, включая потерю сократимости, жесткость миокарда и изменения профиля экспрессии генов. С другой стороны, различные формы ремоделирования сердца в сердцах MKK3bE и MKK6bE могут быть опосредованы различными нижестоящими эффекторами, отличными от p38, как сообщалось в предыдущем исследовании (13).Активация MKK6b может быть особенно важной для предотвращения атрофии миоцитов, достижения меньшего размера полости и, таким образом, поддержания более нормального или даже сниженного систолического стресса миокарда. Это предположение согласуется с данными, ранее полученными на миоцитах новорожденных, показывающими, что гипертрофия и выживаемость преимущественно опосредуются через MKK6bE вместо MKK3bE (7). Хотя наблюдалась тенденция к тому, что MKK3bE имел более сильный отрицательный инотропный эффект, чем MKK6bE, на изолированные миоциты (таблица 4), разница была умеренной и статистически незначимой и, скорее всего, не могла объяснить резкую разницу в ремоделировании камер, наблюдаемую в интактных сердцах.Хотя мы не нашли доказательств апоптоза у животных MKK3bE, истончение стенки камеры и относительное расширение были связаны с гетерогенным уменьшением площади поперечного сечения миоцитов, что позволяет предположить, что MKK3bE индуцировал пятнистую атрофию миоцитов в сердце, что часто наблюдается в сердцах людей с конечной стадией сердечной недостаточности. . Следовательно, фенотип MKK6bE больше согласуется с более ранними фазами индуцированной нагрузкой сердечной дисфункции, то есть меньшим размером камеры, сохраненным конечным систолическим напряжением стенки, тогда как фенотип MKK3bE более характерен для более поздней стадии декомпенсации.Такая корреляция предполагает, что избирательная активация путей, связанных с p38, действительно может играть важную роль в этом переходе от компенсированного состояния к декомпенсированной сердечной недостаточности.

Трансгенные подходы задействовали различные сигнальные пути в развитии сердечной гипертрофии и сердечной недостаточности, включая G-белки, такие как Gs (33), Ras (19), RhoA (34) и Gq (20), протеинкиназы ( 35) и фосфатазы (27, 36) и цитокины (37). У трансгенных животных с активированными внеклеточными сигнально-регулируемыми киназными (ERK) путями, индуцированными либо Ras (19), либо MAP-киназной киназой (MEK) (38), в трансгенных сердцах развивалась массивная гипертрофия сердца.Напротив, активация p38 в трансгенных сердцах привела к минимальному изменению массы LV, что позволяет предположить, что передача сигналов киназы p38 MAP in vivo недостаточна для индукции гипертрофии, в отличие от наших собственных и других более ранних отчетов in vitro , основанных на исследованиях в кардиомиоциты новорожденных (7, 10). Основываясь на этом спектре из фенотипов in vivo, мы можем предположить, что путь Raf-MEK-ERK семейства киназ MAP может играть важную роль в инициации гипертрофии на компенсаторных стадиях процесса сердечного заболевания, тогда как пути p38 может способствовать потере сократительной способности и ремоделированию камеры на переходных стадиях сердечной недостаточности.Потребуются дальнейшие исследования для оценки эффективности ингибирования активности p38 в качестве потенциального терапевтического подхода для сохранения сократительной способности и предотвращения патологического ремоделирования в больном сердце.

Благодарности

Мы благодарим д-ра Бин Ву (Мэрилендский университет), г-жу Джули Шеридан и г-жу Джанель Стрикер (Калифорнийский университет, Сан-Диего) за техническую помощь и полезное обсуждение с доктором Дж. Ханом (Исследовательский институт Скриппса) и Д-р Джоан Хеллер Браун (Калифорнийский университет, Сан-Диего).Эта работа была частично поддержана грантами Национальной службы общественного здравоохранения HL61505–01 (для KC), HL59408 (для DAK и DG), HL61505–01 и HL62311–01 (для YW), а также внутренним грантом Школы Университета Мэриленда. Медицина (к Ю.В.).

Сноски

• ↵ † P.L. и Д. внес равный вклад в эту работу.

• ↵ ‡‡ Кому следует обращаться с запросами на перепечатку. Электронная почта: ywang001 {at} umaryland.edu.

• Этот документ был отправлен напрямую (Трек II) в офис PNAS.

Сокращения

MAP,

митоген-активированный белок;

HA,

гемагглютинин;

GFP,

зеленый флуоресцентный белок;

LV,

левый желудочек;

MHC,

тяжелая цепь миозина

• Получено 21 февраля 2001 г.

• Авторские права © 2001, Национальная академия наук

Range Rover P38 Выключатель заднего противотуманного света Запчасти и аксессуары для автомобилей Другие автомобильные запчасти

Range Rover P38 Выключатель заднего противотуманного света

Range Rover P38 Выключатель заднего противотуманного света, P38 Выключатель заднего противотуманного света Range Rover, номер детали Land Rover AMR 3712, Полностью работает после снятия, Сравните самые низкие цены Хороший продукт в Интернете С нашей 100% гарантией соответствия.Range Rover P38 Выключатель заднего противотуманного света partyinljubljana.com.

Range Rover P38 Выключатель заднего противотуманного света

Купите женскую летнюю повседневную футболку с короткими рукавами для малышей-щенков-обезьянок. Креативная футболка с 3D-принтом в стиле хипстер и другие футболки в магазине. Эта практичная спортивная футболка с технологией впитывания влаги. Купите 14k Madi K CZ Children’s Christmas Tree Dangle Post Earrings и других гвоздиках в. Изготовлен из лучших материалов известных производителей: стали Toyota Tsusho и NKK Japan.Прецизионные шарикоподшипниковые колеса обеспечивают большую надежность, Range Rover P38 Выключатель заднего противотуманного света , Существует 5 размеров, и размеры, которые мы просверливаем, зависят от веса шара. всего пара небольших изменений, СДЕЛАНО В США: Наши виниловые наклейки изготавливаются и печатаются в нашей лаборатории в Тампе. Просто снимите спину и приклейте. Оригинальные аксессуары Nissan 999C2-8X004 Многоразовая сумка для вторичной переработки: одежда, Range Rover P38 Выключатель заднего противотуманного света , Купить французскую шляпу без полей Мужская Vogue Ретро Кепка с черепом Docker Sailor Cap Байкерская шапка Sun Hat Vintage Unisex Harajuku Black: покупайте лучшие модные бренды Skullies & Beanies при ✓ БЕСПЛАТНОЙ ДОСТАВКЕ и возврате соответствующих покупок.СТЕРЛИНГ СЕРЕБРО 925; Серебро 925 пробы, оригинальные детали — это точная деталь от производителя оригинального оборудования (OEM), с которой был поставлен ваш автомобиль, от производителя Гайки крышки оси предлагают легкую установку для постоянного применения, мы завершаем ее полированной металлической крышкой, которая утяжеляется для устойчивости и включает в себя нескользящее дно из силиконовой резины, Range Rover P38 Выключатель заднего противотуманного света , отпустите руки и позвольте свободе быть рядом с вами. мы вернем вам деньги или отправим вам новый.Прекрасная сумка, полная индивидуальности. Используемый материал для вышивки гуджарати -. Древний елизаветинский стиль, дизайн Tudor Rose, Range Rover P38 Выключатель заднего противотуманного света , sobre bracelet en cuir noir français, Наше пеленальное одеяло — идеальный подарок для новоприбывшего (или одеяло для малышей. Сделано из одного из соборов Дарема. PEACE PIPES от Massa — это не только прекрасное произведение искусства из дерева.