Лада х раф: габаритные размеры, вес, двигатель, клиренс, расход топлива

Содержание

РСКГ | LADA Vesta 1.6T SP

Шины сухие: Yokohama Advan A005 240/610-R17
Шины дождевые: Yokohama Aavan A006 240/610-R17

Рабочий объем двигателя

1600 куб.см

Мощность

255 л.с

Шасси

Ohlins

Масса

1220 кг

Тормозная система

AP Racing

Длина

4410

Ширина

1820

Пилоты

Ранее участвовали

Команда:

Стартовый номер:

10

Класс:

Супер-продакшн

Команда:

Личный зачет

Стартовый номер:

45

Класс:

Супер-продакшн

Команда:

Стартовый номер:

50

Класс:

Супер-продакшн

Описание

ДВИГАТЕЛЬ
- Базовый - ВАЗ-21129
- 4-х цилиндровый 16-клапанный с турбонадувом
- Рабочий объем - 1597 см3
- Максимальная мощность - 255 л. с при 5500 об\мин
- Максимальный крутящий момент - 340 Нм при 4400об\мин
- Максимальные обороты - 7000 об\мин 
- Топливо - бензин А-100

- Турбонагнетатель GARRETT
- Рестриктор согласно технического регламента, диаметр 32мм 

ТРАНСМИССИЯ
- Сцепление однодисковое металлокерамическое с гидроприводом
- КПП 6-ти ступенчатая кулачковая с последовательным переключением
- Дифференциал повышенного трения
- Привод колес с валами равной длины и с промопорой
- Рулевое управление реечного типа с гидроусилителем

ПОДВЕСКА
- Передняя типа McPherson
- Подрамник усиленный LADA VESTA
- Рычаги сварные из стальной трубы с ШС и регулировкой геометрии
- Стабилизатор регулируемый
- Амортизаторная стойка на газонаполненных амортизаторах с изменяемой характеристикой
- Задняя на полузависимой балке модели LADA VESTA
- Стабилизатор регулируемый
- Амортизаторы газонаполненные с изменяемой характеристикой
- Тормозная система 2-х контурного типа с напольными педалями

ТОРМОЗНАЯ СИСТЕМА
- Тормоз передних колес: суппорт 4-х поршневой  AP RACING, диски вентилируемые диаметром 330 мм
- Тормоз задних колес: суппорты 2-х поршневые AP RACING, диски диаметром 278мм
- Регулятор тормозных усилий в контуре задних колес

- Ручной тормоз с гидроприводом
- Колеса 9J-R17 из алюминиевого сплава
- Шины 240\610-17

КУЗОВ
- Облегченный в соответствии с техническими требованиями
- Каркас безопасности вварного типа имеет омологацию РАФ
- Аэродинамический комплект с анти крылом задней оси.

383424036R8200884113 Сальник ЛАДА X-Ray КПП комплект 2шт. БАЛАКОВОЗАПЧАСТЬ - 383424036R/8200884113 14806 383424036R

383424036R8200884113 Сальник ЛАДА X-Ray КПП комплект 2шт. БАЛАКОВОЗАПЧАСТЬ - 383424036R/8200884113 14806 383424036R - фото, цена, описание, применимость. Купить в интернет-магазине AvtoAll.Ru Распечатать

9

1

Применяется: ВАЗ

Артикул: 383424036R/8200884113еще, артикулы доп.: 14806, 383424036Rскрыть

Код для заказа: 803384

Есть в наличии Доступно для заказа
- 9 шт.Сейчас в 8 магазинах - >10 шт.Цены в магазинах могут отличатьсяДанные обновлены: 11.05.2021 в 06:30 Доставка на таксиДоставка курьером - 300 ₽

Сможем доставить: Завтра (к 12 Мая)

Доставка курьером ПЭК - EasyWay - 300 ₽

Сможем доставить: Сегодня (к 11 Мая)

Пункты самовывоза СДЭК Пункты самовывоза Boxberry Постаматы PickPoint Магазины-салоны Евросеть и Связной Терминалы ТК ПЭК - EasyWay Самовывоз со склада интернет-магазина на Кетчерской - бесплатно

Возможен: сегодня c 10:00

Самовывоз со склада интернет-магазина в Люберцах (Красная Горка) - бесплатно

Возможен: сегодня c 17:00

Самовывоз со склада интернет-магазина в поселке Октябрьский - бесплатно

Возможен: сегодня c 17:00

Самовывоз со склада интернет-магазина в Сабурово - бесплатно

Возможен: сегодня c 19:00

Самовывоз со склада интернет-магазина на Братиславской - бесплатно

Возможен: сегодня c 17:00

Самовывоз со склада интернет-магазина в Перово - бесплатно

Возможен: сегодня c 17:00

Самовывоз со склада интернет-магазина в Кожухово - бесплатно

Возможен: завтра c 11:00

Самовывоз со склада интернет-магазина в Вешняков - бесплатно

Возможен: завтра c 11:00

Самовывоз со склада интернет-магазина из МКАД 6км (внутр) - бесплатно

Возможен: завтра c 11:00

Самовывоз со склада интернет-магазина в Подольске - бесплатно

Возможен: завтра c 11:00

Код для заказа 803384 Артикулы 383424036R/8200884113, 14806, 383424036R Производитель БАЛАКОВОЗАПЧАСТЬ Каталожная группа: . .Коробка передач
Трансмиссия
Ширина, м: 0.06
Высота, м: 0.03 Длина, м: 0.06 Вес, кг: 0.04

Отзывы о товаре

Где применяется

Обзоры

Наличие товара на складах и в магазинах, а также цена товара указана на 11. 05.2021 06:30.

Цены и наличие товара во всех магазинах и складах обновляются 1 раз в час. При достаточном количестве товара в нужном вам магазине вы можете купить его без предзаказа.

Интернет-цена - действительна при заказе на сайте или через оператора call-центра по телефону 8-800-600-69-66. При условии достаточного количества товара в момент заказа.

Цена в магазинах - розничная цена товара в торговых залах магазинов без предварительного заказа.

Срок перемещения товара с удаленного склада на склад интернет-магазина.

Представленные данные о запчастях на этой странице несут исключительно информационный характер.

cc0f1e316a488565c4768201f4103531

Добавление в корзину

Доступно для заказа:

Кратность для заказа:

Добавить

Отменить

Товар успешно добавлен в корзину

!

В вашей корзине на сумму

Закрыть

Оформить заказ

Технические характеристики / LADA Granta Cup / Для кольцевых гонок / Автомобили / TMS Motorsport

Общая информация

Модель гоночного а/м219000-027-01
Модель базового а/м219000-020-00
НазначениеАвтомобильные кольцевые гонки
Зачетная группа«Супер-продакшн»
ОмологацияRAF A 1101
Тип кузоваседан
Число мест1
Снаряженная масса (кг)1030
Полная с пилотом (кг)Min - 1050, max - 1195

Модель гоночного а/м: 219000-027-01

Модель базового а/м: 219000-020-00

Назначение: Автомобильные кольцевые гонки

Зачетная группа: «Супер-продакшн»

Омологация: RAF A 1101

Тип кузова: седан

Снаряженная масса (кг): 1030

Полная с пилотом (кг): Min - 1050, max - 1195

Габаритные размеры

Длина, мм4275
Ширина, мм1810
Ширина над передней осью1810
База, мм2555

Ширина над передней осью: 1810

Двигатель

Модель двигателя211262-045-01
Базовый ДВС21126-081
Рабочий объём1,6 л (1597 см2), рядный, 4 цилиндра
Диаметр цилиндра, мм82. 0 мм
Ход поршня, мм75.6 мм
Степень сжатия9,1
Мощность247 лс. при 5700 об/мин.
Максимальный крутящий момент310 н.м. при 5500-6200 об/мин.
Максимальные обороты7000 об/мин.
Топливос октановым числом не менее 100

Модель двигателя: 211262-045-01

Базовый ДВС: 21126-081

Рабочий объём: 1,6 л (1597 см2), рядный, 4 цилиндра

Диаметр цилиндра, мм: 82.0 мм

Ход поршня, мм: 75.6 мм

Степень сжатия: 9,1

Мощность: 247 лс. при 5700 об/мин.

Максимальный крутящий момент: 310 н.м. при 5500-6200 об/мин.

Максимальные обороты: 7000 об/мин.

Топливо: с октановым числом не менее 100

Конструктивные особенности

Поршенькованый из алюминиевого сплава
Шатунстальной L=128,6 мм, мин. Н-образный
Контроллер управления ДВСуправления ДВС - «Корвет» производства АБИТ
Впускной коллекторTMS
Система охлажденияИнтеркуллер
Насос масляныйувеличенной производительности
Картер масляныйстальной сварной
Шестерни насосастальной
Воздушный фильтрнулевого сопротивления
Опоры двигателяжесткие
Топливный бакоригинальный

Поршень: кованый из алюминиевого сплава

Шатун: стальной L=128,6 мм, мин. Н-образный

Контроллер управления ДВС: управления ДВС - «Корвет» производства АБИТ

Впускной коллектор: TMS

Система охлаждения: Интеркуллер

Насос масляный: увеличенной производительности

Картер масляный: стальной сварной

Шестерни насоса: стальной

Воздушный фильтр: нулевого сопротивления

Опоры двигателя: жесткие

Топливный бак: оригинальный

Трансмиссия

КПП7796
Передаточные числаДанные приведены в таблице на фото
Сцеплениеоднодисковое металлокерамическое диаметра 184 мм
Привод переключениясеквентальный с системой Power Shift*
Приводы колесс промежуточным валом и опорой
Дифференциалсамоблокирующийся

Передаточные числа: Данные приведены в таблице на фото

Сцепление: однодисковое металлокерамическое диаметра 184 мм

Привод переключения: секвентальный с системой Power Shift*

Приводы колес: с промежуточным валом и опорой

Дифференциал: самоблокирующийся

Рулевое управление

Рулевое управлениес гидроусилителем

Рулевое управление: с гидроусилителем

Тормозная система

Тормозная системаДвухконтурная без системы АБС
Передний тормоздиск Ø 330х28 мм. вентилируемый плавающий с алюминиевой ступицей, суппорт 4-х поршневой AP
Задний тормоздиск Ø 260х9,5 мм., суппорт 2-х поршневой AP
Регулятор тормозных усилийAP Racing

Тормозная система: Двухконтурная без системы АБС

Передний тормоз: диск Ø 330х28 мм. вентилируемый плавающий с алюминиевой ступицей, суппорт 4-х поршневой AP

Задний тормоз: диск Ø 260х9,5 мм., суппорт 2-х поршневой AP

Регулятор тормозных усилий: AP Racing

Подвеска

Подрамниксварной усиленный
Рычаги передней подвескисварные с регулировкой развала/схождения
Кулаки передней подвескиоригинальные
Ступица передних колесстальная 4 шпилек на Ø98 мм
Рычаги задней подвескис упругой поперечиной с регулировкой развала/схождения
Стабилизаторыоригинальные регулируемые
Амортизаторыс регулировкой усилия; по 2-м скоростям сжатия; по 1-ой скорости отбоя
Пружинысоставные с подпружинником

Подрамник: сварной усиленный

Рычаги передней подвески: сварные с регулировкой развала/схождения

Кулаки передней подвески: оригинальные

Ступица передних колес: стальная 4 шпилек на Ø98 мм

Рычаги задней подвески: с упругой поперечиной с регулировкой развала/схождения

Стабилизаторы: оригинальные регулируемые

Амортизаторы: с регулировкой усилия; по 2-м скоростям сжатия; по 1-ой скорости отбоя

Пружины: составные с подпружинником

Колеса

Колеса9,0 – 17” кованые из алюминиевого сплава РСD 98 мм. ; ЕТ 22 мм
Шины245-610-17 типа Слик

Колеса: 9,0 – 17” кованые из алюминиевого сплава РСD 98 мм.; ЕТ 22 мм

Шины: 245-610-17 типа Слик

Кузов

Каркас безопасностивварной из труб стальных 30ХГСА
ОмологацияRAF
Вес48 кг

Каркас безопасности: вварной из труб стальных 30ХГСА

Омологация: RAF

Специальное оборудование

Сиденья омологированные+
Ремни безопасности 6-ти точечные+
Опоры сидений металлические омологированные+
Дополнительные замки капота+
Система пожаротушения+
Травмобезопасные накладки на каркас+
Флокированная панель приборов+ (опционное предложение)
Защитная сетка на окно водителя+
Люк в крышу+
Поликарбонат вместо стекол+
Приборная панель AIM+

Сиденья омологированные: +

Ремни безопасности 6-ти точечные: +

Опоры сидений металлические омологированные: +

Дополнительные замки капота: +

Система пожаротушения: +

Травмобезопасные накладки на каркас: +

Флокированная панель приборов: + (опционное предложение)

Защитная сетка на окно водителя: +

Поликарбонат вместо стекол: +

Приборная панель AIM: +

универсальные наборы инструментов, автоинструмент, набор инструментов для автомобиля, инструменты для автосервиса, ombra

JONNESWAY - официальный партнер Кубка LADA по ралли

В этом году инструмент ТМ JONNESWAY стал официальным техническим партнером Кубка Лада по ралли (LADARALLYCUP). Кубок проходит в СЗФО в рамках этапов Чемпионата России по классическому ралли под эгидой главного спонсора -  Роснефти и поддерживается Автовазом. Организатором выступает питерский Автосалон Лада – Интей. Всего в этом году планируется участие 15 экипажей: «заводские» Лада Калина NFR. http://lada-rally.ru/partners/

«19-20 мая на территории Островского, Пушкиногорского, Новоржевского, Опочецкого, Бежаницкого районов Псковской области прошел третий этап Чемпионата. Гонка стартовала на биатлонной базе «Юность» в Островском районе. На стадионе собралось более тысячи зрителей. С приветственным словом выступили председатель государственного комитета Псковской области по физической культуре и спорту Иван Штылин, глава Островского района Дмитрий Быстров, председатель комитета ралли Российской Автомобильной Федерации Игорь Сухов, генеральный директор акционерного общества «Псковнефтепродукт» Юрий Малешин, президент Федерации автомобильного спорта Псковской области Олег Мыслевич. Дмитрий Быстров лично проверил трассу первого скоростного участка в штурманском кресле автомобиля безопасности раллийной команды "Скобари".

Первый гоночный день состоял из шести скоростных участков. Два экипажа попали в аварии, в результате которых Алексей Звонкин серьёзно разбил свой ВАЗ2106, а Сергей Попов списал Митсубиси EVO X. Во второй день по системе «Супер-ралли» вернулись в гонку четыре экипажа из числа сошедших в субботу. 

На «Пушкинских Горах-2018» впервые применялась электронная система безопасности и слежения. С её помощью на восьмом скоростном участке экипаж Максима Белюкова подал сигнал SOS, сообщив об инциденте в котором пострадал аккредитованный на ралли фотограф. До финиша гонки добралось 35 машин.» Использован материал с сайта http://www.raf.su/news/2797-ralli-pushkinskie-gory-2018-vyigrali-aleksandr-osipov-i-aleksandr-andreev

Победители всех этапов Кубка получают инструмент ТМ  JONNESWAY. По итогам сезона экипаж, занявший 3 место, получит укомплектованную инструментальную тележку Jonnesway.

 

 

Премьера Башкирской оперы отправит зрителя во времена испанского маньеризма

Оперный раритет

Меломаны с нетерпением ждут премьерные показы по нескольким причинам. Во-первых, новая постановка станет режиссерским дебютом народного артиста Башкирии Аскара Абдразакова, который вслед за младшим братом Ильдаром Абдразаковым, пару лет назад поставившим в родной Уфе оперу "Аттила" Джузеппе Верди, тоже решил расширить свой творческий потенциал и представить собственную постановку. Во-вторых, спектакля, который нынешний худрук Башоперы выбрал для своего нового амплуа, никогда не было в репертуаре театра. Опера Массне вообще редкость - музыкальные театры почему-то не горят желанием ставить спектакли о Рыцаре печального образа, хотя это, без сомнения, шедевр французского классика.

- Можно сказать, "Дон Кихот" - это самый настоящий оперный раритет, - считает режиссёр-постановщик, который, кстати говоря, сам будет исполнять в постановке титульную партию.

Тем более что она ему прекрасна знакома: башкирский бас с успехом поёт её в постановке одного из главных театров страны - в Мариинском и называет одной из самых любимых в своём репертуаре.

- Это будет классическая постановка, над которой мы работали с дирижёром-постановщиком Артёмом Макаровым и художником-постановщиком Иваном Складчиковым. - рассказал Аскар Абдразаков. - Опера включает в себя полную гамму чувств: здесь и романтизм, и любовь, и страсть, и страдания. Мы постараемся рассказать обо всём этом языком оперы. Надеюсь, получится очень красивый спектакль, который мы хотели бы в дальнейшем возить по стране и по миру - нам есть, что показать.

Как признаётся новоявленный режиссёр, он мечтал попробовать себя в качестве постановщика именно этой оперы и давно расписал для себя всю партию. Стоит отметить, что из пяти актов оперы три практически полностью составляют дуэты Дон Кихота и Санчо Пансы, ведь это произведение создавалось композитором специально для великого русского баса Фёдора Шаляпина и фактически является бенефисом исполнителя титульный партии.

Мировая премьера "Дон Кихота" состоялась в 1910 году в Опере Монте-Карло, где на днях Ильдар Абдразаков спел в премьерной постановке оперы "Борис Годунов" Мусоргского. Партии Дон Кихота в репертуаре брата постановщика пока нет, так что насладиться пением обоих знаменитых башкирских басов, как это было в случае с "Аттилой", в этот раз не получится. Постановку Мариинского театра, в которой поёт худрук Башоперы, осуществил известный европейский режиссёр и сценограф, грек, живущий в Париже Яннис Коккос.

Художник-постановщик уфимского "Дон Кихота" Иван Складчиков признаётся, что питерскую постановку видел, но лично на него она не произвела должного впечатления - с точки зрения сценографии и костюмов. Для уфимской версии "Дон Кихота", которая станет уже его четвёртым проектом для Башоперы после "Аттилы" и балетов "Конёк-Горбунок", "Соседи. 1418", Складчиков создал более полутора тысяч эскизов, которые, кстати, пользуются успехом у коллекционеров и уже все обрели хозяев, отправившись в частные коллекции Парижа и Вены. Без сомнения, нашлись бы и желающие приобрести и сами костюмы - они по-настоящему впечатляют.

Эстетизм повествования

- Все костюмы для оперы сшиты вручную в стиле испанского маньеризма - и большая часть из них имеет исторический крой, - говорит Иван Складчиков, который, как выяснилось, провёл немало времени в музеях Испании, изучая одежду современников героев оперы. - В женских платьях - жёсткие лифы на костях, без вытачек, юбки на панье. Как в мужских, так и женских костюмах использованы воротники раф, характерные для той эпохи. На каждый из них уходит порядка пятнадцати метров кружев. Использовано гигантское количество натуральных тканей - жаккард, шёлк, атлас, крепдешин, тафта. Километры золотой и серебряной тесьмы, огромное количество кристаллов Сваровски, стекляруса и пайеток - всё это необходимо, чтобы соответствовать духу эпохи.   

Тем не менее художник не копирует исторические костюмы, а создаёт собственные.

- Если делать строго аутентичные костюмы той эпохи, они могут быть не так выразительны, - поясняет Иван. - Поэтому приходится идти на разные ухищрения, чтобы сделать их более яркими: например, дополнять какими-то деталями из другой эпохи, но так, чтобы у зрителя, конечно, не возникал временной диссонанс.

Как выяснилось, самый скромный костюм будет как раз у главного героя: Дон Кихот практически весь спектакль проведёт в одном образе. А вот его дама сердца, прекрасная Дульсинея, будет трижды менять наряды, как и весь хор, в котором 75 человек! Кстати, в опере Дульсинея - не служанка, как в романе Сервантеса, а богатая куртизанка и наряды у неё соответствующие. Персонажей здесь вообще в несколько раз больше, чем в том же "Аттиле". В "Дон Кихоте" много массовых сцен, где кроме хористов заняты ещё и танцовщики. Но не стоит забывать, что работа художника-постановщика - это далеко не только костюмы, он полностью создаёт мир героев - от мебели до посуды.  

- Если дирижёр и режиссёр отвечают за музыкальную и визуальную составляющую спектакля, то художник несёт на себе нагрузку эстетизма повествования, - говорит Иван.

Складчиков не раз подчёркивал, что современные постановки, где исторические герои носят джинсы и кроссовки, ему просто неинтересны.  

- Мне очень повезло, что в Башкирском театре оперы и балета, куда меня пригласил работать Аскар Абдразаков, есть собственные цеха - и они лучшие в России. Люди, которые тут работают, способны выполнить любую, даже самую сложную работу, - уверен Иван Складчиков. - Сейчас это огромная редкость. Здесь шьют лучше, чем во многих театрах Москвы, Петербурга и Вены. Большую роль сыграл и тот факт, что основу репертуара театра составляют балетные спектакли Юрия Григоровича, оформленные художником Симоном Вирсаладзе, которого я считаю своим крёстным отцом, так что мы, можно сказать, говорим на одном языке.

Сейчас подготовка к премьере выходит на финальную стадию: костюмы для "Дон Кихота" шили в течение семи месяцев, хотя в среднем хватает пяти. Любопытно, что главный герой примерит свои доспехи в самую последнюю очередь. Всего от замысла до сценического воплощения прошло около года: только на создание эскизов сценографии и костюмов художнику-постановщику потребовалось четыре месяца. Свои корректировки в график внёс и пресловутый коронавирус - из-за заболевших работников цехам пришлось уйти на карантин, да и сам Иван Складчиков успел переболеть и на некоторое время выпал из процесса. Накануне премьеры в театре планируют устроить дефиле - показать костюмы, как это было перед премьерой "Аттилы", а небольшую часть высокой театральной моды уже успела оценить публика на прошедшем в минувшие выходные фестивале "Фактор Востока".

Klassiker (Швеция): «Спорт-900» — спортивный автомобиль из Советского Союза | Общество | ИноСМИ

Если верить советской пропаганде, рабочим жилось прекрасно и у них было все необходимое. В действительности же все было не так радужно. Многое было в дефиците — например, автомобили. А спортивных автомобилей и вовсе не существовало.

В Советском Союзе большинство товаров разрабатывались в разных бюро. Организация, в чьи задачи входила разработка транспортных средств, которые, по мнению государства, могли пригодиться советскому гражданину, называлась Научно-исследовательский автомобильный и автомоторный институт.

Для простоты ее обычно обозначали НАМИ.

В 1960-е годы там работала небольшая группа инженеров, которая неспешно создавала мертворожденные прототипы разных машин. Квадратные такси, квадратные автомобили-амфибии для военных, квадратные маленькие легковушки, которые никогда не будут построены.

Auto Motor & Sport

И вот в 1963 году кто-то из сотрудников начал набрасывать проект спортивного автомобиля — полностью втайне. Ведь никаких спортивных автомобилей в текущем пятилетнем плане, одобренном свыше, не было, и едва ли для них нашлось бы место и в следующем.

По задумке, автомобиль не должен был иметь какую-то невероятную конструкцию — предполагалось, что это будет простая двухместная машина для обычных людей. К тому же материалов для работы было не слишком много, поэтому инженеры отталкивались от конструкции «Запорожца» — модели ЗАЗ-965. На Западе эту машину знают под именем «Ялта».

Это означало, что у автомобиля будет V-образный четырёхцилиндровый карбюраторный двигатель с воздушным охлаждением мощностью в 30 лошадиных сил. Вокруг него располагалась трубчатая рама, а кузов должны были отлить из стеклопластика.

А вот дизайн оказался ни на что не похож. Хотя, возможно, сзади и можно было различить некоторые черты автомобилей Ghia Supersonic 1950-х годов, но их слегка напоминают и модели, которые Moretti и Fissore в то время выставляли на автомобильных салонах в Италии.

Автомобилю дали имя: «Спорт-900».

Теперь его нужно было где-то производить. Проект вышел за пределы НАМИ, и держать его в секрете стало сложно.

Кузьма Дурнов, директор завода, который производил детали для автомобильной промышленности, стал своего рода защитником «Спорта-900». Вот почему эти автомобили начали называть КД «Спорт-900».

Klassiker
Klassiker

Вскоре история просочилась в прессу. Единственный советский спортивный автомобиль показали общественности и дали понять, что на эту модель есть спрос.

Был ли на самом деле спрос или нет, неизвестно, но массово производить «Спорт-900» так и не начали. В общей сложности за несколько лет вручную собрали всего шесть автомобилей.

Когда о проекте услышало верховное руководство СССР, его решительно пресекли. Народу не нужно никаких спортивных автомобилей, так что ничего такого в стране быть не должно, и точка!

Но «Спорт-900» было не так просто уничтожить. Сегодня, похоже, как минимум четыре из шести экземпляров по-прежнему целы. Правда, все они в очень плохом состоянии.

Когда же мы увидим первый отремонтированный советский спортивный автомобиль?

Материалы ИноСМИ содержат оценки исключительно зарубежных СМИ и не отражают позицию редакции ИноСМИ.

Присоединяйтесь к нам в Facebook и будьте в курсе важнейших событий дня.

Измерения FRET одной молекулы внутри клетки выявляют три изменения конформационного состояния в белке RAF.

Основные моменты

Одномолекулярные FRET цитозольного CRAF были успешно измерены в живых клетках.

CRAF имеет как минимум три конформации: закрытую, открытую и полностью открытую.

Стимуляция EGF соответствует небольшой фракции CRAF дикого типа полностью открытой форме.

S612A мутант CRAF принимает полностью открытую структуру.

Обнаружены переходы состояний между закрытой и открытой конформациями.

Реферат

Предпосылки

Структуры белков тесно связаны с их функциями. Значительные усилия были направлены на структурное исследование белков, в основном очищенных белков в среде in vitro . Белки функционируют в живых клетках, и поэтому белковые структуры должны регулироваться посредством взаимодействий с различными молекулами, некоторые из которых участвуют в реакционных сетях, в зависимости от состояний, условий или действий клетки.Поэтому очень важно понимать структурное поведение белков в живых клетках.

Методы

Измерения одномолекулярного резонансного переноса энергии Ферстера (smFRET) проводились с использованием метода альтернативного лазерного возбуждения (ALEX). Распределение smFRET цитозольных белков Rapidly Accelerated Fibrosarcoma (RAF) в живых клетках HeLa было получено с исключением отрицательных эффектов фотообесцвеченных флуорофоров и не полностью меченых белков на smFRET.

Результаты

Гистограммы smFRET RAF дикого типа (wt) в живых клетках демонстрировали два основных пика, тогда как у мутанта S621A, который, как полагали, имел расширенную структуру, был почти один пик. Популяционный сдвиг с участием пиков RAF дикого типа был обнаружен при стимуляции эпидермальным фактором роста. Спонтанные переходы между конформационными состояниями, соответствующими двум пикам, также были обнаружены с использованием метода оценки распределения плотности на основе двухканального ядра FRET по сравнению со статическими образцами двухцепочечной ДНК.

Выводы

Цитозольный CRAF имеет по крайней мере три конформационных состояния; в дополнение к закрытой и открытой формам отчетливо указывалась полностью открытая форма. На основании результатов мы предлагаем умозрительную структурную модель CRAF.

Общее значение

Структурное распределение и изменения белков в живых клетках в результате внутриклеточных взаимодействий были успешно идентифицированы. smFRET с использованием ALEX применим к любым другим цитозольным белкам.

Ключевые слова

Измерение внутри клетки

Одиночная молекула

Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET)

Альтернативное лазерное возбуждение (ALEX)

CRAF

Структура белка

Рекомендуемые статьи Цитирующие статьи (0)

Просмотр 2019 Авторы. Опубликовано Elsevier BV

Рекомендуемые статьи

Цитирующие статьи

Ингибиторы RAF способствуют взаимодействию RAS-RAF путем аллостерического нарушения аутоингибирования RAF

Ингибиторы RAF стимулируют ассоциацию RAS-RAF

Мы создали биосенсоры на основе BRET для мониторинга физической ассоциации между активированными КРАС (KRAS G12V ) и два паралога РАФ (B и CRAF).Конструкции KRAS содержат N-концевую метку люциферазы II (RlucII) Renilla , тогда как полноразмерные конструкции RAF были сконструированы как N-концевые слияния GFP 10 29 . Чтобы упростить описание зонда BRET, во всей рукописи будет использоваться соглашение о доноре-акцепторе (RlucII-GFP 10 ). В экспериментах по титрованию, где уровень донорского зонда поддерживается постоянным, увеличение концентрации акцепторной конструкции приводило к насыщению сигнала BRET KRAS G12V -RAF BRET, что свидетельствует о специфическом взаимодействии между зондами (рис.1а и дополнительный рис. 1а) 30 . Специфичность сигнала была дополнительно продемонстрирована его чувствительностью к мутациям, направленным на RBD (BRAF R188L и CRAF R89L ) или к состоянию активации RAS (активный KRAS G12V по сравнению с неактивным KRAS S17N ) (рис. 1a и дополнительный Рис. 1а).

Рис. 1

Ингибиторы RAF способствуют образованию комплекса RAS-RAF. a Проверка биосенсора KRAS-BRAF BRET с помощью экспериментов по титрованию. Донорные конструкции KRAS содержали N-концевую метку RlucII, в то время как акцепторные конструкции BRAF включали N-концевую группу GFP10.Пара KRAS G12V -BRAF давала сильный и воспроизводимый сигнал BRET, который соответствовал гиперболической функции, указывая на конкретное взаимодействие. b BRET-сигнал, излучаемый биосенсорами KRAS G12V -BRAF, может индуцироваться ингибиторами RAF дозозависимым образом. Кратковременные изменения BRET представлены отдельно для ингибиторов I и II типа (левая и правая панели соответственно). c Мутация привратного остатка BRAF (T529M) в зондах BRET устраняет индуцированное GDC-0879, но не индуцированное AZ-628 взаимодействие KRAS G12V -BRAF.EC 50 указаны для каждой кривой доза-ответ. d Шесть настоящих ингибиторов RAF и три нецелевых ингибитора усиливают ассоциацию помеченного Flag KRAS G12V с эндогенными BRAF и CRAF, как измерено с помощью co-IP (левая панель). Обработка GDC-0879 также стимулирует ассоциацию NRAS G12V и HRAS G12V с эндогенными BRAF и CRAF. Клетки обрабатывали 10 мкМ указанных соединений. Ингибиторы и MEK не индуцируют образование комплекса KRAS G12V -BRAF или KRAS G12V -CRAF, как измерено методом co-IP.Клетки обрабатывали 10 мкМ указанных соединений. Столбики ошибок на кривых доза-реакция соответствуют средним значениям ± стандартное отклонение. технических дубликатов репрезентативного биологического трехкратного экземпляра. EC 50 с - это среднее значение не менее трех независимых повторов (дополнительные данные 1)

Затем мы использовали этот анализ для мониторинга воздействия различных ингибиторов RAF на взаимодействие RAS-RAF. Для этого мы использовали два типа ингибиторов, а именно ингибиторы типа I, которые связывают домен киназы в активноподобном (DFG-in; спираль αC-in) режиме, и ингибиторы типа II, которые связываются в неактивно-подобном (DFG- out и / или helix αC-out) режим 31 .Ингибиторы как типа I (GDC-0879 и SB5), так и типа II (сорафениб, AZ-628 и PLX4032) стимулировали сигналы BRET KRAS G12V -BRAF и KRAS G12V -CRAF BRET в зависимости от дозы (рис. 1b). и дополнительный рис. 1b). Напротив, контрольный зонд KRAS G12V -RAF RBD был нечувствителен к этим АТФ-конкурентным ингибиторам (дополнительный рис. 1c, d). Интересно, что различия в эффективности соединения и кратковременной индукции могут быть обнаружены с помощью BRET. Например, мы обнаружили, что PLX4032 вызывает ответ меньшей амплитуды по сравнению с другими ингибиторами (рис.1b и дополнительный рис. 1b), что согласуется с предыдущей литературой 16,20 . Важно отметить, что ингибитор MEK (U0126) не влиял на взаимодействия KRAS G12V -BRAF или KRAS G12V -CRAF (дополнительный рис. 1c, d). Это предполагает, что комплексы RAS-RAF, индуцированные ингибиторами RAF, не просто вызываются ингибированием ERK-опосредованной отрицательной обратной связи 32,33 .

Учитывая, что ингибиторы RAF не взаимодействуют с зондами KRAS G12V -RAF RBD BRET, это настоятельно предполагает, что каталитическое взаимодействие RAF необходимо для индуцированной ингибитором ассоциации RAS-RAF.Чтобы проверить это, мы ввели мутацию «привратника» (T529M в BRAF и T421M в CRAF) в зонды RAF BRET. Этот класс мутаций предотвращает доступ ингибитора типа I к каталитической щели RAF, но не влияет на связывание ингибитора типа II 20,34 . В соответствии с этим, взаимодействие KRAS G12V с мутантами-привратниками BRAF и CRAF было устойчивым к GDC-0879 (тип I), но не к AZ-628 (тип II) в экспериментах с дозозависимой реакцией BRET (рис. 1c и дополнительная информация). Рис. 1д). Эти результаты согласуются с предыдущими открытиями, согласно которым мутация T421M предотвращает индуцированную соединением релокализацию мембраны CRAF 16 .

Чтобы продемонстрировать другим способом, что ингибиторы RAF индуцируют ассоциацию RAS-RAF, мы проверили их способность стимулировать коиммунопреципитацию (co-IP) эндогенного RAF с использованием конструкции KRAS G12V , меченной флагом. Были протестированы шесть настоящих ингибиторов RAF, а также три АТФ-конкурентных ингибитора, которые, как ранее было показано, беспорядочно связываются с RAF. 20 . Как показано на фиг. 1d, каждый ингибитор усиливал ко-IP BRAF и CRAF, хотя и в разной степени. Чтобы подтвердить, что этот эффект наблюдается независимо от уровней экспрессии RAS, мы провели эксперименты по титрованию и показали, что GDC-0879 может индуцировать ассоциацию RAS-RAF в широком диапазоне количеств Flag-KRAS G12V (дополнительный рис.2а). Кроме того, в соответствии с идеей о том, что индуцированная ингибитором ассоциация RAS-RAF не является изоформной или аллель-специфичной, мы обнаружили, что NRAS G12V , HRAS G12V и KRAS Q61H все проявляют повышенную склонность к взаимодействию с эндогенными BRAF и CRAF после обработки GDC-0879 (рис. 1d и дополнительный рис. 2b). Кроме того, в соответствии с результатами BRET, ингибиторы MEK были неактивными в этом анализе (рис. 1e). Интересно отметить, что PLX4032 и сорафениб лишь незначительно индуцировали образование комплекса RAS-RAF по сравнению с SB5, GDC-0879, AZ-628 или дабрафенибом (рис.1г). Точно так же три неселективных ингибитора показали более слабый эффект на взаимодействие RAS-RAF (рис. 1d). Это можно объяснить разным сродством или способами связывания ингибиторов. Однако, хотя PLX4032 является плохим индуктором взаимодействия RAS-RAF, он имеет in vitro IC 50 в том же диапазоне, что и GDC-0879 и AZ-628 16,35,36 . Аналогично, способы связывания PLX4032 и дабрафениба схожи (тип IIb: DFG-in; спираль αC-out), но они обладают разными способностями управлять ассоциацией RAS-RAF.То же самое можно сказать и о сорафенибе и AZ-628 (тип IIa: DFG-out; спираль αC-in). Наконец, образование индуцированных ингибитором комплексов RAS-RAF было воспроизведено с помощью эндогенных белков (дополнительный рис. 2c, d). Вместе эти находки подтверждают, что ингибиторы RAF способствуют ассоциации RAS-RAF и что это событие требует участия каталитической расщелины RAF.

Соединение-индуцированное связывание RAS-RAF коррелирует с димеризацией

Учитывая, что все использованные выше ингибиторы RAF также являются известными индукторами димеризации RAF, мы проверили, коррелирует ли их дифференциальная способность влиять на ассоциацию RAS-RAF с их потенциалом индукции димеризации.Чтобы решить эту проблему, мы обработали клетки HEK293T различными соединениями и сравнили их способность индуцировать эндогенные комплексы BRAF-CRAF посредством co-IP. Как показано на фиг. 2a, соединения, демонстрирующие сильную индукцию димера BRAF-CRAF, были такими же, как и соединения, демонстрирующие сильное взаимодействие KRAS G12V -RAF (фиг. 1d). Мы количественно оценили эту корреляцию, построив график зависимости эффективности ингибиторов по индукции сигнала BRET киназного домена BRAF-BRAF от их способности стимулировать взаимодействие KRAS G12V -BRAF (рис.2b и дополнительный рис. 3a, b). Повышенный R Номер 2 , полученный из этого анализа (0,85), указывает на то, что способность ингибиторов стимулировать ассоциацию RAS-RAF действительно сильно коррелирует с их способностью индуцировать димеризацию.

Рис. 2

Ингибитор-индуцированная ассоциация RAS-RAF коррелирует с димеризацией RAF. a ингибиторы RAF сильно индуцируют димеризацию эндогенных BRAF и CRAF в клетках HEK293T, как определено с помощью co-IP.Клетки обрабатывали 10 мкМ указанных соединений. b Корреляция между димеризацией домена киназы BRAF и ассоциацией KRAS-BRAF. EC 50 s, полученные для каждого ингибитора в анализе димеризации киназного домена BRAF-BRAF, были нанесены на график против EC 50 s, полученных в анализе KRAS G12V -BRAF BRET (дополнительный рис. 3a, b). c Мутант BRAF R509H с нарушенной димеризацией сильно препятствует ассоциации KRAS G12V -BRAF, индуцированной ингибиторами типа I, но слабо влияет на индукцию ингибиторами типа II.d Связывание IC 50 s репрезентативных ингибиторов типа I и типа II, определенных TR-FRET с использованием рекомбинантного киназного домена WT BRAF или BRAF R509H . e Замена R509H изменяет индуцированную ингибитором типа I и типа II димеризацию домена киназы BRAF в различной степени. f Усиливающий димеризацию мутант BRAF E586K увеличивает базальную ассоциацию KRAS G12V -BRAF. Чтобы облегчить сравнение между условиями, диапазон между минимальным и максимальным сигналами BRET был нормализован до 100% в c , e .Столбики ошибок на кривых доза-реакция соответствуют средним значениям ± стандартное отклонение. технических дубликатов репрезентативного биологического трехкратного экземпляра. EC 50 s и IC 50 s представляют собой среднее значение не менее трех независимых повторов (дополнительные данные 1)

Поскольку связывание ингибитора влияет на конформацию домена киназы RAF, ведущую к димеризации 20 , мы пришли к выводу, что образование димера само по себе может вносить вклад в образование комплекса RAS-RAF. Мы стремились рассмотреть эту возможность, используя нарушенный димеризацией мутантный аллель BRAF_R509H 7 , и протестировали способность различных ингибиторов типа I и типа II управлять ассоциацией KRAS G12V -BRAF с использованием теста BRET.Интересно, что в то время как мутация R509H сильно снижала эффективность ингибиторов типа I, она оказывала лишь слабый эффект на ингибиторы типа II (рис. 2c). Хотя эти находки согласуются с ролью димеризации киназного домена в образовании комплекса RAS-RAF, расхождение в эффективности, наблюдаемое между двумя классами ингибиторов, интригует. Разницу можно объяснить рядом возможностей. Например, мутация R509H может по-разному влиять на сродство ингибиторов к домену киназы BRAF.Другая возможность может заключаться в том, что у ингибиторов типа II мутация R509H слабо нарушает их способность индуцировать димеризацию BRAF. Чтобы обратиться к первой возможности, мы использовали анализ резонансного переноса энергии флуоресценции с временным разрешением (TR-FRET) 20 и сравнили аффинность связывания ингибиторов типа I и типа II с сайтом связывания АТФ рекомбинантного дикого типа (WT ) и киназных доменов R509H BRAF (дополнительный рис. 3c и дополнительные данные 1). Неожиданно сродство ингибиторов типа I к BRAF R509H было снижено в четыре-семь раз по сравнению с WT, тогда как ингибиторы типа II показали одинаковое сродство к WT и BRAF R509H (рис.2г). Таким образом, похоже, что на связывание двух классов ингибиторов по-разному влияет мутация R509H. Следовательно, из-за потери аффинности ингибиторы типа I не могут использоваться в комбинации с мутацией R509H для однозначного подтверждения значимости димеризации киназного домена для образования комплекса RAS-RAF. Таким образом, мы обратили внимание на ингибиторы типа II, для которых аффинность связывания не изменилась. Несмотря на воспроизводимость, мутация R509H лишь слабо препятствовала способности ингибиторов типа II управлять ассоциацией RAS-RAF (рис.2в). Как упоминалось выше, мы рассмотрели, может ли это быть связано со слабым эффектом мутации R509H на димеризацию BRAF, индуцированную ингибиторами типа II. Как показано на фиг. 2e, мы неожиданно обнаружили, что на ингибиторы типа II действительно лишь слабо влияет мутация R509H. Следовательно, хотя эти результаты подтверждают модель, в которой димеризация киназного домена играет положительную роль в ассоциации RAS-RAF, отсутствие подходящих мутантов, которые полностью устраняют индуцированную соединением димеризацию киназного домена без ущерба для аффинности связывания соединения, препятствует окончательной демонстрации .

Чтобы решить другими способами важность димеризации киназного домена во взаимодействии RAS-RAF, мы оценили склонность мутанта, усиливающего димеризацию BRAF (E586K) 7 , взаимодействовать с RAS. BRAF E586K действительно продемонстрировал усиленное базальное взаимодействие с KRAS G12V , что согласуется с ролью димеризации в этом событии (Fig. 2f).

Ингибиторы RAF снимают аутоингибирование BRAF

Наши результаты показывают, что ортостерическое связывание является предпосылкой для индуцированной ингибитором ассоциации RAS-RAF.Это предполагает, что связывание RAS с RBD структурно связано с инфраструктурой киназного домена. Примечательно, что ранее сообщалось о внутримолекулярном взаимодействии между киназным доменом и частью N-концевой регуляторной области (NTR) RAF, охватывающей RBD и CRD 4,5,6,37 . Это взаимодействие способствует аутоингибированию RAF в покоящихся клетках и снимается после связывания RAS 5 . Мы предположили, что АТФ-конкурентные ингибиторы RAF могут нарушать это физическое взаимодействие и тем самым облегчать доступ RAS к RBD.

Чтобы проверить эту гипотезу, мы создали N-концевую регуляторную область BRAF (остатки 1–434; обозначены как BRAF NTR ) и киназный домен BRAF (остатки 435–766; обозначены как BRAF KD ) слияния BRET и оценили их взаимодействие в экспериментах по титрованию. Зонды показали умеренные, но насыщаемые сигналы BRET, близкие к гиперболической функции (рис. 3а). В соответствии со способностью нагруженного GTP RAS нарушать внутримолекулярное взаимодействие RAF, сигнал BRET был резко снижен за счет избыточной экспрессии меченного mCherry KRAS G12V , в то время как мутант RBD BRAF NTR _R188L был нечувствителен к экспрессии RAS (рис.3а). Затем мы использовали этот анализ для изучения влияния ингибиторов на внутримолекулярные взаимодействия RAF. Интересно, что эксперименты «доза-ответ» показали, что GDC-0879 снижает сигнал NTR-KD BRET в зависимости от концентрации, в то время как ингибиторы MEK не оказывают никакого воздействия (рис. 3b).

Рис. 3

Ингибиторы RAF в открытом состоянии нарушают внутримолекулярное взаимодействие BRAF независимым от RAS образом. a BRET кривые титрования, демонстрирующие специфичность внутримолекулярных биосенсоров BRAF (BRAF NTR -BRAF KD ).Добавление mCherry-KRAS G12V значительно нарушило ассоциацию BRAF NTR-KD, тогда как зонд, содержащий мутант BRAF NTR _R188L, был нечувствителен к активированному RAS. b Анализ доза-ответ зондов BRAF NTR -BRAF KD BRET с ингибитором RAF GDC-0879 и серией ингибиторов MEK. c GDC-0879 разрушил комплекс BRAF NTR −BRAF KD в экспериментах по совместной IP. Анти-BRAF использовали для обнаружения экспрессии Pyo-tag BRAF NTR .BRET d и co-IP e показывают, что GDC-0879 в равной степени нарушает взаимодействие киназного домена BRAF с конструкциями NTR, мутированными WT или R188L (RL). f Корреляция между димеризацией домена киназы BRAF, индуцированной ингибитором, и нарушением взаимодействия BRAF NTR-KD. EC 50 для каждого ингибитора в анализе димеризации киназного домена BRAF-BRAF наносили на график против EC 50 , полученных с помощью анализа BRAF NTR -BRAF KD BRET. г Мутант с нарушенной димеризацией BRAF R509H препятствует разрушению BRAF NTR -BRAF KD , индуцированному ингибиторами типа I, но не препятствует значительному разрушению, вызванному ингибиторами типа II. GDC-0879 использовали в концентрации 1 мкМ во всех экспериментах по совместному IP. EC 50 s представляют собой среднее значение по крайней мере трех независимых повторов (дополнительные рисунки 3a, 4g; дополнительные данные 1). Чтобы облегчить сравнение между условиями, диапазон между минимальным и максимальным сигналами BRET был нормализован до 100% в g .Столбики ошибок на кривых доза-реакция соответствуют средним значениям ± стандартное отклонение. технических дубликатов репрезентативного биологического трехкратного экземпляра. EC 50 с - это среднее значение не менее трех независимых повторов (дополнительные данные 1)

Анализы

BRET не только сообщают об образовании / разрушении комплексов, но и о конформационных изменениях внутри белковых комплексов. Поэтому мы использовали ко-IP в качестве альтернативного метода, чтобы определить, могут ли АТФ-конкурентные ингибиторы также физически нарушать внутримолекулярное взаимодействие RAF.Для этого мы создали версию BRAF NTR с меткой эпитопа Polyoma (Pyo) (Pyo-BRAF NTR ) и версию киназного домена с меткой Flag (Flag-BRAF KD ). Киназы RAF, несущие укороченные NTR, ведут себя как усиление функций 38,39,40,41,42 , которые могут блокироваться в trans с помощью коэкспрессии NTR 4,5,6 . Мы обобщили эти результаты, используя Flag-BRAF KD и Pyo-BRAF NTR (дополнительный рис. 4a). Более того, комплексы BRAF NTR-KD можно было обнаружить с помощью co-IP, и они были эффективно разрушены путем совместной экспрессии активированного RAS, тогда как комплексы, содержащие вариант R188L BRAF NTR , были устойчивыми (дополнительный рис.4б). Затем мы проверили влияние GDC-0879 на эти комплексы. В соответствии с тестом BRET, GDC-0879 уменьшал образование комплекса BRAF NTR-KD (рис. 3c). Интересно, что обработка GDC-0879 индуцировала сдвиг подвижности белка Flag-BRAF KD , который, вероятно, был вызван ERK-опосредованным фосфорилированием по отрицательной обратной связи BRAF 32,33 . Это событие действительно было отменено обработкой фосфатазой лямбда и заблокировано ингибитором ERK (SCH772984) 43 (дополнительный рис.4в, г). Важно отметить, что снижение внутримолекулярного взаимодействия BRAF после обработки GDC-0879 наблюдалось даже при отмене ERK-опосредованного фосфорилирования обратной связи (дополнительный рис. 4d). Мы также проверили, требуется ли для разрушения комплексов NTR-KD ингибиторами RAF связывание каталитической щели. Для этого мы использовали мутант привратника BRAF KD _T529M как в экспериментах с BRET, так и в экспериментах по совместному IP. В соответствии с нашими предыдущими результатами (рис. 1c), этот вариант показал устойчивость к индуцированному GDC-0879 разрушению комплексов NTR-KD (дополнительный рис.4д, е). Наконец, чтобы рассмотреть роль RAS в индуцированном соединением высвобождении взаимодействия NTR-KD, мы протестировали способность GDC-0879 нарушать аутоингибирование с использованием конструкции NTR, содержащей замену R188L и которая показала устойчивость к RAS-GTP (дополнительный рис. . 4b). Поразительно, что GDC-0879 в равной степени ингибировал взаимодействие киназного домена с WT и мутантом R188L BRAF NTR , как измерено с помощью BRET и co-IP (фиг. 3d, e). Вместе эти данные показали, что эффект GDC-0879 на аутоингибирование RAF зависит от взаимодействия соединения.Кроме того, они показали, что это не зависит от ERK-опосредованной регуляции отрицательной обратной связи или от связывания RAS. Это последнее наблюдение особенно важно, поскольку оно обеспечивает основу для объяснения кооперации, наблюдаемой между связыванием RAS с RBD и связыванием соединения с киназным доменом в управлении парадоксальной активацией пути.

Нарушение аутоингибирования коррелирует с димеризацией.

Взаимодействие с АТФ-конкурентным ингибитором вызывает замкнутую / жесткую конформацию киназного домена RAF, которая стабилизирует межсторонний интерфейс, ведущий к димеризации. 20,44 .Мы предположили, что способность соединений влиять на взаимодействие NTR-KD может быть следствием их способности управлять димеризацией киназного домена. Чтобы исследовать это, мы рассчитали корреляцию между эффективностью девяти соединений индуцировать димеризацию BRAF и их способностью препятствовать комплексам NTR-KD, используя BRET EC 50 s в качестве заместителя (дополнительные рисунки 3a, 4g). В результате этого анализа была получена R . 2 из 0,58 (рис. 3е). Хотя это согласуется с связью между двумя событиями, их умеренная корреляция предполагает, что индуцированная соединением димеризация киназного домена может быть не единственным фактором, влияющим на взаимодействие NTR-KD.Для дальнейшего исследования значимости димеризации, индуцированной соединением, для разрушения NTR-KD, мы протестировали с помощью BRET влияние мутации R509H на способность ингибиторов типа I и типа II изменять взаимодействие NTR-KD с оговоркой, что ингибиторы типа I. с более низким сродством связывают киназный домен BRAF_R509H (рис. 2d). Ингибиторы типа I действительно были менее эффективны при нарушении взаимодействия NTR-KD_R509H (фиг. 3g), что могло быть результатом их пониженного сродства к BRAF_R509H. Напротив, на ингибиторы типа II мутация R509H не влияла.Учитывая их нормальную аффинность связывания с BRAF_R509H, это предполагает, что димеризация сама по себе играет незначительную роль, если вообще играет роль в способности ингибиторов RAF нарушать взаимодействие NTR-KD. К этому выводу, однако, следует относиться с осторожностью, поскольку ингибиторы типа II все еще могут вызывать димеризацию BRAF_R509H, хотя и со сниженной в 2–4 раза эффективностью (рис. 2e).

Основываясь на вышеизложенных результатах, мы пришли к выводу, что занятие соединениями расщелины киназного домена и его специфическое влияние на конформацию киназного домена может изменить в cis взаимодействие NTR-KD и, в свою очередь, физически аннулировать взаимодействие или просто изменить это не обязательно нарушать его.В результате такие события повлияли бы на доступность RAF RBD для RAS-GTP. Соединения, подобные AZ-628, который является мощным индуктором димеризации, но более слабым нарушителем взаимодействия NTR-KD, могут относиться к последней категории (рис. 3f; дополнительный рис. 4g). В поддержку этой модели мы обнаружили, что несколько онкогенных мутаций BRAF демонстрируют явно усиленное взаимодействие с KRAS G12V (дополнительный рис. 5a), однако их соответствующее взаимодействие NTR-KD сравнимо с взаимодействием WT BRAF (дополнительный рис.5b), как будто физическое отключение NTR от домена киназы не является существенным для увеличения доступа RAS-GTP к RBD. Как бы то ни было, взаимодействие NTR-KD онкогенных вариантов BRAF, таких как V600E или G469V, тем не менее было физически нарушено после обработки соединением (дополнительный рис. 5c), что указывает на то, что ингибиторы изменяют взаимодействие NTR-KD в мутантных клетках BRAF.

Ингибиторы RAF избирательно изменяют аутоингибирование RAF

Учитывая родственную структурную организацию киназ семейства RAF, мы задались вопросом, может ли высвобождение взаимодействия NTR-KD, наблюдаемое в BRAF, также происходить в других членах семейства.Чтобы решить эту проблему, мы сначала определили способность NTR каждой изоформы RAF и KSR взаимодействовать со своим родственным киназным доменом. Помимо BRAF и CRAF, о которых ранее сообщалось 4,5 , мы обнаружили ассоциацию NTR-KD также для ARAF, KSR1 и KSR2 (рис. 4a). Эти находки подтверждают представление о том, что внутримолекулярное связывание является общим регуляторным признаком членов семейства RAF. Интересно, что мы заметили значительные различия в силе взаимодействия между различными изоформами, но это не коррелировало с их очевидной внутренней киназной активностью (дополнительный рис.6).

Рис. 4

Ингибиторы RAF в открытом состоянии избирательно нарушают внутримолекулярные взаимодействия BRAF и CRAF. a NTR каждого члена семейства RAF специфически взаимодействует с его родственным киназным доменом. Сила взаимодействия, отслеживаемого с помощью co-IP, варьировалась в зависимости от изоформ. NTR каждого члена семейства (ARAF (A), BRAF (B), CRAF (C), KSR1 (K1) и KSR2 (K2)) был слит с N-концевым тегом Pyo, в то время как его родственный киназный домен (KD ) содержал N-концевой тег Flag. b Ингибиторы RAF GDC-0879 и LY-3009120 селективно нарушают взаимодействие NTR-KD BRAF и CRAF, в то время как они не оказывают заметного влияния на другие члены семейства (ARAF, KSR1 и KSR2).Клетки обрабатывали 10 мкМ GDC-0879 или LY-3009120. c Ингибиторы RAF индуцируют димеризацию BRAF – CRAF независимым от RAS образом. GDC-0879 (слева) и LY-3009120 (справа) индуцируют димеризацию CRAF-BRAF полной длины в присутствии доминантно-отрицательного KRAS S17N (серый) или RBD-мутантного BRAF R188L и CRAF R89L (RL , синие кривые). Экспрессия KRAS G12V усиливает (пунктирные стрелки) эффект обоих соединений на димеризацию BRAF – CRAF (красные кривые). d Co-IP подтверждает, что BRAF R188L и CRAF R89L могут образовывать индуцированные ингибитором, независимые от RAS димеры. Чтобы облегчить сравнение между условиями, диапазон между минимальным и максимальным сигналами BRET был нормализован до 100% в c . Столбики ошибок на кривых доза-реакция соответствуют средним значениям ± стандартное отклонение. технических дубликатов репрезентативного биологического трехкратного экземпляра. EC 50 с - это среднее значение не менее трех независимых повторов (дополнительные данные 1)

Затем мы исследовали, как каждое взаимодействие NTR-KD реагирует на ингибитор типа I (GDC-0879) или типа II (LY-3009120).Помимо BRAF, взаимодействие CRAF NTR-KD также было нарушено в ответ на лечение препаратом, тогда как ARAF, KSR1 и KSR2 не показали ответа (рис. 4b). Отсутствие реакции взаимодействия ARAF NTR-KD на ингибиторы было неожиданным, особенно для LY-3009120, поскольку сообщалось, что он связывает ARAF in vitro со сродством, аналогичным BRAF или CRAF 22 . Это может означать, что конформационная реакция ARAF на соединения отличается от реакции BRAF и CRAF.

Ингибиторы RAF и RAS взаимодействуют, чтобы индуцировать димеры RAF.

В физиологических условиях связывание RAS-GTP является основным триггером, реализующим ослабление аутоингибирования, что впоследствии приводит к димеризации RAF.Предыдущая работа показала, что ингибиторы RAF нуждаются в активности RAS для того, чтобы индуцировать передачу сигналов ERK 16,17,18 . Наш анализ идентифицировал BRAF и CRAF как единственные изоформы, чувствительные к индуцированной соединением диссоциации NTR-KD. Кроме того, мы обнаружили, что это явление имеет место независимо от активности РАС. Поскольку высвобождение NTR посредством RAS стабилизирует ON-состояние киназного домена посредством димеризации, мы предположили, что ингибиторы RAF могут аналогичным образом индуцировать димеризацию полноразмерных белков RAF независимо от активности RAS из-за действия двух совпадающих событий, а именно: способность ингибиторов ослаблять взаимодействие NTR-KD и их способность стабилизировать закрытую / активноподобную конформацию киназного домена.Это явление, тем не менее, будет происходить с низкой скоростью, учитывая отсутствие RAS-GTP, который эффективно снимает аутоингибирование и инициирует образование димеров RAF посредством нанокластеризации на плазматической мембране 5,28 .

Чтобы проверить эту гипотезу, мы оценили способность GDC-0879 и LY-3009120 вызывать димеризацию BRAF – CRAF ± активность RAS. Для этого мы провели эксперименты доза-ответ BRET с использованием WT или RBD-инактивированных (варианты RL) зондов BRAF и CRAF, экспрессированных отдельно или вместе с KRAS S17N или KRAS G12V (дополнительный рис.7а). В соответствии с нашим предсказанием, димеризация BRAF-CRAF, индуцированная соединением, наблюдалась даже в условиях, когда активность RAS не была доступна или когда было предотвращено связывание белков RAF с RAS-GTP (рис. 4c). Мы сделали аналогичные наблюдения с дополнительными ингибиторами RAF (дополнительный рис. 7b). Однако соединения систематически демонстрировали гораздо более низкую эффективность в этих условиях, чем когда зонды WT RAF коэкспрессировались вместе с KRAS G12V (фиг. 4c и дополнительный фиг.7б). Аналогичные результаты были получены при ко-IP с использованием коэкспрессируемых конструкций RAF RL (фиг. 4d). Таким образом, очевидно, что ингибиторы RAF могут вызывать димеризацию RAF независимо от активности RAS.

Учитывая независимое действие ингибиторов RAF и активность RAS в продвижении конформационных переходов RAF, мы предположили, что оба входа могут работать совместно, что объясняет их мощные комбинаторные эффекты. Чтобы решить эту проблему, мы воспользовались преимуществом анализа взаимодействия BRAF-CRAF BRET и провели эксперименты «доза-ответ» в клетках, экспрессирующих различные количества конструкции mCherry-RAS G12V .Анализ данных позволил вычислить logα '(мера кооперативности 45 ) 1,76 и 1,28 для GDC-0879 и LY-3009120, соответственно. Это указывает на то, что соединения и RAS действительно работают совместно, и это подтверждает, что RAS-GTP является положительным аллостерическим модулятором димеризации RAF, индуцированной соединением.

Влияние ингибиторов второго поколения на взаимодействия RAF

Учитывая недостатки исходных ингибиторов RAF, недавно появилось новое поколение соединений, включающее два основных класса, определяемых их механизмом действия (Введение), а именно, ингибиторы пан-RAF и «Нарушители парадоксов» (также называемые ПБ) 26 .Мы стремились сравнить эти два класса ингибиторов в отношении их влияния на аутоингибирование RAF и ассоциацию RAS-RAF. Для этого мы использовали ингибитор pan-RAF LY-3009120 и типичный разрушитель парадокса, PLX-0012 (WO 2012109075, соединение P-0012) 46 , который принадлежит к тому же хемотипу, что и PLX4720, но имеет N, N -метилэтилсульфамоильный фрагмент вместо н-пропилсульфонамидной группы. Было заявлено, что это тонкое различие между двумя соединениями придает ингибиторам сульфонамидного ряда разрушающие парадокс свойства (рис.5а) 26 .

Рис. 5

Профилирование ингибитора pan-RAF LY-3009120 и разрушителя парадокса PLX-0012. a Структура LY-3009120, PLX4720 и Paradox Breaker PLX-0012. Анализ доза-ответ LY-3009120, PLX4720 и PLX-0012 с помощью биосенсоров BRET, измеряющих димеризацию киназного домена BRAF b , ассоциацию KRAS-BRAF d и внутримолекулярное взаимодействие BRAF f . LY-3009120, PLX4720 и PLX-0012 обладают разными склонностями к стимулированию димеризации BRAF – CRAF c , к стимулированию ассоциации KRAS-RAF e и к нарушению аутоингибирования BRAF g , как измерено в экспериментах по совместному IP.Клетки обрабатывали 10 мкМ каждого указанного соединения. PLX4720 h и PLX-0012 i индуцируют димеризацию CRAF-BRAF независимым от RAS образом. Полноразмерную димеризацию BRAF-CRAF измеряли в присутствии доминантно-отрицательных KRAS S17N (серый) или RBD-мутированных BRAF R188L и CRAF R89L (RL; синий). Экспрессия активного KRAS G12V усиливала эффект PLX4720 и PLX-0012 на димеризацию BRAF-CRAF (оранжевый и голубой, соответственно).Каждый EC 50 был средним значением трех независимых повторов. j Максимальный сигнал pERK, представленный в таблице 1, был нанесен на график в зависимости от его соответствующей концентрации в каждой клеточной линии. Каждое соединение представлено отдельным цветом: LY-3009120 (красный), PLX4720 (оранжевый) и PLX-0012 (синий). Чтобы облегчить сравнение между условиями, диапазон между минимальным и максимальным сигналами BRET был нормализован до 100% на панелях h и i. Планки погрешностей на кривых доза-реакция соответствуют средним значениям ± с.d. технических дубликатов репрезентативного биологического трехкратного экземпляра. EC 50 - это среднее значение по крайней мере трех независимых повторов (дополнительные данные 1). Планки погрешностей в j соответствуют средним значениям ± стандартное отклонение. биологических троек

Мы впервые представили эти ингибиторы в нашей панели датчиков BRET. LY-3009120 сильно и мощно индуцировал димеризацию RAF в диапазоне нМ (рис. 5b; дополнительный рис. 8a, b). Он также сильно стимулировал взаимодействия KRAS-BRAF и KRAS-CRAF и ингибировал внутримолекулярное взаимодействие RAF с активностями, подобными GDC-0879 (рис.5г, е; Дополнительный рис. 8c). Таким образом, по этим критериям LY-3009120 сопоставим с ингибиторами RAF первого поколения. Эксперименты по Co-IP подтвердили, что LY-3009120 сильно индуцирует димеризацию RAF, способствует образованию комплексов RAS-RAF и нарушает аутоингибирование RAF (рис. 5c, e и g). Напротив, PLX-0012 не влиял на димеризацию BRAF-BRAF (фиг. 5b), в то время как он лишь незначительно индуцировал димеризацию CRAF-CRAF и BRAF-CRAF при повышенных дозах (дополнительный фиг. 8a, b). Точно так же PLX-0012 вызывал лишь небольшое увеличение ассоциации KRAS-RAF (рис.5d; Дополнительный рис. 8c) и оказал незначительное влияние на взаимодействие NTR-KD (рис. 5f). Примечательно, что эффект PLX-0012 на каждый зонд был слабее, чем PLX4720. Эксперименты Co-IP подтвердили эти результаты BRET (рис. 5c, e и g; дополнительный рис. 8d).

Затем мы оценили, предсказывает ли профиль этих ингибиторов в анализах BRET и co-IP их влияние на передачу сигналов ERK в панели клеточных линий, несущих мутации RAS (таблица 1; дополнительный рисунок 9, дополнительные данные 1). В качестве ссылки была включена мутантная линия клеток меланомы BRAF V600E A375, в которой все три соединения полностью и сильно подавляли pERK (Таблица 1; Дополнительный Рис.9г). В соответствии с профилем BRET, аналогичным профилю соединений второго поколения, LY-3009120 индуцировал активацию pERK с различной эффективностью в каждой исследованной линии мутантных раковых клеток по KRAS (таблица 1). Как сообщалось ранее, PLX4720 приводил к индукции pERK во всех протестированных мутантных линиях по KRAS (таблица 1). Напротив, PLX-0012 не вызывал сильной парадоксальной индукции pERK в восьми линиях KRAS mut (таблица 1 и дополнительный рисунок 9). Однако мы заметили, что, несмотря на этот улучшенный профиль, PLX-0012 вызывал небольшую, но постоянную индукцию pERK в SW900 (125 ± 23% для AlphaLISA SureFire Ultra и 158 ± 8% для технологии MSD).Это может быть связано с тем фактом, что, несмотря на гораздо более слабые эффекты, PLX-0012 тем не менее проявлял склонность при более высоких дозах стимулировать димеры RAF и ассоциацию RAS-RAF, а также блокировать взаимодействие NTR-KD (рис.5 и дополнительный рис. 9). Соответственно, по сравнению с PLX4720, PLX-0012 продемонстрировал пониженную способность стимулировать независимую от RAS димеризацию CRAF-BRAF, и, в соответствии с его улучшенным профилем в мутантных по RAS клетках, KRAS G12V лишь слабо усиливал действие PLX-0012 на полную мощность. длина димеризации BRAF − CRAF (ср. рис.5h, i). Таким образом, наши данные профилирования предполагают, что LY-3009120 может все еще стимулировать умеренную активацию парадоксального пути при относительно низких дозах, несмотря на его улучшенную способность связывания с пан-RAF, и, таким образом, может представлять опасность против RAS-зависимых опухолей (рис. 5j и таблица 1). Это также подтверждает, что PB представляют собой существенное улучшение по сравнению с сульфонамидами первого поколения в отношении опухолей BRAF V600E . Тем не менее, обработка PLX-0012 все еще приводила к слабой активации парадоксального пути в ограниченном наборе клеточных линий (рис.5j и таблица 1). Более высокая доза, необходимая для достижения этого эффекта; однако это может не вызывать беспокойства. Наконец, их низкая эффективность в отношении RAS-мутантных клеток в настоящее время ограничивает возможности молекул PB лечить опухоли BRAF V600E .

Таблица 1 Профилирование фосфо-ERK разрушителя парадокса LY-3009120, PLX4720 и PLX-0012 в панели линий раковых клеток, мутантных по KRAS Кресло для влюбленных RAF

Fret Knot | Караколе

Ладовой узел RAF Loveseat
UPH-019-RL1-B

КОЛЛЕКЦИЯ: ОБИВКА ИЗ КАРАКОЛА

Размеры в дюймах: 63.25 x 36,5 x 30,5 выс.

Размеры в сантиметрах: 160,66 Ш x 92,71 Д x 77,47 В

Создайте зону отдыха своей мечты с возможностью настройки этих элегантных сегментов сидений с изысканной резьбой. Исключительные снаружи внутри, эти вдохновленные изделия имеют вставки из резных ладовых панелей, вставленных на их внешнюю сторону спины.Этот единственный в своем роде рисунок ладов был вдохновлен узким окном замка и решеткой, пропускающей воздух и свет. Обтянутый изысканной тканью, он предлагает безупречный стиль и удобное сиденье, завязанное вручную в восьми направлениях. Мягкая серебристая краска добавляет мерцания деталям, отделанным панелями, и ножкам с канавками.

ФУНКЦИИ:
  • Резная резная резьба на внешней стороне руки.
  • Конические ножки с коническими канавками.
  • Раскидывающая подушка плотная спинка.
  • Свободные подушки сиденья.
СТРОИТЕЛЬСТВО:
  • Подушка пружины.
  • Сиденье с ручным креплением в 8 направлениях.
  • Подушки перьевые.

ОТДЕЛКА:

Мягкая серебряная краска

ТКАНЬ:

Ткань корпуса: 2778 71CC Ткань подушки: 2 подушки размером 20 x 20 дюймов 8379 71CC 2 подушки 19 x 19 дюймов 3231 741CC

Из-за различий, присущих мониторам и браузерам, образцы цветов могут отличаться на разных мониторах.Для наиболее точного представления см. Физические образцы, доступные у наших розничных продавцов.

ЛЮБЛЮ ЭТО, ДЕЛИТЕСЬ ЭТОМ: печать Посмотреть Tearsheet

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку "Назад" и примите файлы cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

KRASQ61H преимущественно передает сигналы через MAPK димер-зависимым образом RAF при немелкоклеточном раке легкого 1).Разработка терапевтических стратегий, ориентированных на RAS, была сложной задачей, но недавний прогресс с ингибиторами KRAS

G12C (2–4) зажег новую надежду на решение проблем, связанных с заболеваниями, вызываемыми RAS . Однако история G12C также предполагает, что другие мутации RAS могут потребовать специфических для мутаций подходов, основанных на детальном понимании механизмов (5). Большинство онкогенных мутаций RAS встречается в кодонах 12, 13 и 61 (1). Эти мутации приводят к накоплению RAS-GTP, активированной формы RAS.Однако трансформирующая способность этих мутаций различается, и они происходят с разной скоростью для разных типов рака, что позволяет предположить, что отбор происходит при заболевании из-за функциональных различий между мутациями (1, 5). Хотя у нас нет механистических объяснений того, почему определенные мутации RAS выборочно возникают при определенных заболеваниях, ключи к разгадке начинают появляться. Например, мы недавно показали, что активация KRAS A146T и KRAS V14I происходит из-за быстрого обмена нуклеотидов (RNE), происходящего из структурных изменений белка, а не из-за нечувствительности к белкам, активирующим GTPase (GAP; refs.6, 7). Это предполагает, что мутанты RNE будут происходить избирательно в контекстах, где поддерживается RNE и / или где GAP недостаточны. С другой стороны, силы, управляющие отбором других мутаций, таких как мутации кодона 13 и кодона 61, плохо изучены.

Образование комплексов RAS на клеточной мембране важно для активности передачи сигналов RAS во многих контекстах (8-12). Эти комплексы кажутся очень динамичными, что позволяет предположить, что специфические мутации RAS могут по-разному изменять поведение этих чувствительных комплексов.Недавно мы сообщили о мутации RAS, D154Q, которая нейтрализует подавляющие эффекты KRAS WT в контексте онкогенных KRAS. Эта мутация была разработана на основе взаимодействия РАС – РАС, которое происходит через интерфейс α4 – α5, наблюдаемого в некоторых кристаллических структурах РАС (12). Недавние ЯМР-исследования молекул РАН, связанных с нанодисками, также показали аналогичную структурную модель, в которой используется интерфейс α4 – α5, хотя были некоторые отличия (13). Тем не менее, динамическая природа этих комплексов предполагает, что, вероятно, существуют множественные формы, а также были предложены другие конкурирующие модели, хотя они еще не были оценены в клеточных системах (14, 15).Несмотря на это, способность манипулировать по крайней мере одной формой взаимодействия RAS-RAS с помощью мутации D154Q позволяет изучать, как специфические онкогенные мутации RAS могут влиять на сборки RAS.

Мутации RAS, которые изменяют силу взаимодействия со специфическими эффекторами, могут изменить поведение комплексов RAS. Одной из таких мутаций является KRAS Q61H , которая демонстрирует сочетание исключительно низкой активности GTPase и относительно высокого сродства к RAF (16). Здесь мы напрямую сравнили KRAS Q61H , редкую мутацию при заболевании человека в целом (<1% KRAS), но наиболее частую мутацию кодона 61 для KRAS при заболеваниях человека, с KRAS G12D , наиболее распространенной мутацией, связанной с раком. RAS мутация в целом.Мы использовали лабораторные модели и клинические образцы, полученные от большой когорты пациентов, чтобы оценить важность мультимеризации KRAS для активности MAPK и PI3K. Мы также оценили структурную основу предпочтения KRAS Q61H для передачи сигналов MAPK. Наши данные предполагают уникальную взаимозависимость между мультимеризацией RAS и RAF для KRAS Q61H , но не для KRAS G12D . Эта взаимозависимость приводит к усилению передачи сигналов через путь MAPK и чувствительности к ингибиторам RAF и MEK, что позволяет предположить, что определенные мутации кодона 61 в RAS могут быть полезны в качестве прогностических биомаркеров для терапии, направленной на RAS.

Материалы и методы

Плазмиды

Плазмиды pcDNA3-CFP (номер в каталоге 13030), pcDNA3-YFP (номер в каталоге 13033), PIK3CA (номер в каталоге 16643) и pBABEpuro-c-RAF (номер в каталоге 51124) были приобретены у Addgene. Плазмида KRAS WT была получена из DNA2.0 (номер по каталогу 95005). Полноразмерные фрагменты KRAS WT , PIK3CA и c-RAF вставляли в векторы, содержащие CFP или YFP, для получения CFP-KRAS WT , YFP-KRAS WT , CFP-PI3KCA, YFP-PI3KCA, YFP- Конструкции c-RAF, c-RAF-CFP и c-RAF-YFP.KRAS G12D , KRAS G13D , KRAS Q61H , KRAS G12D / D154Q , KRAS G13D / D154Q , KRAS Q61H / D154Q и KRAS D154Q88 / R161E; и c-RAF R89L и c-RAF R89L / R401H мутанты были получены посредством сайт-направленного мутагенеза с использованием Pfu UItra II Hotstart PCR Master Mix (номер по каталогу 600850-51). Конструкции содержат связанный с mCherry-h3B-P2A KRAS G12D , KRAS G13D , KRAS Q61H , а аналоги с мутацией D154Q были созданы с использованием метода сборки Гибсона.Для бактериальной экспрессии плазмида Raf-1-RBD 1-149 (номер по каталогу 13338) была куплена у Addgene, а p110γ-RBD 206-311 был сконструирован посредством сборки Гибсона с использованием фрагмента p110γ-RBD 206-311 синтезирован из плазмиды IDT и Raf-1-RBD 1-149 в качестве вектора. Последовательности были подтверждены секвенированием ДНК.

Клеточные линии

Клетки

HEK293T были приобретены в ATCC. KRas lox KRAS MUT Ячейки были щедрым подарком от Dr.Лаборатория Мариано Барбакида и поколение были описаны ранее (17). Все клетки были получены в конце 2016 года. Вкратце, ретровирусные плазмиды KRAS G12D и KRAS Q61H были созданы путем точечного мутагенеза из плазмиды KRAS WT , меченной pBABE HA (предоставленной Channing Der, плазмида Addgene № 75282). Ретровирусы получали котрансфекцией плазмид pBABE вместе с плазмидой pAmpho в клетки HEK293T с использованием реагента для трансфекции FuGENE HD (Promega).Ретровирусы трансдуцировали в HRas - / - ; NRas - / - ; KRas lox / lox эмбриональные фибробласты мыши (MEF) с последующими 2 неделями отбора пуромицина (1 мкг / мл) в среде DMEM с добавлением 10% FBS, 100 мкг / мл пенициллина и 100 Ед / мл стрептомицина. Для получения клонов KRas lox KRAS MUT клетки затем культивировали в присутствии 4-гидрокситамоксифена (4OHT; Sigma, H7904) в течение еще 2 недель для достижения полной делеции эндогенных аллелей KRas .Клетки, индуцируемые доксициклином (Sigma, D9891) Flp-In T-REx 293, экспрессирующие KRAS G12D, G13D и Q61H, и их аналоги с мутацией D154Q получали в соответствии с инструкциями производителя (Thermal Fisher Scientific). Вкратце, конструкции содержат связанный с mCherry-h3B-P2A KRAS G12D , KRAS G13D , KRAS Q61H , а аналоги с мутацией D154Q котрансфицировали с pOG44 в клетки Flp-In T-REx 293 с последующими 2 неделями. селекции гигромицина (100 мкг / мл) и бластицидина (15 мкг / мл) в среде DMEM с добавлением 10% Tet-free FBS (Omega Scientific, FB-15).Доксициклин (2 нг) был добавлен для индукции экспрессии белка и инициации димеризации РАС (8). Все клеточные линии, использованные в исследовании, дали отрицательный результат на Mycoplasma , как определено с помощью набора праймеров для ПЦР Mycoplasma Plus (Agilent), а последний тест был проведен в декабре 2019 года. Продолжительность времени между размораживанием и использованием в описанных экспериментах составляла всегда <3 месяцев.

Анализ клеточного теплового сдвига

Термическую стабильность белка оценивали с помощью анализа клеточного теплового сдвига (CETSA), как описано ранее (18).Клетки HEK293T котрансфицировали мутантами KRAS и c-RAF или p110α в течение 48 часов с добавкой 10% FBS; затем образцы белка подвергали термической обработке с помощью ПЦР-аппарата. Затем полученные супернатанты тестировали с помощью Вестерн-блоттинга.

Анализ RAS-GTP

Клетки HEK293T выращивали в 10% FBS, и уровни RAS-GTP оценивали с помощью набора Active Ras Pull-down Detection Kit (Thermal Fisher Scientific) с использованием Raf-1-RBD и p110γ-RBD, слитых с GST для связывают активный (GTP-связанный) RAS.Белковые лизаты (500 мкг) инкубировали со 100 мкл глутатионовой смолы и доменами связывания белка GST в течение 1 часа при 4 ° C для захвата активных малых GTPases в соответствии с протоколом производителя. После промывки связанную GTPase выделяли путем элюирования слитого с GST белка из глутатионовой смолы. Очищенную ГТФазу детектировали с помощью вестерн-блоттинга с использованием антитела против RAS.

Вестерн-блот-анализ

Клетки из in vitro культуры , ex vivo эксплантатов или образцов опухолей пациентов с немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ) лизировали в буфере для лизиса RIPA (Thermo Fisher Scientific) с добавлением протеазы и фосфатазы ингибиторные коктейли (Sigma).Интересующие белки зондировали соответствующими антителами. Первичные антитела включали анти-RAS (Cell Signaling Technology, 3339), анти-HA (Cell Signaling Technology, 2367), анти-HSP90 (Santa Cruz Biotechnology, sc-7947), анти-pAKT (Ser473, Cell Signaling Technology, 4060). , anti-AKT (Cell Signaling Technology, 9272), anti-pERK1 / 2 (Cell Signaling Technology, 4370), anti-ERK (Cell Signaling Technology, 4695), anti-pMEK (Cell Signaling Technology, 9154), anti-MEK (Cell Signaling Technology, 8727), анти-pS6 (Ser235 / 236, Cell Signaling Technology, 4858), рибосомный белок анти-S6 (Cell Signaling Technology, 2217), анти-pc-RAF (Ser259, 9421; Ser338, 9427) , анти-c-RAF (Cell Signaling Technology, 53745), анти-c-RAF (Santa Cruz, sc-227) и анти-BIM (Cell Signaling Technology, 2933).Вторичные антитела включали связанный с HRP антикроличий IgG (Cell Signaling Technology, 7074) и антимышиный IgG (Cell Signaling Technology, 7076).

Анализы обмена гуаниновых нуклеотидов

Белки KRAS были предварительно загружены 2 '/ 3'-O- ( N -метилантранилоил) -гуанозин-5' - [(β, γ) -имидо] трифосфатом (Mant-GppNHp ; Jena Biosciences) в 20 ммоль / л Трис pH 7,5, 50 ммоль / л NaCl, 200 ммоль / л (NH 4 ) 2 SO 4 и 0,1 ммоль / л EDTA в течение 2 часов при 25 ° C .Загруженные Mant белки KRAS заменяли на 20 ммоль / л Tris pH 7,5, 150 ммоль / л NaCl, 5 ммоль / л MgCl 2 и 5 ммоль / л EDTA с использованием колонок для обессоливания с вращением Zeba (Thermo Fisher Scientific). Белки KRAS, нагруженные Mant, разбавляли 8 мкмоль / л и инкубировали с p110γ-RBD при 25 ° C в течение 1 часа. Диссоциацию нуклеотидов инициировали добавлением 500-кратного избытка немеченого GTP, и скорость диссоциации нуклеотидов определяли по испусканию флуоресценции при 448 нм (возбуждение 365 нм) с использованием планшет-ридера Synergy NEO (BioTek Instruments).

Образцы человека

Образцы опухолей были получены от 1006 пациентов с НМРЛ во время операции в больнице Дапин и Научно-исследовательском институте хирургии Третьего военно-медицинского университета (Чунцин, Китай). Вестерн-блоттинг и ИГХ-анализы проводили, как описано ранее (19). Оценка окрашивания проводилась независимо двумя патологами без знания клинико-патологических данных. Мутация KRAS, EGFR, PI3K, ALK и BRAF была обнаружена с помощью жидкого чипа SurPlex в SurExam Bio-Tech Co.Ltd. Это исследование было одобрено Советом по этике исследований больницы Daping и Научно-исследовательского института хирургии.

Гистопатология и IHC

Опухолевые ткани пациентов с НМРЛ фиксировали в 10% забуференном формалине (Sigma), заливали парафином и делали срезы толщиной 4 мкм. Срезы тканей окрашивали гематоксилином и эозином (H&E) и выполняли гистопатологический анализ. ИГХ выполняли, как описано ранее (19), и интенсивность окрашивания ИГХ оценивали как 0, 1, 2 и 3 (0 - нет; 1 - слабое окрашивание; 2 - умеренное окрашивание; 3 - сильное окрашивание).Все патологические анализы и оценка IHC были выполнены двумя независимыми патологами. Чтобы оценить процент pAKT- или pERK-положительных окрашивающих клеток, были случайным образом выбраны пять полей для каждого среза (при × 40), подсчитано количество положительных окрашиваемых клеток для каждого поля, а затем средний процент клеток, которые положительно окрашены. был рассчитан. H-балл применялся для оценки pAKT и pERK в соответствии со следующей формулой: H-балл = слабая интенсивность (1) × процент + умеренная интенсивность (2) × процент + сильная интенсивность (3) × процент.Для иммуноокрашивания использовали следующие антитела: pERK (Cell Signaling Technology, 9101) и pAKT (Cell Signaling Technology, 4060).

Экспрессия и очистка белка

Была синтезирована конструкция, кодирующая оптимизированный по кодонам N-концевой вирус травления гистамина табака (TEV) -KRAS Q61H в векторе pJExpress (DNA2.0), который был использован для трансформации клеток BL21 (DE3). . Клетки выращивали в бульоне Луриа (LB) до OD600 0,9 и индуцировали 0,5 моль / л изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) в течение 16 часов при 16 ° C.Клетки осаждали и ресуспендировали в буфере для лизиса [20 ммоль / л фосфата натрия (pH 8,0), 500 ммоль / л NaCl, 10 ммоль / л имидазола, 1 ммоль / л 2-меркаптоэтанола (BME), 5% (об. / Об.). глицерин], содержащий 1 мг / мл ФМСФ и бензамидин в качестве ингибитора протеазы. Лизаты быстро замораживали и хранили при -80 ° C до использования. Белок очищали с помощью картриджа IMAC (Bio-Rad), следуя стандартным протоколам Ni-сродства, и обессоливали в HEPES 20 ммоль / л (pH 8,0), 150 ммоль / л NaCl, 5 ммоль / л MgCl 2 и 0,5 ммоль / л. L буфер DTT.N-концевую метку His расщепляли путем 24-часового переваривания протеазой TEV в соотношении 1:10 при 4 ° C, а TEV с меткой His удаляли обратной очисткой на картридже IMAC. Белок концентрировали до 30 мг / мл на фильтре Amicon с отсечкой 10 кДа (Millipore), разделяли на аликвоты, а затем быстро замораживали и хранили в жидком азоте до использования. Выходы составляли приблизительно 8 мг очищенного мутанта Q61H KRAS на литр культуры.

Raf-1-RBD 1-149 и p110γ-RBD 206-311 были экспрессированы в BL21 (DE3) E.coli . Клетки индуцировали 1 ммоль / л IPTG (A 600 от 0,6 до 0,8) в течение 3 часов при 37 ° C, затем гомогенизировали в PBS, содержащем 1 ммоль / л EDTA, 1% Triton X-100 и 1% ингибитор протеазы. . Лизат центрифугировали и полученный супернатант очищали на колонке GST. Очищенные RBD подвергали быстрой заморозке и хранили при -80 ° C до использования. Выходы составили приблизительно 10 мг очищенного Raf-1-RBD и приблизительно 4 мг очищенного p110γ-RBD на литр культуры.

Раствор для кристаллизации и структурирования

Вариант KRAS Q61H, нагруженный GDP, концентрировали до 30 мг / мл.Первоначальные испытания кристаллизации были выполнены с помощью робота-кристаллизатора Mosquito (TTPLabTech) методом «сидя-капля» (100 нл белка плюс 100 нл раствора для кристаллизации). Непосредственно перед кристаллизацией устанавливают 20 ммоль / л GTP с добавлением белка. Наблюдается начальное попадание при 20 ° C с 0,1 моль / л MMT и 24% PEG 6000. Размер и качество кристаллов были улучшены с использованием испытаний кристаллизации висячим / сидячим способом. Дифракционные данные были собраны на канале SBC 19-ID, Advanced Photon Source в Аргоннской национальной лаборатории и обработаны с помощью HKL3000 (20).Кристалл принадлежит примитивной орторомбической симметрии и дифрагирован до 2,19 Å. Структура Q61H была решена путем молекулярной замены с использованием PHASER в пакете CCP4 (21), со структурой KRAS WT (PDB ID: 4OBE), использованной в качестве модели поиска. В асимметричном блоке шесть молекул KRAS Q61H (содержание растворителя 47,5%). После PHASER мы могли видеть четкую плотность GTP в сайте связывания нуклеотидов в каждой из шести моделей. Coot (22) использовался для построения модели, а PHENIX (23) использовался для уточнения на 2.Разрешение 19 Å. Окончательная атомная модель содержит шесть GTP для каждой из шести копий комплекса GTP-Q61H, а качество структуры отслеживается с помощью MolProbity (24). Среднеквадратичные значения RMSD рассчитываются с помощью сценария lsqkab в наборе CCP4 для сравнения структур, а для структурных фигур используется PyMOL (система молекулярной графики PyMOL, версия 1.5.0.4 Schrödinger, LLC).

Моделирование молекулярной динамики

Пакет Schrödinger на платформе Maestro (выпуск Schrödinger 2016–2, Maestro, версия 10.6, Schrödinger, LLC) был использован для проведения молекулярной динамики. Системы были приготовлены из кристаллических структур высокого разрешения мутанта KRAS G12D , связанного с ЗНЧ (PDB ID: 5USJ), которые были подготовлены для построения модели с использованием модуля подготовки белка, включая добавление недостающих атомов, отнесение Н-связи и ограниченную минимизацию. . Все системы моделирования были нейтрализованы добавлением нейтрализующих заряд противоионов на буферном расстоянии 10 Å в модели растворителя SPC. Исключенная для ионов область не была включена.Моделирование 50 нс было выполнено с использованием модуля Desmond Molecular Dynamics с постоянной температурой (300 K) и давлением (1,0 бар) в ансамбле NPT.

Анализ FRET

Анализ FRET выполняли, как описано ранее (12). Вкратце, клетки HEK293T котрансфицировали парными слитыми с CFP и YFP конструкциями KRAS и конструкциями c-RAF в условиях 10% FBS в 2-луночном покровном стекле с камерами (Lab-Tek). Через 36-48 часов визуализацию живых клеток проводили с использованием конфокального / многофотонного микроскопа Zeiss LSM880.Данные были собраны из трех биологических повторов и от 10 до 12 различных клеток в разных полях из одного и того же покровного стекла, выбранного для микроскопии. Количественный анализ проводили с использованием программного обеспечения ZEN (ZEISS).

Расчет отношения зависимости D154Q

Вестерн-блоттинг количественно определяли, как описано выше. Соотношения pERK для WT по сравнению с образцами, содержащими D154Q, рассчитывали следующим образом.

где pERK - это отношение pERK к tERK.

Оценка роста с помощью IncuCyte

KRas lox KRAS MUT Клетки (1 × 10 3 ) высевали в 96-луночные планшеты в 150 мкл полной среды DMEM.На следующий день планшеты обрабатывали селуметинибом (Selleck Chem, 100 нмоль / л), траметинибом (Selleck Chem, 10 нмоль / л) или RAF709 (Selleck Chem, 1 мкмоль / л) по отдельности или в комбинации и инкубировали в IncuCyte. Масштабирование для получения изображений в реальном времени с тремя полями на лунку при увеличении × 10 каждые 2 часа. Данные были проанализированы с использованием программного обеспечения IncuCyte Confluence версии 1.5, которое количественно определяло покрытие площади поверхности клеток как значения конфлюэнтности. Эксперименты IncuCyte проводили в трех повторностях. Для каждого состояния показана одна репрезентативная кривая роста.

Для оценки влияния D154Q на рост клеток, индуцируемые доксициклином клетки Flp-In T-REx 293 (1 × 10 3 ), экспрессирующие KRAS G12D, G13D и Q61H, и их аналоги с мутацией D154Q были засеяны черным цветом 96 -луночные планшеты с прозрачным дном в 200 мкл полной среды DMEM с добавкой доксициклина (2 нг), инкубированные в IncuCyte Zoom для визуализации в реальном времени, с тремя полями, отображаемыми на лунку при увеличении × 10 каждые 4 часа. Данные были проанализированы с использованием программного обеспечения IncuCyte, которое считало ядро ​​эритроцитов (местоположение mCherry-h3B) как количество клеток.Эксперименты IncuCyte проводили в трех повторностях.

Анализ чувствительности к лекарствам

Чувствительность

к ингибиторам MEK и RAF была протестирована в KRAS G12D и KRAS Q61H , экспрессирующих на Ras клеток MEF меньше при лечении по отдельности или в комбинации. Клетки (1 × 10 3 ) высевали в 96-луночные планшеты в полной среде DMEM. На следующий день клетки обрабатывали только селуметинибом, траметинибом или RAF709, используя схему 10-точечного титрования дозы от 1 нмоль / л до 10 мкмоль / л, от 1 нмоль / л до 1 мкмоль / л и от 1 нмоль / л. L до 10 мкмоль / л соответственно.Кроме того, клетки получали комбинаторную обработку селуметинибом или траметинибом в различных концентрациях и фиксированной концентрации RAF709 на уровне 1 мкмоль / л; или с RAF709 в различных концентрациях и фиксированной концентрации селуметиниба и траметиниба на уровне 1 мкмоль / л и 10 нмоль / л соответственно. Через 72 часа жизнеспособность клеток оценивали с помощью колориметрического анализа MTS (CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay Powder, Promega). Значения абсолютной ингибирующей концентрации (IC) рассчитывали с использованием четырехпараметрической аппроксимации логистической кривой.Все экспериментальные точки были результатом трех-шести повторений, и все эксперименты повторялись не менее трех раз. Данные отображались графически с помощью GraphPad Prism 5 для Windows (программное обеспечение GraphPad). Каждая точка (среднее ± стандартное отклонение) представляет рост обработанных клеток по сравнению с необработанными клетками. Кривые были подогнаны с использованием модели нелинейной регрессии с сигмоидальным ответом на дозу.

Анализ синергии лекарственного средства

Клетки высевали при концентрации 1000 клеток на лунку в 384-луночный планшет и оставляли для осаждения в течение 24 часов.Затем клетки обрабатывали серийным разведением лекарств в формате 7 × 7 с количеством повторов до 6 на планшет с использованием цифрового диспенсера HP D300e. Еще через 72 часа в каждую лунку добавляли реагент CellTiter-Glo и считывание люминесценции оценивали с помощью считывающего устройства для планшетов POLARStar Omega. Затем рассчитывали относительную жизнеспособность путем деления показаний каждой лунки на показания необработанного контроля. Затем использовали программу Combenefit (25) для расчета баллов Bliss Synergy Score для каждой комбинации лекарств и построения графиков, где более высокие баллы указывают на большую синергию.Число звездочек под баллом синергизма указывает на статистическую значимость следующего: *, P <0,05; **, P <0,001; ***, P <0,0001.

Животные модели

Crl: NU- Foxn1 nu Мыши (самки в возрасте от 6 до 8 недель) были приобретены в Charles River Laboratories. KRas lox KRAS Клетки MUT (1 × 10 6 ) вводили подкожно в смеси 1: 1 бессывороточной среды DMEM и матригеля (без фенола красного; BD Biosciences) в оба бока мышей-реципиентов. .После образования пальпируемой опухоли измерения ежедневно производили штангенциркулем. Мышей, не получавших лекарственные препараты, с установленными опухолями размером от 240 до 300 мм 3 случайным образом распределяли либо на лечение селуметинибом, либо на носителе. Селуметиниб, солюбилизированный в 1% карбоксиметилцеллюлозе и 0,25% твине 80, вводился ежедневно через желудочный зонд (0,1 мл / 10 г массы тела) в дозе 50 мг / кг мышам, не получавшим лекарство. Животным, случайным образом распределенным в экспериментальные лечебные группы, вводили дозу через желудочный зонд без ослепления на любой стадии исследования.Оценки и вмешательства, связанные с благополучием, проводились ежедневно в течение периода лечения. Все виды ухода и лечения подопытных животных строго соответствовали правилам надлежащей практики в отношении животных, определенным Управлением по защите лабораторных животных США и одобренным Комитетом по уходу и использованию животных Института рака Дана-Фарбер.

Статистический анализ и анализ данных

Если не указано иное, данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. Значимость между двумя группами оценивалась с помощью двустороннего теста Стьюдента t .Наборы данных, состоящие из более чем 2 групп, были проанализированы с помощью ANOVA. Значение P , которое было меньше 0,05, считалось статистически значимым для всех наборов данных. Все статистические анализы были выполнены с использованием программного обеспечения GraphPad Prism. Статистический метод не использовался для предварительного определения размера выборки в исследованиях на животных. Исследователи были ослеплены во время оценки изменений размера опухоли после лечения.

Результаты

KRAS

Q61H предпочтительно связывается с c-RAF

Мы ранее оценили относительную аффинность связывания панели активирующих мутантов RAS для RAF в очищенной системе и нашли диапазон значений (16).Мы предположили, что это может привести к предпочтительным сигнальным событиям, но сочли, что сравнение с взаимодействиями с другими каноническими эффекторами RAS может дать дополнительную информацию. Мы применили три разных подхода, чтобы определить, взаимодействует ли KRAS Q61H преимущественно с c-RAF по сравнению с каталитической субъединицей PI3K типа I, также известной как p110α и p110γ, которая регулирует клеточный цикл, выживаемость, метаболизм и другие процессы (рис. . 1A; ссылка 26). В качестве контроля мы включили KRAS G12D , который, как было продемонстрировано, передает сигналы через пути как PI3K, так и MAPK (27), и KRAS G13D , который демонстрирует промежуточную аффинность связывания с RAF (16).Сначала мы использовали c-RAF-RBD или p110γ-RBD для подавления мутантного KRAS, экспрессированного в клетках HEK293T, в присутствии 10% FBS для стимуляции передачи сигналов RAS. Восстановление KRAS Q61H с помощью RAF-RBD было улучшено по сравнению с KRAS G12D , тогда как KRAS G12D продемонстрировало незначительное, хотя и статистически значимое, усиление связывания с p110γ-RBD по сравнению с KRAS Q61H (рис. 1B и C), подтверждая, что KRAS Q61H предпочтительно связывается с c-RAF-RBD.

Рисунок 1.

KRAS Q61H предпочтительно взаимодействует с RAF-RBD, чем с p110α / γ-RBD. A, Схематическая модель предпочтительных взаимодействий между KRAS G12D или Q61H и нижестоящими эффекторами RAF или p110. B, Иммунопреципитация мутантов RAS с меткой CFP с использованием RBD c-RAF или p110γ. Клетки HEK293T собирали после 48-часовой трансфекции мутантами KRAS, меченными CFP, в присутствии 10% FBS. Образцы белка подвергали анализу методом вытеснения и вестерн-блоттинга. IP, иммунопреципитация; WT, дикий тип; эксп, экспозиция. C, Количественное определение B демонстрирует усиление взаимодействия между c-RAF-RBD и KRAS Q61H по сравнению с KRAS G12D , но не с p110γ-RBD ( n = 3). D и E, KRAS Q61H усиливает термостабильность c-RAF, экспрессируемого в клетках HEK293T, по сравнению с другими мутациями RAS. Однако KRAS G12D увеличивает термостабильность субъединицы PI3K p110α по сравнению с другими мутациями RAS. Полоски представляют собой количественный анализ блотов, указанных выше.Клетки HEK293T собирали после 48-часовой котрансфекции мутантов KRAS c-RAF или p110α в присутствии 10% FBS. Образцы белка подвергали термическому воздействию, а полученные супернатанты подвергали анализу вестерн-блоттингом для тестирования оставшегося уровня c-RAF, p110α или RAS ( n = 3). Для всех гистограмм данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. * P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001 по сравнению с KRAS G12D (двусторонний дисперсионный анализ).

Чтобы оценить, происходят ли эти предпочтительные межбелковые взаимодействия также в клетках, мы использовали CETSA, который оценивает стабильность белка in situ (18). В этом методе белки, устойчивые к термической обработке, интерпретируются как стабилизированные другими факторами, в данном случае белками-партнерами. Мы сравнили KRAS G12D , KRAS WT и KRAS Q61H по способности взаимодействовать с c-RAF или p110α. c-RAF был более стабильным в присутствии KRAS Q61H по сравнению с KRAS WT или KRAS G12D , хотя KRAS G12D также в некоторой степени улучшал термостабильность c-RAF по сравнению с KRAS WT (Рис. .1D). С другой стороны, p110α был более устойчив к термическому воздействию в присутствии KRAS G12D и, в меньшей степени, KRAS Q61H , по сравнению с KRAS WT (рис. 1E). Мы также протестировали термостабильность KRAS, но не увидели статистической разницы между образцами KRAS-мутантов независимо от экспрессии c-RAF или p110α (дополнительные рисунки S1A и S1B).

В качестве другой стратегии мы протестировали скорость диссоциации нуклеотидов для KRAS G12D и KRAS Q61H в присутствии p110γ-RBD.Предполагается, что продуктивное связывание между RAS и p110γ-RBD замедлит диссоциацию нуклеотида от RAS. Мы наблюдали это для KRAS G12D , но не наблюдали стабилизирующего эффекта для KRAS Q61H , что свидетельствует об отсутствии взаимодействия между KRAS Q61H и p110γ-RBD в условиях этого анализа (дополнительные рисунки S1C и S1D). Взятые вместе, эти результаты подтверждают, что KRAS Q61H предпочтительно связывается с c-RAF по сравнению с p110α / γ по сравнению с KRAS G12D .

KRAS

Q61H NSCLC предпочтительно передает сигналы через MAPK

Асимметричные физические взаимодействия между KRAS Q61H или KRAS G12D и c-RAF или p110γ предсказывают, что соответствующие эффекты будут распространяться на внутриклеточную передачу сигналов. Мы предположили, что мутации KRAS Q61H у пациентов также будут демонстрировать предпочтительный паттерн передачи сигналов через MAPK по сравнению с PI3K / AKT. Чтобы изучить это, мы исследовали сигнальную активность MAPK и PI3K / AKT в образцах пациентов с НМРЛ.Мы проверили 1006 замороженных образцов пациентов с НМРЛ на наличие мутаций в KRAS, EGFR, PI3K, ALK или BRAF и выявили 59 случаев с мутациями KRAS (рис. 2A), что согласуется с зарегистрированной частотой мутаций в Азии. где частота мутаций EGFR высока (30% –40%), а частота мутаций RAS ниже (3–8%) (28, 29). Из них три содержали мутаций KRAS Q61H . Сводная информация об исследуемой популяции представлена ​​в дополнительной таблице S1.Мы случайным образом выбрали дополнительные образцы с мутациями KRAS WT или KRAS G12D для сравнения. По данным анализа IHC, обе онкогенные мутации KRAS показали более высокие уровни pAKT и pERK по сравнению с KRAS дикого типа. Однако, KRAS G12D -управляемый НМРЛ показал более выраженное окрашивание pAKT по сравнению с KRAS Q61H -содержащим НМРЛ (фиг. 2B и C). Для дальнейшей количественной оценки этих различий Вестерн-блоттинг опухолевых тканей показал значительно более высокий уровень передачи сигналов pERK в образцах KRAS Q61H по сравнению с образцами KRAS G12D , тогда как уровни pAKT были значительно выше в образцах KRAS G12D по сравнению с образцами КРАС Q61H (рис.2D и E; Дополнительный рис. S2A и S2B). Уровень RAS существенно не отличался в образцах KRAS G12D и KRAS Q61H (рис. 2D и E; дополнительный рис. S2A и S2B). Эти данные предполагают, что преимущественный выход сигнала KRAS Q61H через сигнальный путь MAPK также происходит в клинических образцах NSCLC.

Рис. 2.

образцов пациентов с НМРЛ показывают дифференциальный выходной сигнал AKT и ERK для KRAS G12D и KRAS Q61H . A, Результаты скрининга образцов пациентов с НМРЛ на мутации KRAS. Всего было отобрано 1006 образцов опухолей пациентов с НМРЛ для секвенирования KRAS, EGFR, PI3K, ALK и BRAF , и три образца были мутантами KRAS Q61H . B, IHC окрашивание на pAKT и pERK в образцах пациентов демонстрирует повышенный pERK у пациентов с KRAS Q61H по сравнению с KRAS G12D и повышенный pAKT у пациентов с KRAS G12D по сравнению с KRAS Q61H .Шкала 100 мкм. WT, дикий тип. C, H-баллов уровней pAKT и pERK для образцов, окрашенных ИГХ ( n = 15). D и E, Репрезентативные блоты и связанный количественный анализ замороженных образцов ткани для pAKT и pERK в образцах пациентов с НМРЛ ( n = 3). нс, значения не имеет. Для всех графиков данные представлены как среднее ± стандартное отклонение.

Гипердинамический переключатель 2 объясняет предпочтительную передачу сигналов MAPK.

Селективные предпочтительные взаимодействия KRAS Q61H для MAPK утверждают, что мутация Q61H вызывает структурные изменения в KRAS Q61H , которые не наблюдаются в KRAS G12D .Мы решили рентгеновскую кристаллическую структуру KRAS Q61H , лишенную гипервариабельного С-концевого домена (остатки 1-169) в комплексе с GTP (рис. 3A – F; дополнительная таблица S2). Тот факт, что мы смогли использовать GTP вместо негидролизуемого аналога, является замечательной демонстрацией незначительной активности GTPase этого мутанта (16), поскольку кристаллизация белка занимает от 2 до 3 дней. Кристаллы находились в пространственной группе P2 1 2 1 2 1 , так что шесть молекул находились в асимметричной единице.Однозначная электронная плотность наблюдалась для всех молекул, за исключением двух остатков в молекуле A и трех остатков в молекуле F (отсутствующие остатки: цепь A 64 и 65; цепь F 62–64). Плотность наблюдалась также для GTP, иона магния и молекул воды (рис. 3B). Конформация напоминает ранее описанные структуры RAS, связанные с аналогом GTP, за исключением перестройки переключателя 2, которая, когда все 6 молекул из асимметричной единицы накладываются и сравниваются, представляет собой ансамбль конформаций основной цепи и остатка 61 боковой цепи (RMSD 4.6 Å) внутри кристаллической решетки (рис. 3G). Это не похоже на предыдущие структуры RAS, связанные с GTP-аналогом, включая KRAS Q61H -GMPPNP (PDB ID: 3GFT), HRAS G12D -GMPPNP (PDB ID: 1AGP), KRAS G12D -GMPPNP (PDB ID: 5USJ). и HRAS G12C -GMPPNP (PDB ID: 4L9W), где положение боковых цепей кодона 61 обычно выравнивается (RMSD 0,8 Å), примерно в 6 Å от γ-фосфата (фиг. 3H). Средние B-факторы остатков переключателя 2 примерно в 2 раза выше, чем у остальных структур, что отражает их динамический характер.С другой стороны, переключатель 1 хорошо упорядочен и напоминает ранее описанное «состояние 2» GTP-привязанного RAS (30).

Рисунок 3.

Кристаллическая структура KRAS Q61H : GTP. A - F, Сравнение рентгеновских кристаллических структур KRAS Q61H и KRAS G12D , демонстрирующих изменения в конформации переключателя 2 (зеленый). Желтый, переключатель 1; палочки, ГТП. Разница Фурье F o -F c Карта электронной плотности GTP на уровне контура 3σ показана зеленым цветом в B . G, Наложение 6 молекул в асимметричной кристаллографической единице выявляет ансамбль основной цепи и конформаций His61 в KRAS Q61H . H, Сравнение структур HRAS G12C : GMPPNP (4L9W) в светло-пурпурном цвете, KRAS Q61H : GMPPNP (3GFT) в темно-лососевом цвете, HRAS G12D : GMPPNP (1AGP) в бледно-желтом, KRAS G12D 900 : GMPPNP (5USJ) в сланце, Mg 2+ в сфере (пурпурный), а GTP и Gln61 в стержнях. I, Расстояния между азотом боковой цепи остатка 61 и γ-фосфатом GTP показаны красным и синим соответственно для KRAS Q61H и KRAS G12D . J, Расстояние между азотом боковой цепи остатка 61 (Q или H) и γ-фосфатом GTP в течение времени моделирования 50 нс.

Учитывая набор положений боковой цепи в остатке 61, мы пришли к выводу, что измененные взаимодействия при мутации Gln в His управляют конформационной динамикой переключателя 2. Чтобы дополнительно продемонстрировать этот эффект, мы выполнили моделирование молекулярной динамики, продолжающееся более 50 нс с использованием высокого Рентгеновская структура разрешения KRAS G12D -GNP (PDB ID: 5USJ) в качестве затравочной модели.При моделировании, относящемся к KRAS Q61H , боковая цепь остатка 61 была компьютерно мутирована в His без дополнительных изменений. Мы исследовали расстояния между азотом боковой цепи остатка 61 (Q или H) и γ-фосфатом GTP в ходе моделирования (рис. 3I). По сравнению с Q61, H61 быстро удаляется от гамма-фосфата на ранних этапах моделирования и имеет тенденцию оставаться отделенным (рис. 3J). Чтобы рационализировать этот эффект, мы посчитали, что в других GTP-связанных структурах RAS, за исключением других мутантов Q61, Q61 обычно участвует в сети водородных связей, включающей несколько боковых цепей, молекулы воды и атомы кислорода фосфата (дополнительный рис.S3A и S3B). Это включает вклад Gln61, Glu62, Tyr64, Ala68 и Tyr96, которые, согласованно, удерживают переключатель 2 в «закрытой» конформации, приводя большинство этих боковых цепей в непосредственную близость с гамма-фосфатом, как видно в структуре KRAS. G12D -GMPPNP (ID PDB: 5USJ; дополнительный рисунок S3B). Следует отметить, что мостиковые воды, которые обычно играют роль в катализе, являются ключевыми компонентами этих взаимодействий (31). С мутацией Gln в His в положении 61 боковая цепь больше не взаимодействует с ключевой мостиковой водой, что приводит к поломке в оставшейся сети и неограниченному переключению 2 (рис.3G – I). Неограниченный гипердинамический переключатель 2, который существенно не взаимодействует с соседним переключателем 1, как ожидается, обеспечит более стабильную конформацию переключателя 1. Это связано с тем, что переключатель 2 имеет способность вызывать более динамическое поведение переключателя 1 при нормальных обстоятельствах (32, 33). Более стабильная конформация switch 1 может привести к улучшенным взаимодействиям с RAF, т.к. switch 1 служит первичным интерфейсом для взаимодействий RAS-RAF (34).

Моделирование нашей структуры в предшествующих структурах RAS в комплексе с эффекторными белками обеспечивает дополнительную возможную причину, почему динамический переключатель 2 может приводить к дифференциальным взаимодействиям RAS-эффектор.Мы наложили нашу модель KRAS Q61H -GTP на модель HRAS G12V -GNPPNP-p110γ (PDB ID: 1HE8) и HRAS-GNPPNP-RAF-RBD (4G0N). Мы отметили, что повышенная гибкость переключателя 2 может конфликтовать с p110γ, особенно с Tyr64 из KRAS Q61H и Phe221 из p110γ, которые находятся в тесном контакте (дополнительные рисунки S4A и S4B). Однако с помощью RAF-RBD мы отмечаем, что повышенная гибкость переключателя 2 может улучшить взаимодействие между переключателем 1 и RBD (дополнительный рис.S4C; исх. 33). В совокупности эти наблюдения предполагают два возможных структурных механизма, с помощью которых KRAS Q61H может способствовать связыванию с RAF-RBD по сравнению с p110α / γ-RBD.

KRAS

Q61H Олигомеризация и димеризация c-RAF взаимозависимы

На взаимодействия между RAS и p110α / γ или c-RAF также могут влиять взаимодействия RAS-RAS, которые, как ранее было показано, важны для RAS WT - зависимое подавление роста клеток (12). Взаимозависимость взаимодействий RAS-RAS и RAF-RAF также казалась возможной, учитывая, что оба, как известно, образуют комплексы, и взаимодействия между c-RAF и RAS необходимы для преодоления аутоингибиторной функции N-концевой регуляторной области c-RAF (NTR). , позволяя c-RAF димеризоваться на клеточной мембране (35).Кроме того, «кооперативность» между RAS и RAF является компонентом предложенных механизмов парадоксальной передачи сигналов MAPK в присутствии ингибиторов RAF (36, 37). Следует отметить, что мы не ожидали увидеть такую ​​совместимость с PI3K, потому что, как известно, мультимеризация PI3K не происходит. Более того, экстраполяция, основанная на структуре HRAS-p110γ (38), для включения p110γ в нашу модель димера RAS предсказывает против любого взаимодействия между отдельными протомерами p110, связанными с димеризованным RAS (дополнительный рис. S5). Учитывая повышенное сродство KRAS Q61H к RAF и отсутствие активности GTPase в KRAS Q61H , что, как ожидается, позволит обеспечить стабильное комплексообразование, мы предположили, что KRAS Q61H , в частности, может проявлять зависимость от образование димеров RAF.Предыдущие исследования показали, что замены D154Q в KRAS было достаточно, чтобы нарушить взаимодействия KRAS-KRAS на клеточной мембране, которые происходят через интерфейс KRAS α4 – α5, но не изменили базовые биохимические свойства KRAS, такие как активность GTPase или сродство к RAF ( 39). Мутация D154Q также устраняет подавляющие эффекты KRAS WT , наблюдаемые в генетическом фоне онкогенных KRAS. Это было показано в Ras без модели MEF in vitro и in vivo , а также на множественных линиях раковых клеток.Наша интерпретация заключалась в том, что подавляющие эффекты KRAS WT происходят через прямые взаимодействия RAS-RAS (12). Здесь мы использовали ту же мутацию для изучения влияния D154Q в контексте RAS Q61H . Удивительно, но добавление D154Q ухудшило захват KRAS Q61H c-RAF, но не изменило восстановление KRAS WT , KRAS G12D или KRAS G13D . С другой стороны, D154Q не влиял на восстановление с помощью p110γ (рис. 4A – C). Вместе эти результаты предполагают, что мультимеризация KRAS влияет на взаимодействия с c-RAF для KRAS Q61H , но не p110γ в этом клеточном контексте.

Рисунок 4. Мультимеризация

RAF и KRAS Q61H осуществляется совместно. A, Иммунопреципитация активной формы меченных CFP KRAS WT, G12D, G13D и Q61H и аналогов с мутантами D154Q с использованием RBD c-RAF или p110γ. D154Q был добавлен для предотвращения мультимеризации RAS. Клетки HEK293T собирали после 48-часовой трансфекции мутантами KRAS, меченными CFP, в присутствии 10% FBS. Образцы белка подвергали анализу методом вытеснения и вестерн-блоттинга. IP, иммунопреципитация; WT, дикий тип. B и C, Количественное определение A показывает, что мультимеризация KRAS Q61H влияет на взаимодействия с c-RAF, но не с p110γ. Данные были нормализованы до KRAS G12D , и уровень RAS-GTP для мутантов KRAS сравнивался в присутствии или отсутствии мутации D154Q ( n = 3). D, Эмиссия CFP после фотообесцвечивания указывает на мультимеризацию CFP и KRAS, слитых с YFP. Все мутанты KRAS, за исключением Q61H, сохраняют способность к димеризации независимо от экспрессии экзогенного c-RAF, включая димер-некомпетентную форму R89L.Клетки HEK293T котрансфицировали конструкциями c-RAF, CFP-KRAS и YFP-KRAS и подвергали конфокальной микроскопии для анализа FRET. E, Схема взаимодействия РАН и РАФ. Слева - кооперативный гетеротетрамер RAS-RAF, включающий ауторегуляторные домены CRD и RBD эндогенного c-RAF (синий). В середине: введение экзогенного c-RAF R89L (зеленый) нарушает мультимеризацию KRAS Q61H путем гетеродимеризации с эндогенным c-RAF. Однако введение экзогенного c-RAF R89L / R401H , который не может димеризоваться с эндогенным c-RAF, позволяет извлекать димеры KRAS (справа).CRD, богатый цистеином домен; RBD, Ras-связывающий домен; KD, киназный домен. F, Эмиссия CFP после фотообесцвечивания указывает на мультимеризацию между KRAS G12D , слитыми с CFP и YFP, и KRAS Q61H . Введение R401H в c-RAF R89L восстановило сигнал FRET для KRAS Q61H . Анализы FRET проводили на клетках HEK293T, котрансфицированных c-RAF, CFP-KRAS и YFP-KRAS конструкциями с помощью конфокальной микроскопии. G, FRET от мультимеризации флуоресцентно-меченного c-RAF не наблюдается по димер-разрушающей мутации D154Q в KRAS.Клетки HEK293T котрансфицировали конструкциями c-RAF-CFP, c-RAF-YFP и KRAS и подвергали конфокальной микроскопии для анализа FRET. Все данные FRET представлены как среднее ± SEM. H, Передача сигнала в клетках HEK293T демонстрирует предпочтение передачи сигналов MAPK для KRAS Q61H по сравнению с KRAS G12D и KRAS G13D . Клетки HEK293T собирали после 48-часовой котрансфекции мутантов KRAS в присутствии 10% FBS. Образцы белка подвергали анализу вестерн-блоттингом для проверки сигналов RAS. I, Количественное сравнение отношения «димерной зависимости», состоящего из отношения между нормализованным сигналом MAPK (pERK / t-ERK) или PI3K (pAKT / t-AKT) для димер-компетентного и димер-поврежденного (D154Q) KRAS. Это демонстрирует разницу в димер-зависимой передаче сигналов для MAPK, но не для PI3K для KRAS G13D и KRAS Q61H . Для всех графиков, относящихся к блотам, данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. *, P <0,05; **, P <0,01; ***, P <0.001 (двусторонний дисперсионный анализ). нс, значения не имеет.

Для дальнейшей оценки взаимозависимости между взаимодействиями RAS и RAF мы использовали анализ FRET на основе клеток, чтобы изучить влияние взаимодействий c-RAF на KRAS и мультимеризацию c-RAF (12). В анализе RAS донор CFP и акцептор YFP сливаются с N-концом KRAS (дополнительный рисунок S6A – S6F). Если CFP и YFP смежны, CFP возбуждается, и энергия передается в YFP. Однако эмиссия CFP увеличивается при фотообесцвечивании из-за потери поглощения энергии YFP.Если CFP и YFP пространственно разделены, никаких изменений в эмиссии CFP не наблюдается из-за отсутствия передачи энергии от CFP к YFP (см. Дополнительный рисунок S3B ссылки 12 для схемы принципа анализа). KRAS WT и KRAS G12D показали FRET в присутствии c-RAF WT , который был минимально ослаблен введением R89L в c-RAF, мутации, которая, как известно, нарушает взаимодействие RAF – RAS для WT или KRAS . G12D (рис. 4D; дополнительные рис.S6A и S7A; исх. 40). Однако мультимеризация KRAS Q61H не была обнаружена с введением R89L, что позволяет предположить, что KRAS Q61H зависит от c-RAF для мультимеризации (рис. 4D).

Мы отметили, что взаимодействие RAS-RAS также может быть обнаружено без введения экзогенного c-RAF в присутствии 10% FBS (дополнительный рисунок S6B и S6C), предполагая, что эндогенного c-RAF достаточно для влияния на RAS. мультимеризация. Мы предположили, что экзогенный c-RAF R89L действует опосредованно на мультимеризацию RAS, секвестрируя эндогенный RAF посредством мультимеризации RAF, что приводит к потере сигнала FRET (рис.4E). Чтобы подтвердить это, мы ввели вторую мутацию R401H, которая, как известно, нарушает мультимеризацию RAF-RAF, чтобы высвободить любую секвестрацию эндогенного RAF (41). В соответствии с гипотезой экзогенный c-RAF R89L / R401H восстановил мультимеризацию KRAS Q61H (фиг. 4F; дополнительные фиг. S6D и S7A). Следует отметить, что передача сигналов MAPK в образцах клеток, используемых для FRET, соответствовала результатам FRET (дополнительный рисунок S7B). В частности, сверхэкспрессия экзогенного c-RAF R89L снижает фосфорилирование c-RAF и ERK и для всех форм KRAS.Однако эффект был более заметным в контексте KRAS Q61H (дополнительный рис. S7B), предполагая, что KRAS Q61H регулируется мультимеризацией RAF. Также аналогично результату FRET, введение комбинации мутаций R401H и R89L в c-RAF восстановило pERK для KRAS Q61H , но не KRAS G12D (дополнительный рис. S7B), предполагая, что высвобождение изолированного эндогенного RAF приводит к восстановлению взаимозависимого комплекса c-RAF-KRAS Q61H , но такая же взаимозависимость с c-RAF не применяется к KRAS G12D .В совокупности эти результаты подтверждают, что мультимеризация c-RAF имеет решающее значение для регулирования на уровне KRAS Q61H , но в меньшей степени для KRAS G12D .

Доступность этой системы также позволила нам изучить, может ли мультимеризация KRAS аналогичным образом повлиять на мультимеризацию c-RAF. Этот вопрос возникает из работы, показывающей, что определенные мутации RAF зависят от RAS для мультимеризации RAF (42). Мы измерили зависимость мультимеризации RAF от мультимеризации RAS с помощью теста c-RAF FRET, аналогичного в принципе анализу мультимеризации RAS.Этот анализ также аналогичен по концепции ранее описанным тестам BRET, используемым для измерения взаимодействий RAF (43). В этом анализе мультимеризация c-RAF требовала сверхэкспрессии экзогенного KRAS, но была потеряна при введении D154Q, демонстрируя, что мультимеризация c-RAF зависела от мультимеризации RAS (рис. 4G; дополнительный рис. S6E и S6F). Взятые вместе, эти результаты показывают, что события мультимеризации KRAS Q61H и c-RAF взаимозависимы.

KRAS

Q61H -опосредованная передача сигналов MAPK зависит от мультимера RAS

Чтобы понять, трансформируется ли взаимозависимость димеров RAF и KRAS в биологические различия в передаче сигналов клеток, мы исследовали KRAS Q61H и KRAS G12D -зависимую передачу сигналов в HEK293T. клетки, экспрессирующие экзогенные мутантные белки KRAS, с акцентом на pERK и pAKT в качестве индикаторов.В соответствии с исследованиями связывания и анализом тканей пациента (рис. 1B и C; рис. 2D и E), KRAS Q61H показал усиленную активацию ERK по сравнению с AKT, в то время как KRAS G12D показал активацию как ERK, так и AKT (рис. 4H). Добавление мутации D154Q значительно снизило уровни pERK, в то время как уровни pAKT были меньше затронуты. Чтобы лучше оценить влияние мутаций RAS на мультимеризацию путей MAPK по сравнению с PI3K, мы количественно оценили «соотношение зависимостей D154Q», которое состоит из отношения pERK или pAKT в присутствии WT по сравнению с мутировавшим D154Q KRAS, как определено в разделе методов.Передача сигналов MAPK, ассоциированная с KRAS Q61H , была высокочувствительна к D154Q по сравнению с KRAS G13D и KRAS G12D (фиг. 4I). Кроме того, для G13D и Q61H передача сигналов MAPK была чувствительна к D154Q, тогда как передача сигналов PI3K - нет. Эти результаты отражались в характере роста этих клеток, так что введение D154Q в экзогенно экспрессируемый KRAS также нарушало рост клеток (дополнительная фигура S8). В совокупности эти результаты подтверждают, что предпочтительные взаимодействия между KRAS Q61H и c-RAF зависят от мультимеризации RAS, чтобы производить непропорционально повышающую регуляцию передачи сигналов пути MAPK по сравнению с PI3K / AKT.

KRAS Q61H является маркером чувствительности к ингибиторам MEK и аллостерическому ингибитору RAF in vitro и in vivo

Наблюдения, что KRAS Q61H преимущественно передает сигнал через MAPK и зависит от мультимеризации RAF повышает вероятность того, что клетки, несущие KRAS, Q61H, , , будут чувствительны к ингибиторам этих механизмов. В частности, мы ожидали, что ингибиторы RAF, которые действуют в контексте димера RAF, такие как RAF709 (44), будут проявлять повышенную активность в KRAS Q61H .Мы подвергли изогенные RAS-зависимые клетки MEF (12) действию ингибиторов MEK - селуметиниба, траметиниба и RAF709. Эта система происходит от MEF без Ras (17), в которых эндогенные аллели HRas и NRas конститутивно нокаутированы, а условные аллели KRas находятся под контролем резидентной 4OHT-индуцируемой рекомбиназы CRE, так что рост клеток зависит от введения экзогенного гена Ras . Для этих экспериментов мы использовали MEF с HA-меткой человека KRAS G12D и KRAS Q61H (здесь обозначены как KRas lox KRAS MUT ). KRas lox KRAS Q61H MEF были более чувствительны к лечению селуметинибом и траметинибом, чем MEF KRas lox KRAS G12D MEF для роста и пролиферации клеток. Значения IC 50 для селуметиниба и траметиниба были примерно в 5 раз ниже для Q61H по сравнению с G12D (рис. 5A и B). Однако мы отметили примерно 15-кратную разницу при воздействии RAF709 (рис. 5C) в пользу Q61H. Аналогичный эффект наблюдался как для общей кинетики пролиферации, так и для кинетики роста (рис.5D). Совместное лечение с RAF709 значительно снизило IC 50 до селуметиниба и траметиниба как в KRas lox KRAS G12D , так и в KRas lox KRAS Q61H MEF, тогда как дальнейшее лечение селуметинибом или траметинибом одновременно 50 к RAF709 (дополнительный рисунок S9). Соответственно, селуметиниб, траметиниб и RAF709 показали более сильное подавляющее действие на передачу сигналов MAPK в MEF KRas lox KRAS Q61H по сравнению с MEF KRas lox Рис.S10A). Мы также оценили индукцию BIM члена семейства Bcl-2, учитывая, что передача сигналов RAF / MEK / ERK приводит к ингибированию BIM (45). В соответствии с этой гипотезой, наша система KRas lox KRAS MUT показала, что BIM был резко активирован в ячейках KRas lox KRAS Q61H , а не в ячейках KRas lox KRAS G12D , когда подвергнутые воздействию только селуметиниба, траметиниба или RAF709 (дополнительный рис.S10A).

Рисунок 5.

Дифференциальные ответы на воздействие ингибиторов MEK и RAF in vitro и in vivo . A - C, IC 50 значений в ответ на обработку ингибиторами MEK и RAF KRas lox KRAS MUT MEF, экспрессирующих экзогенные HA-меченые KRAS G12D или KRAS Q61H или KRAS Q61H более высокая чувствительность для Q61H по сравнению с G12D. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение клеточных линий, принадлежащих каждой группе.Значения IC 50 составляли 1140 нмоль / л по сравнению с 224 нмоль / л для селуметиниба, 10 нмоль / л по сравнению с 2 нмоль / л для траметиниба, 4300 нмоль / л по сравнению с 300 нмоль / л для RAF709 для G12D и Q61H, соответственно. ( 100 нмоль / л), траметиниб (10 нмоль / л) или RAF709 (1 мкмоль / л) по отдельности или в комбинации.Результаты были оценены с помощью измерений IncuCyte и являются репрезентативными для одного из трех аналогичных экспериментов. Сел, селуметиниб; Тра, траметиниб. E и F, Дифференциальные синергетические эффекты ингибитора RAF в комбинации с ингибитором MEK. Тепловая карта баллов Bliss для KRas lox KRAS MUT MEF, экспрессирующих экзогенный HA-меченный KRAS G12D или KRAS Q61H при воздействии RAF709 в сочетании с траметинибом. Положительный результат указывает на комбинации, в которых эффект больше, чем аддитивный. G, Изменение объема складок в опухолевых имплантатах мыши, полученных из KRas lox KRAS MUT MEF, экспрессирующих экзогенный HA-меченный KRAS G12D или KRAS Q61H при лечении сельуметинибом (50 мг / кг в день) .

Эти различия сохранялись in vivo для модели мыши с ксенотрансплантатом, имплантированной клетками KRas lox KRAS G12D или KRas lox Клетки KRAS Q61H , обработанные селуметинибом.Примечательно, что опухоли уменьшились в группе Q61H в ответ на селуметиниб, в то время как G12D продемонстрировал продолжающийся медленный рост без доказательств фактической регрессии опухоли (рис. 5G; дополнительный рис. S10D).

Наконец, мы также отметили, что и KRas lox KRAS G12D и KRas lox KRAS Q61H показали повышенную чувствительность к комбинированному лечению ингибитором MEK и RAF709 (рис. 5D; дополнительные рисунки S9). и дополнительный рис.S10B и S10C). Таким образом, мы оценили синергизм между ингибированием RAF и MEK и обнаружили синергетические эффекты в обеих системах, как измерено с использованием модели поверхности доза-реакция независимости Блисса (25, 46). Оценка блаженства больше нуля указывает на комбинации, в которых эффект больше, чем аддитивный. Следует отметить, что синергические эффекты между ингибиторами MEK и RAF709 наблюдались при более низких концентрациях для KRAS Q61H по сравнению с KRAS G12D (фиг. 5E и F; дополнительные фиг. S11A и S11B).Более того, комбинация привела к большему увеличению индукции BIM в MEF KRas lox KRAS Q61H (дополнительный рисунок S10A).

Обсуждение

Здесь мы установили, что KRAS Q61H обладает незначительной внутренней активностью GTPase и предпочтительно взаимодействует с белками RAF по сравнению с PI3K. По сути, комбинация незначительной активности GTPase и усиленного взаимодействия с RAF, по-видимому, частично секвестрирует KRAS Q61H в передачу сигналов через путь MAPK.Структурный механизм возникает из-за отключения переключателя 2 RAS от гамма-фосфата GTP, который одновременно устраняет активность GTPase и усиливает взаимодействия с RAF, но снижает взаимодействия с p110γ. Усиление взаимодействий RAS-RAF, в свою очередь, приводит к взаимозависимости мультимеризации RAS и RAF. Одним из результатов этой взаимозависимости, по-видимому, является то, что мутантные опухоли KRAS , несущие KRAS Q61H , более чувствительны к ингибированию передачи сигналов MAPK на уровне RAF и MEK.

Эти наблюдения могут объяснить редкость мутаций KRAS Q61H в целом, либо потому, что в нем отсутствуют достаточные взаимодействия с PI3K, которые необходимы для поддержки онкогенеза, управляемого RAS в определенных контекстах (47), либо потому, что неограниченная передача сигналов MAPK приводит к вредным эффектам (48) при отсутствии других, пока неизвестных компенсаторных факторов. Эти результаты также обеспечивают мотивацию для клинических испытаний по изучению ингибиторов пути MAPK в мутационных подмножествах рака, вызванного RAS.В частности, эти данные предполагают, что раковые опухоли, несущие мутации 61 кодона KRAS , будут более чувствительны к ингибированию сигнального пути MAPK посредством MEK или «разрушающих парадокс» ингибиторов RAF по сравнению с мутациями кодона 12 и 13 KRAS .

Наши результаты также расширяют понимание контекстной зависимости мультимеризации / кластеризации RAS в отношении мутаций RAS и эффекторных взаимодействий. В частности, мы устанавливаем, что взаимозависимость между мультимеризацией RAS и RAF играет особую роль с KRAS Q61H , а не KRAS G12D .Кроме того, замена D154Q не влияла на активность PI3K ни для одного из мутантов, указывая тем самым, что мультимеризация RAS играет роль в MAPK, но не в передаче сигналов PI3K. Это свойство породило гипотезу о том, что KRAS Q61H будет проявлять повышенную чувствительность к ингибитору RAF RAF709, что было подтверждено в наших модельных системах (44). Однако вопрос о том, можно ли распространить этот результат на рак легких человека, который, как известно, является гетерогенным, потребует дополнительных исследований. Другой важный вопрос заключается в том, будут ли подобные эффекты наблюдаться при раке, связанном с NRAS или HRAS, где чаще встречаются мутации кодона 61.

Следует отметить, что структура мультимера РАН остается предметом открытых дискуссий. Было предложено множество структурных моделей с различными уровнями экспериментальных данных (13–15, 49). Это, вероятно, отражает низкое сродство взаимодействий RAS-RAS и то, что они зависят от ассоциации с клеточной мембраной. Эти характеристики приводят к экспериментальным трудностям, которые препятствуют быстрому прогрессу в решении структур. Во-первых, взаимодействия RAS-RAS, по-видимому, имеют низкое сродство и зависят от ассоциации с клеточной мембраной, что затрудняет выделение комплексов RAS.Во-вторых, комплексы RAS могут принимать множественные формы, что затрудняет структурные исследования, поскольку большинство методов основано на получении монодисперсной популяции структурных конформеров. На данный момент мутации D154Q и R161E являются единственными известными нам мутациями, которые, по-видимому, нарушают мультимеры RAS без изменения других основных биохимических функций RAS. Однако по мере появления новых структурных данных может появиться возможность лучше очертить условия, которые диктуют, какие структурные формы возникают, а также когда и как ими манипулировать.

Если эти результаты могут быть подтверждены на более широком наборе образцов рака человека, они будут иметь клиническое значение, учитывая очевидную разницу в чувствительности опухолей, вызванных KRAS Q61H , к фармакологическому ингибированию MAPK. Эта идея согласуется с тенденцией к клинической пользе у пациентов с мутацией кодона 61 в исследовании SELECT-1, в котором тестировался ингибитор MEK селуметиниб в контексте рака легких с мутацией KRAS (50). Стоит отметить, что другая мутация KRAS, KRAS G12R , обнаруженная при раке поджелудочной железы, также продемонстрировала предпочтение передачи сигналов MAPK, что побудило начать клинические испытания ингибитора MEK селуметиниба (NCT03040986).Вместе эти исследования подчеркивают возможность того, что испытания ингибиторов пути MAPK могут оказаться положительными, если критерии отбора пациентов будут дополнительно уточнены, чтобы включить только чувствительные мутации RAS.

Вклад авторов

Z.-W. Чжоу: Концептуализация, формальный анализ, исследование, методология, написание оригинального проекта, написание-рецензирование и редактирование. К. Амброджио: Концептуализация, финансирование, исследование, методология, написание оригинального проекта. А.К. Bera: Концептуализация, формальный анализ, методология, написание оригинального проекта. Q. Li: Ресурсы, формальный анализ, исследование, методология. Х.-Х. Li: Методология, управление проектом. Л. Ли: Формальный анализ, исследование, методология. Дж. Сон: Формальный анализ, исследование, методология. С. Гонди: Расследование, администрация проекта. J. Li: Формальный анализ, исследование, методология. Э.Кэмпбелл: Расследование. Х. Цзинь: расследование . J.J. Окоро: Расследование. C.-X. Сюй: Ресурсы, надзор, привлечение финансирования, расследование, администрирование проекта. П.А. Янне: Ресурсы, надзор, привлечение финансирования, администрирование проекта. К.Д. Westover: Концептуализация, ресурсы, надзор, привлечение финансирования, написание оригинального черновика, администрирование проекта, написание-рецензирование и редактирование.

DeepFRET, программное обеспечение для быстрой и автоматической классификации данных FRET одиночных молекул с использованием глубокого обучения

Существенных изменений:

1) Неясно, как предварительное обучение модели может учесть бесконечное количество возможных состояний FRET / времени жизни / занятости / путей перехода / шума и т. Д.Как это может не смещать результаты, чтобы искать трассы, которые имеют отношение сигнал / шум и т. Д. К данным обучения? Например, максимальная вероятность перехода между состояниями в наборе обучающих данных 0,2 может привести к смещению анализа в сторону долгоживущих состояний FRET. Авторы должны это прокомментировать.

Это действительно очень верный комментарий, который является центральным для процесса, поскольку существует бесконечное количество возможных перестановок данных FRET, а неправильное обучение модели может привести к смещенному выбору трассы.Мы благодарим рецензентов за то, что они позволили нам прокомментировать этот вопрос, так как это могло быть неясно в рукописи.

Чтобы внести как можно меньшее смещение в сторону конкретных состояний FRET, мы стремились сгенерировать репрезентативную часть всей выборки пространства smFRET, равномерно большого количества бесконечных возможных перестановок данных ( состояний FRET / времени жизни / занятости / путей перехода / шума ) . Чтобы проверить это и дополнительно охарактеризовать данные обучения, мы предприняли ряд осторожных шагов, которые описаны ниже:

a) Состояния и занятия FRET .Количество состояний FRET в данной трассе выбиралось равномерно от 1 до 4 состояний. Каждому состоянию случайным образом присваивалось значение FRET путем равномерной выборки от 0 до 1. Для трасс с более чем одним состоянием требовалось минимальное расстояние 0,1 FRET между состояниями (т. Е. Случайная единообразная выборка повторялась до тех пор, пока требование не было выполнено). способен отличать реальные переходы от шумовых колебаний. Мы проверили, что все состояния FRET, а также занятость 150 тыс. Трасс в обучающих данных были равномерно распределены между 0 и 1, как показано на рисунке 1 - приложение к рисунку 3A.Мы поняли, что это могло быть неясно в исходной заявке, поэтому мы подробно описали это в подразделе «Материалы и методы» «Генерация синтетических данных smFRET» в новой версии. Кроме того, мы исправили легенду рисунка 1 - добавление к рисунку 3A: «Трассы smFRET были сгенерированы с 1–4 случайно определенными состояниями FRET […]», поскольку из-за ошибки формулировки в нем говорилось, что трассы были сгенерированы с 1, 2 или 3 говорится в исходном сообщении.

б) Вероятность перехода и время жизни. Мы благодарим рецензентов за то, что они заметили ошибку формулировки в исходном материале «с вероятностью перехода ниже 0 и 0,2». Вероятность перехода для каждого кадра следа из заданного состояния в другое равномерно дискретизируется между 0 и 0,2. Вероятности перехода относятся к между состояниями, так что в системе с 4 состояниями с максимально допустимыми вероятностями перехода 0,2, объединенная вероятность перехода в любом заданном кадре составляет 0,2 * (4-1 состояния) = 0.6. С другой стороны, в системе с двумя состояниями с вероятностями перехода между состояниями 0,01, объединенная вероятность перехода в любом заданном кадре составляет 0,01 * (2–1 состояния) = 0,01. Таким образом, средний срок службы вышеупомянутых систем составляет 1 / 0,6 = 1,7 кадра и 1 / 0,01 = 100 кадров соответственно. Распределение времени жизни всех обучающих данных является равномерно взвешенным средним по экспоненциальным затуханиям для каждого возможного количества состояний FRET и вероятностей перехода, как показано на рисунке 1 - приложение к рисунку 3B.Моделирование методом Монте-Карло на 10 000 трассировок с вероятностями перехода сэмплирования равномерно между 0 и 0,2 на 2-4 трассах состояний подтверждает, что наши обучающие данные соответствуют базовой модели (рисунок 1 - приложение к рисунку 3B). Следовательно, мы выбираем широкий диапазон вероятностей переходов, равномерно охватывающий как долгоживущие, так и короткоживущие состояния FRET, стремясь походить на большинство экспериментальных данных, не внося смещения в сторону конкретных времен жизни. Признавая, что это могло быть неясно в рукописи, мы добавили новый рисунок 1 - дополнение к рисунку 3B с распределениями времени жизни и моделированием Монте-Карло вместе с кратким описанием того, как они были получены в подразделе «Материалы и методы» «Синтетический smFRET». генерация данных ».

c) Путь перехода следует цепи Маркова, которая генерируется случайным образом из матрицы перехода с вероятностями, выбранными, как описано выше. Марковская цепь каждой моделируемой трассы генерируется с использованием реализации скрытой марковской модели пакета Python с открытым исходным кодом под названием pomegranate. Чтобы убедиться, что обучающие данные представляют собой подмножество всех возможных путей перехода единообразно, мы построили график плотности переходов для n = 10 000 смоделированных трасс. Это убедительно иллюстрирует совершенно случайный и однородный путь перехода, как и ожидалось.Признавая, что эта критически важная информация не была реализована в первоначальном представлении, мы добавили график как новый рисунок 1 - рисунок в приложении 3C, и внесли дополнительные пояснения в подраздел «Материалы и методы» «Генерация синтетических данных smFRET».

г) Уровень шума. Экспериментальные данные могут содержать выборку широкого диапазона уровней шума в зависимости от биологической системы, оборудования, экспериментальной установки и т.д. из основных истинных значений FRET.Затем к интенсивности был добавлен шум путем выборки из нормального распределения со значениями σ, равномерно распределенными между 0,01 и 0,30. Для имитации дробового шума поверх был добавлен дополнительный слой гамма-шума с вероятностью 0,8. Чтобы обосновать выбранный диапазон значений σ, мы построили моделируемые распределения FRET при различных уровнях шума, как показано на рисунке 1 - приложение к рисунку 4. Широкий диапазон уровней шума, который мы выбираем в обучающих данных, напоминает большинство экспериментальных данных, не внося смещения в сторону конкретное SNR из-за единообразной выборки, поддерживающей наши обучающие данные, и, таким образом, модель не смещена в сторону конкретного SNR в заданном диапазоне значений σ.В пересмотренной версии как в подразделе «Производительность DeepFRET», так и в разделе «Обсуждение» мы разъяснили, что в режиме, в котором скорости перехода аналогичны временному разрешению визуализации, динамические трассы smFRET могут быть неправильно классифицированы моделью как зашумленные. Имитация трассировки и повторное обучение модели (или изменение настроек визуализации) решат эту проблему.

Мы признаем, что, несмотря на наши строгие попытки внести как можно меньшую систематическую ошибку путем единообразной выборки всех параметров, специализированные пользователи могут иметь лучшее суждение и знание своих конкретных систем, уровней шума, времени жизни состояний или вероятностей перехода среди других параметров.При обучении модели может существовать некоторая систематическая ошибка, определяющая пределы интервалов для выбранных параметров. Таким образом, если опытный пользователь хочет адаптировать модель для лучшего удовлетворения своих конкретных потребностей, DeepFRET реализует удобный интерфейс моделирования трассировки, в котором новые трассы FRET могут быть легко смоделированы на основе определяемых пользователем параметров (см. Рисунок 1 - приложение к рисунку 6). и используется для переобучения модели DNN в соответствии с нашими инструкциями (https://github.com/hatzakislab/DeepFRETModel). Мы дополнительно подчеркнули это в новом абзаце в разделе «Обсуждение».

2) Сравнение DeepFRET с человеческой точностью в выборе «чистых следов» не кажется подходящим сравнением (и, очевидно, быстрее). Ручной выбор трассировки обычно больше не является стандартным средством анализа данных smFRET с учетом свободно доступных автоматизированных альтернатив с открытым исходным кодом (например, HAMMY, ebFRET, SPARTAN и т. Д.). Сравнение с другими доступными программными пакетами важно, чтобы убедить пользователей в превосходной или, по крайней мере, эквивалентной производительности DeepFRET при автоматическом выборе трассировки.Авторы должны включить такое сравнение в исправленную версию рукописи.

Мы хотим подчеркнуть, что основная цель этой рукописи - предоставить интуитивно понятную платформу, требующую минимального вмешательства человека, которая, как прокомментировали рецензенты, «[…] может снизить порог для экспертизы smFRET, позволяя большему количеству ученых Воспользуйтесь преимуществами этого мощного инструмента », , вместо того, чтобы доказывать неправоту существующих надежных программных пакетов, разработанных и эксплуатируемых экспертами в данной области.Мы также признаем, что ручной выбор трасс не должен быть стандартным средством анализа данных smFRET, но, несмотря на широкий спектр доступных пакетов программного обеспечения для анализа данных smFRET, только некоторые из них реализуют расширенную автоматическую сортировку трасс. HAMMY и ebFRET как рецензенты предложили сосредоточиться на извлечении кинетической скорости и предложить простые пороговые значения, основанные на интенсивности и значениях FRET. Удаление следов за пределами этих простых пороговых значений часто требует дополнительного ручного выбора. iSMS предлагает более продвинутую сортировку по интенсивности донора / акцептора, среднему FRET и средней стехиометрии для данных ALEX, а также автоматическое обнаружение фотообесцвечивания. SPARTAN предлагает более обширные реализации для автоматической сортировки (всего 26 параметров) и оптимизирован для данных, не относящихся к ALEX. Однако фактические пороговые критерии могут значительно различаться для каждой группы и экспериментальной системы (Fessl et al., 2018; Gouge et al., 2017; Schärfen and Schlierf, 2019; Tsuboyama et al., 2018; Yao et al., 2015). Специализированные группы хорошо обучены ориентироваться в этих множественных критериях и точно определять свои собственные, которые оптимизированы для работы с их конкретными системами (Aznauryan et al., 2016; Fessl et al., 2018; Gouge et al., 2017; Schärfen and Schlierf, 2019; Tsuboyama et al., 2018; Wu et al., 2018; Yao et al., 2015). Однако разнообразие этих критериев сортировки может внести ненужную систематическую ошибку в и без того сложную серию обработки данных, особенно с учетом того, что появление коммерческих инструментов быстро расширило сферу smFRET.

Чтобы напрямую ответить на комментарии рецензентов, мы выполнили два типа экспериментальных проверок. Сначала мы сравнили DeepFRET напрямую с возможностями сортировки HAMMY, ebFRET, SPARTAN и iSMS на смоделированных данных, достоверность которых известна. Затем мы сравнили SPARTAN и iSMS, у которых есть расширенные возможности сортировки, на наборах экспериментальных данных, опубликованных другими группами.

В первом случае мы объединили 200 смоделированных наземных трассировок smFRET с 1800 смоделированными трассами nonmFRET (Рисунок 4 - дополнение к рисунку 3A и Материалы и методы для распределений FRET и описаний параметров, соответственно) и реконструированные файлы TIF, которые будут соответствовать в необработанные данные smFRET.Мы смоделировали как данные ALEX, так и данные, не относящиеся к ALEX, поскольку iSMS оптимизирован для данных ALEX, в то время как HAMMY, ebFRET и SPARTAN оптимально работают с данными, не относящимися к ALEX. Файлы tif были загружены в соответствующие программные пакеты и использованы для извлечения и сортировки трасс с применением показателя качества 0,80 в DeepFRET, параметров сортировки по умолчанию в SPARTAN (кроме порога фонового шума), пороговых значений интенсивности, стехиометрии и FRET в iSMS, пороговых значений интенсивности. в HAMMY и порогах FRET в ebFRET. Мы обнаружили, что DeepFRET, SPARTAN и iSMS восстанавливают базовое истинное распределение FRET до различных уровней детализации, в то время как простые значения интенсивности и пороговые значения FRET для HAMMY и ebFRET потребуют дальнейшей сортировки для получения оптимальных результатов.В частности, было обнаружено, что DeepFRET сортирует трассы, по крайней мере, так же или лучше, чем SPARTAN и iSMS, без какой-либо настройки параметров (рис. 4 - приложение к рисунку 3B). Мы настоятельно отмечаем, что опытные пользователи смогут точно настроить все возможные пороговые значения, чтобы лучше соответствовать достоверным данным. Однако в реальном эксперименте, где достоверная информация неизвестна, задача становится более сложной, и параметры точной настройки могут быть искажены, особенно для неспециализированных пользователей. Классификация на основе единого порога, предлагаемая DeepFRET, может иметь решающее значение для большего числа ученых, чтобы воспользоваться этим инструментом.

Во втором случае мы сравнили производительность трех программных пакетов, предлагающих расширенную сортировку, на экспериментальных данных, опубликованных другими группами. Выбор наборов данных, отличных от ALEX и ALEX, опубликованных Kilic et al. (Kilic et al., 2018) и Hellenkamp et al. (Hellenkamp et al., 2018), соответственно, обеспечивает надлежащее тестирование в различных настройках FRET и наборах данных. Мы использовали практически настройки по умолчанию в обоих программах и обрезали данные до первых 10 кадров каждой кривой, минимизируя обесцвечивание без использования жесткого порога по умолчанию при FRET <0.2 в СПАРТАНСКОМ. Наш анализ показывает, что все три пакета программного обеспечения способны воспроизводить опубликованные распределения FRET из необработанных файлов tif с небольшими расхождениями (рисунок 4 - приложение к рисунку 4). DeepFRET демонстрирует производительность, эквивалентную или превосходящую существующие сложные программные пакеты, также на экспериментальных данных. Мы подчеркиваем, что существующие программные пакеты очень надежны, и опытные пользователи смогут перемещаться и оптимизировать все необходимые настройки для отдельных наборов данных.Сила DeepFRET заключается в его способности анализировать данные как ALEX, так и не-ALEX воспроизводимым образом, требуя лишь минимального вмешательства человека и, следовательно, минимального опыта в установке пороговых значений, - , что позволяет большему количеству ученых воспользоваться преимуществами этого мощного инструмент. Признавая отсутствие сравнения с существующим программным обеспечением, мы добавили новый рисунок 4 - рисунки 3-4. Мы также переименовали подраздел «Производительность DeepFRET на реальных данных» в «Производительность DeepFRET на реальных данных, сравнение с существующим надежным программным обеспечением для анализа smFRET», а также добавили новый параграф в раздел, в котором подробно обсуждается сравнение на смоделированных реальных данных и опубликованные данные.

3) Аналогичным образом, лучший способ доказать возможности анализа трассировки DeepFRET - это взять несколько наборов данных и сравнить результаты анализа HAMMY, ebFRET и т. Д. С DeepFRET. Авторы должны включить такой сравнительный анализ более чем одного набора данных в исправленную версию рукописи.

Чтобы ответить на комментарий рецензентов, мы напрямую сравнили производительность DeepFRET с опубликованными результатами на двух экспериментальных наборах данных (ALEX и не-ALEX) в разных группах (рисунок 4 - приложение к рисунку 4 и ответ на комментарий 2).Мы обнаружили, что DeepFRET смог воспроизвести опубликованные распределения smFRET с использованием простого порога качества 0,80 без дополнительного вмешательства человека, и, более того, так же или лучше, чем существующее программное обеспечение (см. Также ответ на комментарий рецензента 2). Эти данные дополнительно подтверждают производительность и мощность DeepFRET по сравнению с другим существующим программным обеспечением, требующим определенных пользователем пороговых значений, что может потребовать специальных знаний от пользователей. Мы объяснили сравнение в основном тексте и добавили новый рисунок 4 - приложение к рисунку 4 в рукописи.

4) Было бы полезно, если бы в разделе «Обсуждение» авторы могли обсудить ограничения инструмента. Обсуждение случаев, когда их инструмент может дать сбой, будет полезным для исследователей, которые хотят использовать свой инструмент или развить его. Например, в разделе «Материалы и методы» отмечается, что фотофизические эффекты, которые иногда наблюдаются в экспериментах с smFRET, могут быть проблематичными для метода (похоже, что инструмент, скорее всего, классифицирует их как бесполезные трассы, даже если они могут отражать «истинный» сигнал от эксперимента [e.грамм. наблюдение PIFE в работе от группы TJ Ha]).

После комментария рецензентов мы добавили новый абзац в раздел «Обсуждение», в котором излагаются ограничения текущей версии DeepFRET и то, что можно сделать в будущем для ее улучшения. Как отмечалось в предыдущих разделах, DeepFRET точно работает как с смоделированными, так и с экспериментальными данными двухцветного smFRET в нескольких лабораториях. Ограничения, обсуждаемые в обновленной версии рукописи, могут быть устранены опытными пользователями путем моделирования новых обучающих данных и повторного обучения модели DNN в соответствии с нашими инструкциями (https: // github.com / hatzakislab / DeepFRET-Model), как описано в разделе Материалы и методы.

Артикул:

Азнаурян, М., Сондергаард, С., Ноер, С.Л., Шиотт, Б., Биркедал, В., 2016. Прямой взгляд на сложную многопутевую укладку теломерных G-квадруплексов. Nucleic Acids Res. 44, 11024–11032. DOI: 10.1093 / nar / gkw1010

Фессл, Т., Уоткинс, Д., Оутли, П., Аллен, В.Дж., Кори, Р.А., Хорн, Дж., Болдуин, С.А., Рэдфорд, С.Е., Коллинсон, И., Тума, Р., 2018. Dynamic действие механизма Sec во время инициации, транслокации белка и терминации. eLife 7. doi: 10.7554 / eLife .35112

Gouge, J., Guthertz, N., Kramm, K., Dergai, O., Abascal-Palacios, G., Satia, K., Cousin, P., Hernandez, N., Grohmann, D., Vannini, А., 2017. Молекулярные механизмы Bdp1 в сборке TFIIIB и инициации транскрипции РНК-полимеразы III. Nat. Commun. 8, 130.

DOI: 10.1038 / s41467-017-00126-1

Шерфен, Л., Шлирф, М., 2019. Мониторинг в реальном времени конформационных изменений ДНК, индуцированных белками, с использованием одномолекулярного FRET.Методы 169, 11–20.

DOI: 10.1016 / j.ymeth.2019.02.011

Цубояма, К., Тадакума, Х., Томари, Ю., 2018. Конформационная активация аргонавта посредством различных, но скоординированных действий систем шаперонов hsp70 и hsp90. Мол. Ячейка 70, 722-729.e4. DOI: 10.1016 / j.molcel.2018.04.010

Ву, С., Лю, Дж., Ван, В., 2018. Анализ ферментного катализа, модулируемого конформационной динамикой, с помощью одномолекулярного FRET. J. Phys. Chem. В 122, 6179–6187.

DOI: 10.1021 / ACS.jpcb.8b02374

Яо, К., Сасаки, Х.М., Уэда, Т., Томари, Ю., Тадакума, Х., 2015. Одномолекулярный анализ целевой реакции расщепления ферментным комплексом Drosophila RNAi. Мол. Cell 59, 125–132. DOI: 10.1016 / j.molcel.2015.05.015

https://doi.org/10.7554/eLife.60404.sa2

Активность ГТФаз семейства Rho во время деления клеток, визуализированная с помощью зондов на основе FRET | Журнал клеточной биологии

кДНК RBD эффекторных белков, включая mDia1 человека (аминокислотные остатки 1–176), мышиный Rhotekin (аминокислотные остатки 1–88), мышиный Rhophilin (аминокислотные остатки 37–107), человеческий PKN (аминокислотные остатки 13–98) и кДНК белка Rac1 / Cdc42-связывающий домен PAK (а.о. 68–150) амплифицировали с помощью ПЦР с праймерами, несущими сайты узнавания рестрикционного фермента на их 5'-конце, и субклонировали в pCR ® -Blunt II-TOPO ® (Invitrogen).Плазмиды для мониторов RhoA были сконструированы с использованием по существу той же процедуры, что использовалась для конструирования pRaichu-Ras (Mochizuki et al., 2001). От аминоконца Raichu – RhoA – 1202, –1208, –1125, –1126, –1206 и –1212 состояли из YFP (aa 1–228), спейсера (Leu-Asp), дикого типа или мутантов человеческий RhoA (аминокислотные остатки 1–189), спейсер (Thr-Gly-Gly-Gly-Gly-Thr), RBD эффекторных белков, спейсер (Gly-Gly-Arg) и CFP (аминокислотные остатки 1–237). Raichu-1110X, -1111X, -1214X, -1220X, -1104X, -1105X, -1218X и -1224X состояли из YFP (aa 1–228), спейсера (Leu-Asp), RBD эффекторных белков, a спейсер (Thr-Gly-Gly-Gly-Gly-Thr), человеческий RhoA (aa 1–189), спейсер (Gly-Gly-Arg), CFP (aa 1–237), спейсер (Ser-Arg), и карбоксиконцевую область Ki-Ras4B (аминокислотные остатки 169–188).Raichu – RhoA – 1237X, –1238X и –1239X состояли из YFP (а.о. 1–228), спейсера (Leu-Asp), RBD PKN, спейсера (Thr-Gly-Gly-Gly-Thr-Gly- Gly-Gly-Gly-Thr), RhoA дикого типа или мутанты RhoA человека (aa 1–189), спейсер (Gly-Gly-Arg), CFP (aa 1–237), спейсер (Gly-Arg-Ser -Arg) и CAAX-бокс Ki-Ras4B (а.о. 169–188; рис. 1 A). В Raichu-RhoA / RhoA-CT карбоксиконцевая область RhoA (а.о. 173–193) была заменена на Ki-Ras4B в Raichu-RhoA-1237X.

Эффекторные белки, используемые в каждом зонде, перечислены в таблице I.В Raichu – RhoA – 1239X, Asn был заменен на Thr 19 RhoA. В других пробах RhoA был либо диким типом, либо мутантом Gln 63 Leu (Q63L), как указано в таблице I. В этой статье, если не указано иное, мы использовали модифицированный YFP [Thr 66 Gly, Val 69 Leu, Ser 73 Ala, Met 154 Thr, Val 164 Ala, Ser 176 Gly и Thr 204 Tyr] и CFP [Lys 27 Arg, Tyr 67 Trp, Asp 130 Gly, Asn 147 Iso, Met 154 Thr, Val 164 Ala, Asn 165 His, Ser 176 Gly] в качестве акцептора и донора соответственно.Нуклеотидная последовательность кодирующих областей pRaichu-RhoA-1237X, которая использовалась в качестве Raichu-RhoA / K-Ras-CT в этом отчете, была депонирована в банке данных GenBank / EMBL / DDBJ (под номером доступа AB074297).

Raichu – 1502 / Raichu – RBD состоял из YFP (aa 1–228), спейсера (Leu-Glu), RBD Rhotekin (aa 1–88), спейсера (Gly-Gly-Arg) и CFP ( аа 1–237). В Raichu – 1502 / Raichu – RBD мономерная Венера [Phe 47 Leu, Thr 66 Gly, Val 69 Leu, Ser 73 Ala, Met 154 Thr, Val 164 Ala, Ser 176 Gly; и Thr 204 Tyr, Leu 222 Lys, Phe 224 Arg] (Nagai et al., 2002; Zacharias et al., 2002) использовался в качестве YFP. В Raichu-Raichu-RBD-X карбоксиконцевая область RhoA была слита с Raichu-RBD.

.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *