Панель ваз 21 14: Доступ ограничен: проблема с IP

Панель приборов ВАЗ 2110/2114

Обозначение элементов индикации и управления приборной панели ВАЗ 2110 и 2114

Если вы желаете купить запчасти к автомобилю ВАЗ, то выгоднее всего будет заказать их в нашем интернет-магазине! Мы гарантируем качество всей купленной продукции, а также осуществим доставку по всей России.

Менеджеры ответят на интересующие Вас вопросы в онлайн чат или можете позвонить нам по бесплатному номеру: 8 800 700 8501, WhatsApp: 8 962 522 15 82. 

Обозначения индикаторных лампочек на приборных панелях автомобилей ВАЗ 2110 и 2115

Каждый владелец автомобиля должен отлично разбираться в обозначении ламп индикации на приборной панели отечественных авто.

Одновременное загорание лампочек происходит во время включения зажигания, затем они гаснут. И если во время езды вдруг начинает загораться какая-нибудь одна лампочка, то мы начинаем нервничать по этому поводу, если не знаем ее обозначения. Со мной так было, когда я пересел на новую машину.

На новенькой ВАЗ 2112 я совершенно не знал, что означают лампочки индикаторов на приборной панели.

Следует сказать, что на всех легковых моделях ВАЗ варьируется только расположение индикаторов, а значки остаются везде одинаковыми.

Итак, приступим.

1 — Показывает температуру жидкости охлаждения (единицы измерения — градусы по Цельсию).

2 — Тахометр, измеряющий обороты двигателя.

3,4 — Индикация свечения поворотных огней.

5 — Спидометр — прибор для измерения скорости движения в км/ч.

6 — Уровень бензина (солярки) в баке. При уменьшении объема топлива до 5 литров, загорается «иконка» бензоколонки или лампочка желтого цвета.

8 — Лампочка, подтверждающая свечение габаритов.

9 — Сигнализирует о недостаточном количестве тормозной жидкости в системе. Если загорелся этот индикатор, то велика вероятность протечки.

10 — Включение фар дальнего света.

11 — Подстройка часов. Переход от часов к минутам производится при помощи однократного нажатия. В некоторых моделях эта кнопка также может отображать информацию о дневном и общем пробеге.

12 — Табло для отображения пробега (дневной/общий).

13 — Аварийная сигнализация

14 — Сигнализирует о наличии проблем с двигателем. Рекомендуется немедленно остановить машину при включении этой индикаторной лампочки.

15 — Часы. При наличии встроенного термометра отображает температуру воздуха на улице.

16 — Если загорелась эта лампочка, значит, имеются проблемы с зарядкой АКБ. Причин может быть несколько: обрыв или ослабление генераторного ремня, поломка самого генератора и т.п.

17 — Стояночный тормоз. Свечение значка обозначает, что тормоз включен.

18 — Критически малое давление моторного масла в двигателе. Сразу после того, как этот индикатор зажегся, нужно заглушить мотор и поискать причину неполадки.

19 — Воздушная заслонка (если на машину установлен двигатель карбюраторного типа).

При покупке запчастей ВАЗ, мы осуществляем доставку по России.

На другой (дополнительной) панели (торпедо ВАЗ 2110 — 12) имеется ряд новых обозначений. Займемся их расшифровкой:

 — Лампочка со стрелкой — сломаны стоп-сигналы или габаритные огни.

— Обозначение ниже информирует об изнашивании тормозных колодок. В случае включения этой лампочки их нужно обязательно заменить.

— Горит, если водитель и пассажиры не пристегнули ремни безопасности.

На левой стороне, начиная сверху:

— Уровень моторного масла критически мал;

— Заканчивается омывающая жидкость;

— Температура охлаждающей жидкости превышает допустимую.

Приведу несколько рекомендаций — если у вас загорелся один из индикаторов и одновременно послышался прерывистый писк, еще не повод нервничать. Проблему можно решить дозаправкой горючего и посещением автосервиса.

Обозначение значков на панели приборов ВАЗ 2114

«Торпеда» — на сленге автовладельцев так называется совокупность приборов, расположенных в левой стороне приборной доски. Там же расположены различные индикаторные лампы и переключатели, контролирующие печку, светотехническую аппаратуру и т.д.

Чтобы выбрать и купить необходимую запчасть для вашего авто, мы рекомендуем посетить наш каталог:

Приборная панель ВАЗ-2114 описание обозначений

1. Спидометр. Данные о скорости движения автомобиля передаются от датчика, закрепленного на коробке передач. В результате скорость отображается на приборе индукционного типа, называемого также спидометр. Градуировка шкалы выполняется через каждые 10 км/ч, с пределами от нуля до 200 км/ч. Ошибка показаний не превышает 5 км/ч. Дисплей с 2-мя строчками, расположенный в центре спидометра, информирует о текущем и общем пробеге автомобиля.

2. Тахометр. Этот прибор установлен слева от спидометра. Снабжен электронной начинкой, на вход которой подаются сигналы бортового компьютера. Тахометр показывает обороты коленчатого вала. Шкала градуирована таким образом, что одно деление соответствует 5-ти единицам. Цифровые обозначения наносятся с шагом в 10 единиц. Верхний предел шкалы равен 80-ти единицам. Для получения текущего количества оборотов коленчатого вала необходимо показания тахометра умножить на 100. На часть шкалы (интервал 55-60) нанесена штриховка красного цвета, а деление 80 закрашено сплошным красным. Если стрелка прибора зашла в эту область, это означает, что двигатель работает с перегрузкой и в любой момент может выйти из строя. В нижней части тахометра расположены индикаторы температуры воздуха и времени.

3. Индикатор температуры охлаждающей жидкости (ОЖ). Температура ОЖ требует постоянного контроля, поэтому на панель приборов выведен специальный индикатор, расположенный слева от тахометра. Данные о нагреве ОЖ замеряет специальный датчик. Разметка шкалы выполнена через каждые 20 градусов. Числовые значения наносятся через неравные интервалы: первое число соответствует 50, затем следует 90 и 130. Зона риска начинается со 105 градусов. Как только показания прибора превышают это значение, двигатель машины нужно заглушить как можно быстрее, иначе он сломается.

4. Индикатор уровня топлива занимает место справа от спидометра. 

Расшифровку изображений и чисел на шкале привожу далее:

1. 0 — бак пуст;

2. 1/2 — заполнен наполовину;

3. Полный;

4. Верхний значок бензоколонки — бак наполнен до предела;

5. Символ бензоколонки справа снизу (подсветка оранжевая) — в баке присутствует менее 6-ти литров горючего.

Обозначение лампочек и индикаторов на панели приборов 2114

Основным назначением приборной панели является своевременное оповещение водителя о текущем состоянии систем автомобиля, а также в предупреждении ситуаций, ведущих к аварии. Кроме того, на ней имеется ряд органов управления, позволяющих осуществлять ввод данных, выполнять некоторые действия и т.п.

Индикаторы ВАЗ 2114

1 — предупреждает о значительном снижении уровня масла в картере двигателя. В этом случае он начинает светиться красным цветом;

2 — Объем омывающей жидкости критически мал. Если ее остаток в бачке меньше 1-го литра, то она начинает гореть оранжевым светом.

3 — Светится оранжевым и предупреждает о критически малом уровне охлаждающей жидкости.

4 — Индикатор, загорающийся красным в случае незакрытых дверей;

5 — Свечение этой лампочки говорит о наличии поломок габаритных огней либо «стоп-сигналов»;

6 — Горение этой лампочки информирует водителя о неполадках в тормозной системе автомобиля;

7 — Лампа светится в случае не пристегнутых ремней безопасности.

Ранние модели ВАЗ 2114 имели приборные доски с обозначением индикаторов, полностью аналогичным ВАЗ 2110.

Обозначение кнопок ВАЗ 2114

Кнопки — не менее важные элементы, чем индикаторы. Поэтому каждому водителю следует разобраться с их обозначением. Кнопка (11) на приборной доске ВАЗ 2114 отвечает за переключение показаний температуры и времени. А если эту кнопку удерживать в нажатом состоянии более 5-ти секунд, то произойдет сброс текущего пробега. Автомобиль при этом должен быть остановлен.

По центру приборной панели в одном ряду находятся:

— кнопки ВАЗ 2114

— Переключатель блок-фар (сдвоенный). Кнопкой (1) зажигаются габаритные огни. Кнопка (2) отвечает за включением ближнего света.

 Блок клавишных переключателей. Первый переключатель (1) включает передние противотуманные фары, второй (2) — задние «противотуманки». Переключатель (3) запускает систему обогрева заднего стекла.

При покупке товара в интернет-магазине Аккорд-Авто от 5000 руб, вы получаете скидочную карту и при следующих покупках у вас всегда будет действовать скидка. С нами вы можете рассчитывать на быструю и бесплатную доставку купленных запчастей.

Приборная панель Ваз 2114 — неисправности способы ремонта как разобрать

Поиск возможных причин, по которым может не работает панель приборов ВАЗ 2114, периодически беспокоит то одного, то другого владельца машин этой модели. Понятное дело, если не видишь ни одного параметра на торпеде, ехать можно только, как говорится, на ощупь. Правда, известны отдельные спецы, которые все же умудрялись как-то доползти до базы без всех показаний, однако следовать их примеру как-то не хочется.

Да и нужно ли самому создавать себе возможные неприятности и увеличивать риск возможного попадания в ДТП? Я думаю нет! В сегодняшней статье я хочу рассказать вам о возможных причинах возникновения неисправности приборной панели Ваз 2114, и дать некоторые способы ее самостоятельного ремонта.

Ваз 2114 – почему не работает приборная панель?

Почему не работает приборная панель Ваз 2114? Причин на самом деле может быть много, вот некоторые из них:

1. Перегоревший предохранитель
2. Сгоревшие дорожки на плате являются не ремонт пригодными. В данной ситуации всё решается установкой новой схемы. Пугаться этого не стоит, её стоимость не велика, а замену можно выполнить самостоятельно.
3. Обрыв в электропроводке можно назвать наиболее сложным, неприятным и трудно определяемым вариантом поломки. В этом случае, питание на панель приборов или один из индикаторов не подаётся, и он перестаёт работать. Определение неисправности происходит с помощью мульти метра. Нужный провод перезванивается, определяется место разрыва или плохого контакта и при необходимости заменяется или зачищается.

Если внезапно пропало освещение приборной панели, проверьте рукоятку регулировки яркости лампы освещения. Вполне возможно, ребёнок, сидевший перед этим в вашем автомобиле выкрутил её, установив на минимум.

Приборная панель Ваз 2114 вышла из строя что делать?

Если на автомобиле ВАЗ-2114 на щитке приборов не работает ни один из установленных на нём указателей (спидометр, одометр, тахометр, указатели уровня топлива и температуры охлаждающей жидкости), то первое, что придётся сделать водителю, это проверить целостность предохранителя F3, который находится в монтажном блоке. Если он сгорел, то прежде, чем его заменить, нужно найти причину, из-за которой он перегорел, иначе у вновь поставленного нового предохранителя будет та же участь, что и у предыдущего. Наиболее часто, предохранители горят, в результате короткого замыкания.

Если даже предохранитель цел, то не поленитесь достать его и проверить состояние контактов. Бывают случаи, когда контакты окисляются, а электрическая цепь в этом месте, прерывается. Убедившись в целостности предохранителя, следующим шагом будет проверка реле зажигания, которое находится в салоне автомобиля слева от рулевой колонки. Оно закреплено на шпильке «вниз головой». В колодке, куда вставляется это реле, при помощи перемычки можно попытаться замкнуть силовые провода. Если при этом щиток приборов оживёт, то реле зажигания придётся заменить.

При исправности реле зажигания, вероятных причин не рабочего состояния щитка приборов, остаётся только две: замок зажигания и монтажный блок. До установки на автомобиле ВАЗ-2109 реле зажигания, контакты замка, подгорали довольно таки часто, и их приходилось зачищать, отсоединяя контактную группу от самого замка. После внесения изменений, в принцип подачи напряжения на замок зажигания, его контакты стали подгорать очень редко, но вероятность этого явления, все же осталась. На монтажном блоке, в его плате, могут перегорать дорожки, для того чтобы это увидеть монтажный блок придётся снять с автомобиля.

Кроме выше перечисленных причин, которые могут привести к отказу в работе щитка приборов, необходимо ещё и проверять надёжность крепления массового провода.

Снятие приборной панели Ваз 2114 – видео

Приборная панель Ваз 2114 – автотест

На некоторых автомобилях ВАЗ есть функция “проверка приборной панели”, которая позволяет стрелкам сделать полный оборот от начала до конца. Такой автотест приборки при включении зажигания есть на некоторых иномарках (nissan, subaru). В этой статье расскажем, как сделать автоматический тест панели приборов на ВАЗ. Начнем с того, что реализовать функцию проверки приборки при включении зажигания получится не на каждой модели. Если включить зажигание, удерживая кнопку сброса пробега и стрелки опишут дугу, тогда эта панель подойдет. Как правило такая калибровка стрелок приборки есть на моделях АвтоПрибор с одним окошком (однострочное), но опять же не на всех версиях.Чтобы доработать панель приборов Вам понадобится:

1. Реле электромагнитное, малогабаритное (12В). Например, Tianbo HJR 1-2C.
2. Транзистор КТ 503. Можно заменить практически любым npn структуры.
3. Конденсатор 100мкф, электролитический (16В).
4. Резисторы на 1ком, 6.8кома, 22кома.

Принцип работы схемы: реле, своими нормально замкнутыми контактами замыкает кнопку приборки. При включении зажигания схема дает начинает работать через пол секунды, а потом включает реле, которое размыкает кнопку.

Такой тест стрелок и индикаторов приборной панели есть уже на всех современных моделях. Единственное на разных образцах он действует по разному. Например, может быть 1 проход стрелок, или три, или пока кнопку не нажмешь, или даже проход только до половины шкал. Скорость стрелок приборной панели тоже зависит от производителя и версии приборки. Другими словами автотест – это автоматически наживающаяся кнопка теста при включении приборки. Если тест при стандартной проверке есть, то и при автотесте он будет. Поэтому сделать авто тест приборной панели Ваз 2114 не проблема.

Как разобрать приборную панель Ваз 2114

Прежде чем приступить к этому сложному процессу, водитель должен внимательно ознакомиться с конструкцией и устройством панели приборов на своей машине. В разобранном до винтиков состоянии она выглядит так:

Если внимательно изучить эту схему, то становится понятным как снять панель на ВАЗ 2114. Определив для себя порядок, можно приступать к процессу.

1. Воспользовавшись крестообразной отверткой необходимо отвернуть три самореза, удерживающих левый экран консоли. Для удобства при этой работе лучше пользоваться отверткой с короткими ручкой и жалом.
2. Снимая экран, осторожно вывести нижний край накладки из кронштейна кузова.
3. Правый экран консоли крепится пятью саморезами. С помощью крестообразной отвертки осторожно открутить все саморезы, придерживая накладку рукой.
4. Снять экран не допуская его зацепления за жгуты проводки, которая за ним скрывается.
5. Отсоединить «массу» от аккумулятора, разъединив колодки.При наличии на автомобиле магнитолы отсоединить ее от основного пучка проводов, вытащив соединительную колодку. Если радиоприемника на автомобиле не установлено, то просто вытащить провода из панели, они должны быть закрыты заглушкой. Обязательно надо отключить прикуриватель и вытащить патрон с лампочкой подсветки пепельницы.
6. Снять ручки с рычагов управления заслонками отопителя. Для облегчения процесса поддеть их плоской отверткой.
7. Несмотря на кажущуюся простоту этого пункта, на снятие ручек с рычагов можно потратить очень много времени. Для этого приводится наглядный пример как это надо делать на снятом агрегате.
8. Снять рукоятку электрического вентилятора отопителя просто потянув ее на себя.
9. Саморезы с крестообразной головкой, крепящие панель приборов к кронштейнам справа и слева, отвернуть отверткой
10. В окошке на панели приборов, где находится приборный блок имеется два самореза сверху и два снизу — под окошком. Надо вывернуть их, осводив накладку (2) и щиток (8).
11. Вытащить заглушку и открутить саморез, находящийся за ней
12. Убрать два самореза снизу удерживающие накладку и снять ее.
13. Пометив провода подходящие к выключателям, отсоединить их.
14. Открутить болты с кронштейна руля
15. Ключом на «8» открутить саморезы нижнего крепления кронштейна.
16. Открутить саморез под отвертку и снять световод.
17. Убрать крепеж блока управления отоплением и вытащить патроны с обратной стороны блока.
18. снять декоративную вставку, убрав все внешние детали.
19. Гайки открутить ключом на «21».
20. Убрать подсветку гидрокорректора.
21. Верхнее и нижнее крепления панели открутить, с левой стороны удалить крепление к поперечине.
22. Теперь можно выполнить снятие торпеды ВАЗ 2114.
23. Установка производится в обратном порядке.

Для того, чтобы наглядно, в движении увидеть весь процесс, можно посмотреть видео как снять приборную панель на ВАЗ 2114.

Видео: Как снять приборную панель на Ваз 2114 своими руками

Замена приборной панели ВАЗ 2114 своими руками + Видео

В процессе управления автомобилем приборная панель ВАЗ 2114 играет очень важную роль. Она представляет собой комплекс приборов, отображающих многие параметры автомобиля. Среди них: скорость, количество оборотов коленчатого вала, температура охлаждающей жидкости, оставшееся количество бензина. Многие панели оборудованы вольтметрами, указателями давления масла и даже электронным термометром. Кроме того, на приборной панели размещается большое количество органов управления электрической частью автомобиля. В этой статье мы расскажем, как снять приборную панель ВАЗ 2114, заменить ее и тюнинговать, а также как производится замена ламп подсветки.

Для чего производится замена приборной панели 

Чаще всего, причина, по которой водитель идет на этот шаг – это ДТП. После него, приборная панель приходит в негодность: трескается и теряет свой первоначальный вид. Бывают ситуации, когда форма изделия не изменилась, но на ней появились довольно некрасивые трещины, что нарушает общую эстетику автомобиля.

В этой операции есть очень много сложностей. Первая из них – это подключение электрических приемников. Дело в том, что многие водители забывают вставить какой-нибудь штекер и прибор попросту отказывается работать. В связи с этим, все приходится начинать сначала. Вторая сложность заключается в демонтаже. Чаще всего, при разборке, водители случайно ломают какое-нибудь крепление или прибор. Все это заставляет водителя обращаться к услугам автомастеров и отдавать немалые суммы за выполненные работы.

На самом деле, всего намного проще, чем кажется. Достаточно четко следовать инструкции и проявлять особую осторожность. Тогда вы сэкономите много нервов и сил.

Как снять приборную панель ВАЗ 2114

В первую очередь, обесточьте цепь электрической сети. Для этого снимите «плюсовую» клемму аккумулятора. Итак, порядок действий при снятии выглядит вот так:

• Со стороны водителя с левой стороны консоли необходимо снять боковую накладку. Для этого выкрутите пять саморезов, и демонтируйте деталь. Те же самые действия необходимо проделать и со стороны пассажирского сидения. После этого, отсоедините штекера, ведущие на магнитолу, прикуриватель, пепельницу и их подсветку.
• Теперь необходимо вытащить рукоятку выключателя печки. Для этого подденьте ее отвертку и потяните на себя. То же самое делается и с рукоятками управления заслонкой. Все мелкие элементы, лучшего всего, положить в какую-нибудь емкость, чтобы не потерять.
• Далее выкрутите саморезы на щите приборов. Два из них расположены сверху, а два других – снизу. Удобнее такую процедуру выполнять фигурной отверткой. Вытащите заглушку рядом с кнопкой включения обогрева заднего стекла и открутите еще один саморез. После этого, накладка поддевается и отводится в сторону сидений. Вы сразу же увидите большое количество штекеров и фишек. Все их необходимо снять и пометить, чтобы не перепутать при сборке. Рулевое колесо лучше всего снять.
• Отверните снизу крепления рулевой колонки и опустите ее вниз. Делается это для того, чтобы она не мешала при дальнейшей разборке. На блоке управления отопителя выверните все саморезы и утопите последний внутрь панели.
• Найдите металлические кронштейны (от пола до панели) и выверните все саморезы, которые их крепят. Не забудьте открутить поперечину.
• Возьмитесь за ручку гидравлической корректировки фар и потяните на себя. Снимите ее и рукоятку регулировки яркости подсветки приборной панели. Теперь вытащите накладку и демонтируйте светодиодную вставку. После этого, открутите показавшиеся гайки.
• Вытащите оставшиеся штекера иммобилайзера и фишку освещения бардачка.

После этого, открутите оставшиеся большие саморезы крепления панели и потяните ее на себя. Последним движением вверх вытащите ее из посадочного места. Монтаж новой детали производится в обратной последовательности по заранее помеченным штекерам.

Замена ламп подсветки в приборной панели ВАЗ 2114 + Видео

Работа ламп приборной панели обеспечивает подсветку органов управления и информации о параметрах автомобиля в темное время суток. Если они перегорели, их необходимо обязательно заменить, так как попытка найти в темноте какую-то кнопку может закончиться довольно печально.

Все работы по замене производятся на разобранной панели. Как снять панель – расписано выше. Все, что требуется от вас – это купить комплект новых лампочек. Почему именно комплект? Потому что удобнее будет заменить все лампы сразу, чем поменять одну, всю собрать и ждать, когда перегорит другая. Все это трудоемко и может потратить много сил, поэтому, лучше всего, сделать все заранее.

Чтобы поменять лампы в панели достаточно сделать несколько простых движений. Отверните патрон перегоревшей лампы и вытащите его. Крутить следует против часовой стрелки. После этого, вытащите старую лампу и на ее место установите новую. Установка патрона производится в обратной последовательности.

Тюнинг приборной панели

Если вы хотите каким-то образом улучшить внешний вид приборной панели или сделать ее функциональной, то можно выполнить ее тюнинг.

Самым распространенным видом тюнинга приборной панели является установка новых ламп в подсветке приборов или установка дополнительного освещения. Чаще всего, замена ламп производится на лампы с другим цветом светового потока (например, зеленого или синего). Подбор цвета должен быть таким, чтобы он не раздражал глаза, особенно в темное время суток. Дополнительное освещение применяют, в основном, для нижней части панели в ногах. Для этого можно купить уже готовый набор светодиодов и подключить их к бортовой сети автомобиля.

Другой способ тюнинга подразумевает изменение внешнего вида шкалы приборов. Для этого, на цветном принтере можно распечатать уже готовые решения, приклеить к жесткому картону и установить вместо старой шкалы. Стоит учитывать то, что освещение новой шкалы может немного отличаться от заводского. Поэтому, важными критериями будут цвет шкалы и материал, к которому его приклеят.

Более серьезная модернизация предполагает изменение внешнего вида самой панели. Для этого ее можно покрасить или обтянуть новым материалом. Если вы решили обтянуть панель, то применяйте для этого только разрешенные материалы. Под запретом находятся обычная ткань и мех, так как они являются легковоспламеняемыми. Цвет обтяжки стоит выбирать в соответствии с общим фоном салона. Прекрасно смотрится комбинация сразу двух цветов (например, бежевый и коричневый).

Если вы решили окрасить панель в другой цвет, то ее необходимо снять. После этого она зачищается с помощью наждачной бумаги и обезжиривается. Первым делом наносится специальный герметик, а после него автомобильная краска. Не используйте покрасочные материалы, которые имеют повышенную чувствительность к большим температурам. Если окрасить пластик какой-либо другой краской, то при длительном стоянии автомобиля под солнцем, краска расплавится и попросту отойдет. Другая неприятность может подстерегать вас при мойке панели – обычная краска имеет свойство стираться обычной водой, еще лучше — мыльной. Будьте готовы к тому, что первое время в салоне будет пахнуть краской. 

Панель ВАЗ-2114: возможные варианты модернизации

Тюнинг панели приборов ВАЗ 2114

Сегодня многих автолюбителей интересует тюнинг панели ВАЗ 2114. Это объясняется ее конструкцией, которая прекрасно подходит для этого занятия. 

В целом, если вести речь о 2114-ой модели, следует отметить, что она является одной из последних, хорошо продуманных и выполненных моделей авто «семейства» ВАЗ. Для большинства тюнинг ВАЗ 2114 своими руками в целом, и усовершенствования салона в частности – это всего лишь замена чехлов на сидениях.

Однако это глубокое заблуждение, в салоне есть много объектов, которые можно красиво обновить. На протяжении всей истории марки ВАЗ 2114 считалось, что тюнинг салона – это масштабный, многоуровневый комплекс работ, который состоит из множества разнообразных действий по усовершенствованию разных элементов и, конечно, в числе прочих — панель приборов.

Комплексная модернизация панели приборов ВАЗ-2114: первые шаги

Чаще всего комплекс работ по усовершенствованию приборной панели ВАЗ 2114 является важным и необходимым, но, в то же время, интересным и серьезным занятием. Главная задача — правильно подобрать детали и красиво их оформить. Все действия, которые касаются различных обновлений, всегда лучше продумывать наперед, заблаговременно.

В последствие это позволит избежать ненужных ошибок и мешающей суеты. Правильным решением будет составление плана работ, по которому вы будете следовать и благодаря которому не сделаете ошибок, а весь процесс будет для вас сплошным удовольствием.

Тюнинг приборной панели может выполнятся в следующей последовательности:

1. Для начала необходимо разобрать автомобильное «устройство». Как снять панель приборов ВАЗ 2114 должен знать каждый автолюбитель. Здесь нет ничего сложного, все достаточно понятно, а сам процесс не требует специальных умений или знаний.
2. Потом необходимо выполнить доработку элементов и частей. Здесь всегда может быть множество нюансов. Они зависят от того, что вы хотите поменять и улучшить в своем авто. Все следует продумать весьма тщательно.
3. В конце нужно провести установку переделанной, обновленной «панельки» на место.

Как легко обновить «приборку» ВАЗ 2114

Усовершенствование приборной панели модели 2114, на самом деле, не такой сложный, как может показаться сначала, процесс. Купить такой «прибор» достаточно просто. Следует рассмотреть, какие варианты можно использовать владельцам, чтобы обновить гардероб ВАЗ 2114 (примеры на фото и видео).

1. АМС. Данная модель имеет несколько особенностей.

• для начала, стоит отметить, что заказать ее дизайн можно самостоятельно;
• данная панель комплектована интегрированным указателем масла, который отсутствует в классическом исполнении. Появление его связано с очень настойчивыми просьбами многих автолюбителей об установке этого «компонента» в штатную комплектацию.
• выглядит такая панель приборов интереснее вследствие цветных шкал с хромированными окантовками.

2. PRO-SPORT. Данная «приборка» выполнена как накладка для панели приборов на представленную модель. Обновленное оформление данного устройства придает им впечатляющий, совершенно новый вид. Есть два варианта ее исполнения: со светлой и темной подложкой. Подсветка панели ВАЗ 2114 имеет специальную регулировку яркости, однако присутствует только одни цвет – синий. Шкалы наклеиваются после монтажа вставки. Это придать этому элементу машины оригинальный вид.

3. АМС-2. Центровым прибором стал тахометр, который перенесли слева в центр. Белые шкалы создают в общем спортивный вид всей панели. Это позволяют быстрее считывать  с нее необходимую информацию. Подсветка переделана, используются светодиоды, с помощью которых считывать информацию в ночное время не составляет труда. Установку рекомендуется проводить квалифицированным специалистам, поскольку при ее монтаже предусмотрена значительная «перепланировка» классической модели.

 

 

 

4. STREET STORM. Главной особенностью этой модели является ее цветовое оформление. В классическом расположении приборов не стали ничего менять,

упор был сделан на цветовую гамму. «Внешность» приборной панели претерпела определенные изменения, однако, при этом, стиль ее гармонично вписывается в существующий интерьер. Следует отметить еще одну особенность данной модели – это ее подсветка. Днем она светлая с красными символами. В темное время суток спокойно можно изменять не только яркость, но и цвет.

5. «Северный ветер». Эта модель отличается внешним видом. Разработчики показали, что даже при стандартном расположении приборов вся панель выглядит динамично и ярко. В ней явно просматриваются спортивные черты. Цвет подсветки зависит от оттенка шкал вставки.

Тюнинг в свое удовольствие

Главное в процессе модернизации любого автомобиля — это эффектность. Каждому владельцу хотелось бы, чтобы его машина выглядела оригинально и, в то же время, чтобы в ней было уютно. Как ни странно, но одной из любимых деталей для любителей тюнинга считается именно панель приборов. Ее можно по-разному доработать и, таким образом, выделить собственную машину из огромного количества подобных машин.

На стартовом этапе необходимо приготовить материал для работы. Замена панели ВАЗ 2114 или ее оригинальное обновление требует демонтажа стандартной панели. Необходимо будет снять только защитное стекло спидометра. Важно его не сломать. После снятия защитного стекла, нужно «деинсталлировать» стрелки указатели.

Важно быть аккуратным, поскольку стрелки весьма хрупкие. После этого вытаскиваем стандартную вкладку. Потом нужно сменить лампочки подсветки. Стандартные имели зеленый цвет, приобретенные же будут синего оттенка. Проводим замену стандартных лампочек на купленные, потом проверяем, как они работают. После этого, устанавливаем новую вкладку.

Все это будет смотреться очень эффектно. В конце устанавливаем стрелки-указатели и защитное стекло. Если таким образом доработать свою машину, то она будет выглядеть очень красиво.

Подсветка стрелок: красиво и оригинально

Рассматривая штатную «вазовскую» подсветку 2114 приходишь в определенное уныние. Сама панель светиться зеленым, подсветка отопителя — желтым, кнопки — зеленым, а индикация вообще оранжевая. Такое не сочетание оттенков многих владельцев не устраивает, и часто они задумываются о полной измене подсветки салона автомобиля.

Ездить в ночное время, и, при этом, не видеть приборов — дело опасное и неблагодарное. В этой ситуации можно сделать каждую стрелку светящейся, используя красный светодиод. Для этого необходимо разобрать щиток приборов, поставить под стрелки по красному светодиоду и надеть на него специальную термоусадку. Это поможет не рассеивать красный свет, он будет светить прямо.

Проводы от каждого необходимо вывести наружу щитка и дальше подцепить к проводам подсветки отопителя. После этого, стрелки будут светится насыщенным ярким красным светом.

Европанель для ВАЗ-2114

 

Для начала возникает вопрос: чем она хороша? Старая панель выполнена, мягко говоря, по-быстрому: руль перекрывает часть приборов, сама «приборка» отражается на лобовом стекле ночью, превращая, таким образом, дорогу, в компьютерный квест.

Пластик, а точнее, его качество, не выдерживает никакой критики. После прохождения несколько сотен километров, весь салон заполняет навязчивый скрип и жуткий грохот. Позже начинает открываться бардачок. Вентиляция плохая, зимой внутри машины холодно. Однако все эти проблемы решаемые. Однако стоит ли покупать авто и сразу думать о его ремонте?

Другое дело — европанель. Она выглядит современно и модно. Материал мягче и богаче. Он, конечно, менее шумный. Вентиляция тоже на уровне.

Повсюду чувствуется и отечественная сборка. Рычаги управления воздушными потоками туго двигаются, не доходят до краев прорезей. Также есть и другие мелочи: где-то зазор большой, там еще что-то отваливается, бардачок иногда сам по себе открывается. Но по количеству и частоте это совершенно несравнимо со старым вариантом.

Помимо этого, душу греют несколько ящичков для мелких вещей. Европанель – это современное и оригинальное решение многих проблем, связанных с «приборками» отечественных автомобилей.

Не горит панель приборов ВАЗ 2114: причины неисправности

Панель, на которой размещаются все приборы, очень важная часть автомобиля, так как с помощью нее реально контролировать: как работает инжектор, скорость движения и работу тормозной системы. Кроме того, панель поможет понять вам, почему автомобиль не заводится. Если не горит панель приборов, то невозможно на ВАЗ-2114 беспрепятственно снять с них показания, особенно в сумерках. Цифры будут сливаться, а автомобилист рискует попасть в аварийную ситуацию. Расскажем, как избавиться от этой проблемы.

Почему может не гореть подсветка приборной панели

Причин у появления этой неисправности очень много. Электропроводка у ВАЗ-2114, как и у всех отечественных автомобилей, является не самой сильной частью. Самые распространенные причины отказа подсветки:

• выход из строя группы светодиодов;
• перегорела лампочка;
• появление окиси на разъемах;
• обрыв или замыкание электропроводки;
• поломка предохранителя;
• неисправность общей контактной платы;
• повреждены габариты;
• отсутствие подачи «массы» на кузов.

Найти причину неисправности вам поможет вольтметр и тестер. С его помощью удастся проверить участки электропроводки и лампы. Также прибор поможет узнать, какой предохранитель вышел из строя. В большинстве случаев вам придется снять приборную панель. Об этой процедуре мы и расскажем далее.

Как исправить неполадки

Подготовьте для работы набор отверток (прямых и фигурных), ключи на 8 и 21, специальный пластмассовый пинцет для извлечения предохранителей и тестер. Далее разборку нужно проводить по инструкции:

1. Разборка начинается с удаления накладки. Для этого необходимы выкрутить 3 самореза. Под ней расположен выступ, который нужно вывести из кронштейна кузова.
2. Чтобы снять экран необходимо выкрутить 5 саморезов, они располагаются в накладки консоли справа.
3. Снимите с аккумуляторной батареи клемму (обычно рекомендуют минусовую), чтобы обесточить автомобиль. Только после этого от прикуривателя отсоедините колодку жгута проводов.
4. С рычага снимите рукоятку. Отсоедините крепление электровентилятора, располагающегося на отопительном агрегате.
5. После этого отверните болты на кронштейнах рулевой колодки. Снимите световод, патроны ламп и декоративную вставку панели приборов.
6. Ключом на 21 выньте лампу подсветки гидрокоректора.
7. Удалите саморезы снизу и сверху, чтобы у вас была возможность достать приборную панель.

Важно, чтобы электросхема была в безопасном от пыли и влаге месте. Накройте ее тканью или плотной пленкой, чтобы исключить попадание агрессивных веществ.

В первую очередь протестируйте лампочки. Если он вышли из строя, их необходимо заменить на новые, в большинстве случаев этого достаточно для восстановления работоспособности панели. При этом не исключайте и другие причины, например, проверьте соединения и проводники на наличие окиси. На патронах ламп часто образуется нагар, что также приводит к отсутствию подсветки панели.

Если перестала работать только панель приборов, но при этом все лампы при тестировании показали работоспособность, то причина скрывается в блоке предохранителей. В этом случае проверьте каждый предохранитель и замените те, что вышли из строя. При приобретении комплектующих необходимо руководствоваться маркировкой вышедшего из строя предохранителя. Не стоит заменять его на самодельные изделия или комплектующие с большей силой тока.

Если неисправность кроется в повреждении самой платы, что бывает крайне редко, то необходимо просто заменить этот элемент.

Читайте также: Как снять приборную панель ВАЗ-2114

Как провести замену подсветки

Иногда необходимо разбирать приборную панель возникает, если автолюбитель решил модифицировать ее. Подсветка может просто не устраивать автолюбителя цветом ламп и интенсивностью их работы. Для того чтобы обновить подсветку полностью, вам потребуется рассчитать количество ламп для каждого датчика и приобрести их.

При установке светодиодов в патроны важно соблюдать их полярность. Вам, возможно, потребуется аккуратно сточить патроны, чтобы лампы встали на свои места. После того как вы соберете новую подсветку, проверьте ее работоспособность, подключив к питанию. Можно проверить качество сборки специальным прибором.

Следующим этапом будет подключение новой подсветки к основной плате и к ламповой цепи. Аккуратно закрепите светодиоды, чтобы они не мешали вам монтировать панель. При сборке контролируйте положение стрелок приборов, их нужно при сборке выставлять на ноль. Стрелки при этом не должны изгибаться и деформироваться.

Далее вам останется только зафиксировать шурупами всю конструкцию и провести окончательную обратную сборку. Важно не стремиться сразу собрать панель полностью, не крепите декоративные части, чтобы не пришлось снимать их снова. После подключения панели приборов к электроцепи проверьте качество сборки и работу датчиков при помощи бортового компьютера. Если все в норме, то окончательно закрепите панель и завершите сборку.

Панель приборов | Автомобили ВАЗ-2115i

Расположение органов управления автомобилем соответствует нормам и правилам ЕЭК ООН. Для удобства пользования рукоятками, кнопками, выключателями и контрольными приборами, размещенными на панели приборов, на них нанесены символы функционального назначения.

На панели приборов (рис. 1.7) расположены следующие органы управления. 1 – рычаг переключателя указателей поворота и света фар. 2 – сопло обдува стекла передней двери. 3 – комбинация приборов. 4 – рулевое колесо. 5 – выключатель звуковых сигналов.

6 – выключатель аварийной сигнализации. При нажатии на кнопку включается мигающий свет всех указателей поворота и контрольной лампы в комбинации приборов. При повторном нажатии на кнопку сигнализация выключается:

7 – выключатель (замок) зажигания (рис. 1.8), объединенный с противоугонным устройством, расположен с правой стороны рулевой колонки. Ключ в замке может занимать одно из трех положений:

0 – «выключено». Все потребители выключены, ключ вынимается. При вынутом ключе срабатывает запирающий механизм противоугонного устройства. Для гарантированной блокировки вала рулевого управления поверните рулевое колесо вправо или влево до щелчка. Для выключения противоугонного устройства нужно вставить ключ в выключатель зажигания и, слегка поворачивая рулевое колесо вправо-влево, повернуть ключ в положение «I»;
I – «зажигание». Включено зажигание, ключ не вынимается, рулевое управление разблокировано;
II – «стартер». Ключ не вынимается, рулевое управление разблокировано. Достигается поворотом ключа по часовой стрелке с преодолением усилия пружины. В таком положении ключ не фиксируется — для работы стартера его нужно удерживать рукой. Выключатель зажигания оборудован блокировкой включения стартера при работающем двигателе. Для повторного включения стартера после неудачной попытки пуска переведите ключ из положения «I» в положение «0», а затем вновь в положение «II».

ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ
Не выключайте зажигание и не вынимайте ключ из замка во время движения — рулевое управление будет заблокировано и автомобиль станет неуправляемым.

8 – рычаг переключателя очистителей и омывателя ветрового стекла.

9 – датчик-сигнализатор иммобилизатора установлен на автомобиле с системой впрыска топлива, оснащенном электронной противоугонной системой, и предназначен для передачи секретного кода от рабочего кодового ключа через блок иммобилизатора на контроллер управления двигателем.

10 – блок сигнальных ламп бортовой системы контроля. В блоке установлены следующие лампы (рис. 1.9 ):

1 – сигнальная лампа аварийного падения уровня масла в картере двигателя. Загорается оранжевым светом, если уровень масла в картере двигателя опустился ниже метки «MIN» указателя;

2 – сигнальная лампа недостаточного уровня жидкости в бачке стеклоомывателя. Загорается оранжевым светом, если в бачке осталось менее 1 л омывающей жидкости;

3 – сигнальная лампа недостаточного уровня охлаждающей жидкости в расширительном бачке. Загорается оранжевым светом при снижении уровня охлаждающей жидкости на холодном двигателе ниже допустимого предела;

ПРИМЕЧАНИЯ
Перед доливкой масла в двигатель проверьте, не произошла ли его утечка из-за нарушения герметичности системы смазки двигателя. Перед доливкой жидкости проверьте герметичность системы охлаждения двигателя.

4 – сигнальная лампа незакрытых дверей. Загорается красным светом при незакрытой двери автомобиля;

5 – сигнальная лампа неисправности лампы стоп-сигналов или габаритных огней. Загорается красным светом в случае неисправности лампы стоп-сигнала при нажатии на педаль тормоза или какой-либо лампы габаритного огня при его включении;

6 – сигнальная лампа износа накладок колодок передних тормозов. Загорается оранжевым светом при нажатии на педаль тормоза и горит до выключения зажигания, если толщина накладок колодок передних тормозов уменьшилась до 1,5 мм;

7 – сигнальная лампа непристегнутых ремней безопасности. Загорается красным светом, если не пристегнуты ремни безопасности водителя.

11 – переключатель наружного освещения. В блоке переключателя установлены два механически связанных выключателя:
– выключатель габаритных огней 1. Последовательным нажатием клавиши выключателя включают и выключают габаритный свет в фарах и в задних фонарях, при включенном габаритном свете в клавише загорается контрольная лампа со светофильтром зеленого цвета;
– выключатель света фар 2. При нажатии на клавишу выключателя (фиксированное положение) включаются фары. При повторном нажатии на клавишу фары выключаются.

ПРИМЕЧАНИЕ
Механическая связь обоих выключателей исключает возможность включения фар без предварительного включения габаритных огней и, наоборот, не позволяет выключить габаритные огни при включенных фарах.

12 – блок клавишных выключателей включают в себя следующие:
– выключатель 1 передних противотуманных фар. Противотуманные фары включают нажатием на кнопку выключателя при нажатой кнопке выключателя габаритных огней, одновременно загорается контрольная лампа в кнопке. При повторном нажатии на кнопку противотуманные фары выключаются;
– выключатель 2 задних противотуманных фонарей. При нажатии на кнопку выключателя включаются задние противотуманные фонари, если включено наружное освещение. При повторном нажатии на кнопку задние противотуманные фонари выключаются;
– выключатель 3 обогрева стекла двери задка. При нажатии на кнопку выключателя включается обогрев стекла, одновременно загорается контрольная лампа в кнопке. При повторном нажатии на кнопку обогрев выключается.

13 – маршрутный компьютер, устанавливаемый на часть выпускаемых автомобилей, предназначен для измерения, накопления и вывода на цифровой дисплей одного из следующих параметров:
– текущего расхода топлива;
– среднего суммарного расхода топлива;
– средней скорости движения;
– пройденного пути;
– текущего времени;
– времени в пути.

14 – заглушка.

15 – контрольная лампа антиблокировочной системы (ABS) тормозов. Установлена вместо заглушки, если автомобиль укомплектован антиблокировочной системой.

16 – контрольная лампа состояния подушки безопасности. Установлена вместо заглушки, если автомобиль оборудован подушкой безопасности.

17 – центральные сопла системы вентиляции и отопления.

18 – крышка верхнего вещевого ящика. Для доступа к верхнему вещевому ящику при откинутой крышке нижнего вещего ящика нажмите на рычаг замка верхней крышки.

ПРИМЕЧАНИЕ
Рычаг замка расположен в верхней части ниши нижнего вещевого ящика.

19 – боковое сопло системы вентиляции и отопления салона.

20 – крышка нижнего вещевого ящика. чтобы открыть ее, прижмите рукоятку замков к ручке. Если включено наружное освещение, специальный фонарь подсвечивает внутреннюю часть вещевого ящика.

21 – журнальная полка.

22 – панель управления системой вентиляции и отопления.

23 – гнездо для радиоаппаратуры. Предусмотрена установка радиоаппаратуры, соответствующей по размерам и способу крепления международным стандартам.

24 – передняя пепельница.

25 – выключатель обогрева правого переднего сиденья.

26 – выключатель обогрева левого переднего сиденья.

27 – рычаг стояночного тормоза. Чтобы затормозить автомобиль стояночным тормозом, поднимите рычаг 2 до упора вверх — в комбинации приборов загорится контрольная лампа красного цвета. чтобы растормозить автомобиль, потяните рычаг немного вверх, нажмите на кнопку 1 на торце рукоятки рычага и опустите его до упора вниз — контрольная лампа должна погаснуть.

28 – рычаг переключения передач.

29 – прикуриватель. Для пользования прикуривателем нажмите на патрон до его фиксации и отпустите. Примерно через 20 с патрон автоматически возвращается в исходное положение, готовый к применению.

30 – переключатель электровентилятора отопителя.

31 – педаль акселератора.

32 – педаль тормоза.

33 – педаль сцепления.

34 – рукоятка регулировки угла наклона рулевой колонки.

35 – выключатель освещения панели приборов. Вращением рукоятки регулируют яркость освещения приборов и ламп подсветки выключателей, если включено наружное освещение.

36 – ручка управления гидрокорректором фар. Вращением ручки регулируют угол наклона пучка света фар таким образом, чтобы исключить ослепление водителей встречного транспорта. Положения ручки гидрокорректора соответствуют следующим вариантам загрузки автомобиля:

0 – один водитель;
1 – все места заняты;
2 – все места заняты и груз в багажном отделении;
3 – один водитель и груз в багажном отделении.

37 – рычаг привода замка капота.

38 – розетка подключения переносной лампы.

Замена торпеды на ВАЗ 2113, 2114, 2115: как снять, установка

Обычно снятие торпедо для автолюбителя не составляет труда. Но всё меняется, когда речь заходит об автомобилях ВАЗ. По какой-то причине конструкторы этих машин приложили максимум усилий для того, чтобы снятие приборной панели превратилось в чрезвычайно сложную задачу. Так можно ли снять торпедо самостоятельно? Можно. О том, как это сделать, сегодня и пойдёт речь.

Устройство торпедо

Что такое торпедо? Если коротко — это приборная панель. Слово «торпедо» пришло к нам с Запада и к настоящему моменту прочно вошло в обиход отечественных автолюбителей.

Приборная панель автомобиля ВАЗ 2115

Приборные панели на ВАЗ 2113, 2114 и 2115 практически одинаковы. Это сложные разборные конструкции из металла с пластиковыми вставками. Кроме того, в панелях этой линейки моделей ВАЗ инженеры активно использовали полимерную плёнку, которой обтянуто большинство органов управления.

Схема основных элементов торпедо ВАЗ 2115

Как снять панель приборов с ВАЗ 2115

Поскольку приборные панели на тринадцатой, четырнадцатой и пятнадцатой моделях одинаковы, процедура демонтажа торпедо будет рассмотрена на примере ВАЗ 2115. Но прежде чем приступать к работе, следует запастись всем необходимым.

Инструменты и материалы

• отвёртка с плоским жалом;
• отвёртка с крестообразным жалом;
• плоскогубцы;
• набор рожковых ключей.

Последовательность операций при снятии торпедо с ВАЗ 2115

1. С помощью крестовой отвёртки отворачиваются саморезы, на которых держится левая боковина консоли.

   Левая боковина консоли ВАЗ 2115 снимается крестовой отвёрткой

2. После этого нижний край боковины аккуратно извлекается из кронштейна.
3. Правая боковина консоли держится на пяти саморезах, которые тоже откручиваются крестовой отвёрткой. После этого боковина аккуратно снимается.

   Правая боковина консоли ВАЗ 2115 крепится на 5 саморезах

4. Теперь снимаются ручки, установленные на рычагах печной заслонки. Это делается вручную.

   Ручки отопителя ВАЗ 2115 снимаются вручную

5. Далее снимается ручка с регулятора оборотов вентилятора. Для снятия её достаточно потянуть на себя.

   Ручку вентилятора ВАЗ 2115 достаточно потянуть на себя

6. Крестовой отвёрткой выкручиваются саморезы, удерживающие на кронштейнах приборную панель. Таких саморезов 4 (2 слева от панели, 2 справа).

   Саморезы из кронштейнов панели ВАЗ 2115 выкручиваются крестовой отвёрткой

7. Ещё 4 самореза расположены у окошка приборного блока (2 под окошком и 2 над ним). Они также выкручиваются крестовой отвёрткой.

   Саморезы из-под приборного окна ВАЗ 2115 извлекаются крестовой отвёрткой

8. Над окошком приборного блока, справа, находится небольшая заглушка. Она поддевается плоской отвёрткой и извлекается. Под ней расположен ещё один саморез, который выкручивается крестовой отвёрткой.

   Заглушка самореза на торпедо ВАЗ 2115 поддевается плоской отвёрткой и извлекается

9. После удаления всех саморезов накладка приборного блока снимается. Для этого её достаточно немного выдвинуть на себя.
10. За накладкой находятся провода, которые извлекаются из гнёзд вручную.

    Все приборные провода ВАЗ 2115 отключаются вручную

11. После отключения проводов необходимо ключом на 13 открутить 2 болта на рулевом кронштейне.

    Гайки на рулевых кронштейнах ВАЗ 2115 откручиваются рожковым ключом

12. Далее с помощью ключа на 8 откручиваются гайки на нижнем креплении кронштейна.

    Гайка на кронштейне панели ВАЗ 2115 откручивается рожковым ключом

13. После этого блок управления аккуратно извлекается из панели, открывается доступ к крепёжным гайкам на поперечинах торпедо.
14. Далее с помощью крестовой отвёртки откручивается последний внешний саморез, удерживающий торпедо на левой поперечине.

    Последний саморез, удерживающий торпедо ВАЗ 2115 находится у водительской двери

15. После выкручивания последнего самореза торпедо снимается.

    Торпедо ВАЗ 2115 снимается

Видео: снимаем приборную панель с пятнашки

Разрешена ли установка на ВАЗ 2115 торпедо с другой машины

Если коротко — нет. Приборная панель на ВАЗ 2115, 2114 и 2113 имеет ряд конструктивных особенностей, которых нет на других машинах. У неё слишком длинные поперечины, крепёжные кронштейны и боковины консоли. Ничего подобного нет даже на других моделях ВАЗ, не говоря уже об иномарках. Но следует отметить, что автовладельцами часто практикуется обратная замена. В частности, торпедо с ВАЗ 2114 успешно можно поставить на ВАЗ 2109. Но в этом случае приходится подрезать боковины консоли, а на кронштейнах сверлить новые крепёжные отверстия.

Важные моменты по части замены

• снимая правую боковину консоли, следует проявлять осторожность. За ней находятся провода, которые легко зацепить боковиной и повредить. Так что перед снятием этой крышки следует снять с аккумулятора минусовую клемму. Также следует выключить автомагнитолу, вытащив её колодку из общего жгута проводов, находящихся за верхней приборной панелью;
• снятие пластиковых ручек с рычагов печки может вызвать серьёзные трудности. Дело в том, что на рычагах печки есть выступы (сверху и снизу), а на ручках — отверстия. При надевании ручки она защёлкивается на рычаге. Единственный способ снять её — поддеть плоской отвёрткой так, как это показано на рисунке. Но поддевая ручку отвёрткой, не следует разгибать её слишком сильно: пластик очень легко ломается;

  Ручки на рычагах печки ВАЗ 2115 можно снять с помощью плоской отвёртки

• ручка вентилятора может крепиться аналогичным образом: две проушины, защёлкивающиеся на двух выступах рычага. В этом случае автовладельцу тоже придётся воспользоваться отвёрткой. Но такая система крепления ручки вентилятора применяется только на ВАЗ 2115 и 2114, выпущенных после 2000 года. На более ранних моделях эту рукоятку легко снять вручную.

Итак, начинающему автолюбителю вполне по силам снять приборную панель с ВАЗ 2115 и с других автомобилей этой линейки. Всё, что для этого требуется — терпение и внимательность. Если после откручивания всего крепежа торпедо упорно не хочет сниматься, следует осмотреть всё ещё раз: вполне возможно, был пропущен какой-то крохотный саморез.

Оцените статью: Поделитесь с друзьями!

Панель из гипсокартона 14 «x 24» — Elmdor

Дверь для доступа из гипсокартона 14 дюймов x 24 дюйма

Дверцы доступа серии

DW идеально подходят для новых установок или для реконструкции в каменной кладке, плитке, дереве или других поверхностях стен и потолка. Дверь имеет закругленные углы безопасности.

Спецификация продукта:

Размер двери:	14 дюймов в ширину и 24 дюйма в высоту
Размер грубого отверстия:	14 1/2 ширины x 24 1/2 высоты
Отделка:	Грунтовка подходит под покраску
Фланец:	1 фланец »
Петля:	Петля для фортепиано непрерывная
Замок / защелка:	3 x кулачковые защелки с отверткой
Материал:	Гальваническая сталь 16 калибра

Посмотрите DW-14-24 в действии на YouTube!

Обзор

: ВАЗ 21033 1982 года — Лада 1300 для Советов

Все знают его по экспортному названию «Лада», но на самом деле его звали ВАЗ, и именно так его знали в Советском Союзе.Как и все другие советские автомобилестроительные компании, ВАЗ — это аббревиатура от Волжского автомобильного завода (Волжский автомобильный завод). Это не следует путать с автомобилями «Волга» производства ГАЗа, Горьковского автомобильного завода или Горьковского автомобильного завода, что примерно в 600 км к юго-востоку.

Модель 2103, как и все Лады этой серии, с 2101 по 2107, основана на Fiat 124 Special 1966–1974 годов. Созданный как автомобиль для народа, при преобразовании из Fiat в ВАЗ автомобиль лишился большинства вещей, которые можно было бы назвать роскошью.Кроме того, кузов и шасси были изменены, чтобы противостоять суровому советскому климату; более толстая сталь, лучший обогреватель, увеличенный дорожный просвет и новый двигатель, разработанный Fiat. ВАЗы и Лады 2100-й серии, также известные как Classic, Riva, Signet, Laika или Kalinka в зависимости от рынка, производились с 1970 по 2012 год в России, а 2107 все еще производится в Египте!

ВАЗ 21033, изображенный здесь, — одна из самых редких моделей. 21033 была более дешевой версией базового ВАЗ 2103.Различия между ними ограничиваются тем, что 21033 имеет 1,3-литровый двигатель мощностью 70 л.с. по сравнению с 1,5-литровым двигателем мощностью 75 л.с. У 2103 также было радио с одним динамиком, а у 21033 — нет. Тем, кому посчастливилось приобрести новый ВАЗ, могли быть предоставлены варианты некоторых моделей, которые включали в себя размер двигателя или кузов-универсал. Цена 21033 составляла 8617 рублей, тогда как цена на более мощный 2103 в 1982 году составляла 8667 рублей. Разумеется, все, кто мог выбирать, остановили свой выбор на 2103.

История изображенной на фото 21033 состоит в том, что она была выиграна в государственной лотерее какой-то женщиной в 1982 году. Поскольку она не покупала машину, ей не предоставили выбор модели, поэтому она получила то, чего больше никто не хотел. После тридцати лет эксплуатации и злоупотреблений ВАЗ был приобретен молодым российско-американским энтузиастом советских автомобилей по имени Роман. За исключением краски, он реставрировал в основном сам в Украине, а затем отправил машину в Нью-Йорк два года назад. После оформления соответствующих документов на федеральном уровне и уровне штата, автомобилю были выданы номерные знаки штата Нью-Йорк.

Реставрация автомобилей может быть разной формы и качества; например, у меня есть личное неприязнь к автомобилям, которые якобы были восстановлены до заводского уровня, но на самом деле они отреставрированы и поэтому превосходят те, что были новенькими. Чрезмерное восстановление любой машины Восточного блока было бы довольно простой задачей, учитывая их первоначальное качество сборки, и именно здесь Роман проявил особую осторожность. Автомобиль был улучшен там, где это казалось практичным, поэтому удалось избежать заводских проблем, таких как плохие зазоры между панелями и перегибы.

Каждая использованная деталь была оригинальной заводской деталью, многие из которых гордо украшены логотипом CCCP, также известным как «Сделано в СССР». Совершенно новые детали использовались в нескольких редких случаях, но большинство из них были старыми, восстановленными до первоначального состояния. Поскольку эти автомобили были в производстве так долго, Роману не всегда было легко найти оригинальную деталь года выпуска. Одним из таких примеров были передние крылья, которые различались по стилю, но не по установке. Замена заржавевших оригинальных крыльев больше не была доступна, поэтому крылья от более новой модели должны были быть адаптированы для правильной установки боковых маркеров и отделки салона.Оригинальны также стальные диски с хромированными накладками, вплоть до отсутствия центральной крышки.

Все детали салона оригинальные, в том числе обивка сидений. Поразительно, но такой предмет роскоши, как задний центральный подлокотник, был стандартным, но подголовники не были добавлены до более позднего выпуска. Ремни безопасности с ручным приводом обеспечивают безопасность мирового класса, а многие детали интерьера напоминают знакомые Fiat. Где мог, Роман добавил заводские аксессуары, такие как заводское радио и моно-динамик, установленный под ним; на нужной частоте очень слышно систему зажигания.Другие интересные функции разработаны с учетом требований безопасности, например, быстросъемные щетки стеклоочистителя и боковое зеркало, которые часто воровались в коммунистической России.

Передние сиденья практически не поддерживают, но при этом они удобны и кажутся упругими, как старые сиденья Mercedes-Benz. Они производят впечатление сидящего, а не сидящего. Задняя скамья имеет такое же пружинистое ощущение. Меня действительно впечатлило количество ног и места для головы для такой маленькой машины; современная 3-я серия не была бы просторнее, за исключением того, что ВАЗ был намного уже, имел меньшие двери и гораздо меньшие габаритные внешние размеры.Это маленькая машина по современным меркам, ее почти можно обнять!

Багажник облицован заводским виниловым покрытием, которого я никогда раньше не видел, так как это было чем-то, что, вероятно, было легко разорвать и поэтому быстро выбросить. Полноразмерное запасное колесо плотно прилегает к левой стороне и дополняется двумя наборами инструментов и ножным воздушным насосом, все заводские детали. Да, по сегодняшним меркам это может показаться ошеломляющим, но от владельцев ВАЗов требовалось, чтобы мелкое обслуживание и ремонт выполнялись самостоятельно.В правой части багажника находится бензобак, который в некоторых других моделях Fiat был перенесен под заднее сиденье.

В городе маленький ВАЗ отлично справляется с пробками, но немного борется на скоростях шоссе. Пиковая мощность в 70 л.с. и квадратная форма просто не позволяют ему путешествовать, как S-класс или даже новый Hyundai Accent. И при этом, поскольку он был спроектирован во времени и в месте, где автострад просто не существовало, скорость более 60 миль в час редко достигалась и считалась быстрой.Двигатель имеет узкий диапазон мощности и не любит вращаться на скоростях, приближающихся к красной черте. Сцепление, рычаг переключения передач и рулевое управление создают ощущение органичного, беспрепятственного механического соединения с двигателем и шасси; это можно почувствовать и услышать. Судя по личному опыту вождения аналогичных автомобилей на большие расстояния, в наши дни это удивительно уникально, но становится утомительно.

Когда упал железный занавес, люди в Восточной Европе первым делом бросили свои дрянные коммунистические машины.Им нужно было что-нибудь, что угодно, с большей мощностью, большей надежностью и улучшенной экономией топлива. Они хотели иметь возможность слышать радио во время вождения и иметь достаточно мощности, чтобы безопасно обогнать трактор на узкой двухполосной дороге. Со временем у них развился вкус к статусу, который лучше всего проявляется в автомобилях. Однако в последние годы автомобили Восточного блока приобрели культовый и патриотический характер. Люди хотят их восстановить и сохранить. Для многих из тех людей, которые когда-то ненавидели, но теперь очаровательные автомобили, представляют собой важную эпоху в истории, которая свидетельствует о стойкости и победе над коммунистической тиранией.

Если вы хотите узнать больше об автомобилях Восточного блока, я предлагаю эту страницу в Facebook. Кроме того, в прошлом я рассматривал FSO Polonez и Lada Niva. Время от времени я пишу на Hooniverse статьи о странных и малоизвестных автомобилях и грузовиках, которые живут и умирают на улицах Польши; см. множество ссылок в этом сообщении.

Камил Калуски — редактор сайта Hooniverse.com на восточном побережье. Там можно найти его рассказы о восточноевропейских автомобилях, гонщиках за 500 долларов и прочей разной автомобильной атрибутике.

Связанные

9-цис-13,14-дигидроретиновая кислота представляет собой эндогенный ретиноид, действующий как лиганд RXR у мышей

PLoS Genet. 2015 июн; 11 (6): e1005213.

, ^{# 1 , 2 , ¤a *} , ^{3 , 4 , ¤b} , ^{3 , 4} , ^{3 , 4} , ^{5 , ¤c} , ^{6 , 7} , ^{3 , 4} , ^{6 , 7} , ² , ^{5 , ¤d} , ^{# 6 , 7 , *} и ^{# 3 , 4 , *}

Ральф Рюль

¹ Кафедра биохимии и молекулярной биологии медицинского факультета, Дебрецен, Венгрия,

² Paprika Bioanalytics BT, Дебрецен, Венгрия,

Agnieszka Krzyosiak

³ Институт генетики и биологической медицины и медицины (IGBMC), Илкирх, Франция; Inserm, U 964,

⁵ CNRS UMR 7104, Страсбургский университет, Страсбург, Франция,

Анна Невядомска-Чимицка

³ Институт генетики и биологической медицины и медицины (IGBMC), Илкирх, Франция; Inserm, U 964,

⁵ CNRS UMR 7104, Страсбургский университет, Страсбург, Франция,

Наташа Рошель

³ Institut de Genétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire (IGBMC), Илкирх, Франция; Inserm, U 964,

⁵ CNRS UMR 7104, Страсбургский университет, Страсбург, Франция,

Лайош Селес

⁵ DE-MTA «Lendület» Исследовательская группа иммуногеномики, Университет Дебрецен, Дебрецен, Венгрия,

Белен Ваз

⁶ Departamento de Química Orgánica и CINBIO, Facultad de Química, Universidade de Vigo, Виго, Испания,

⁷ Институт биомедицинских исследований Виго (IBIV), Виго, Испания,

Марта Витжих-Шиндлер

³ Институт генетики и биологической медицины и медицины (IGBMC), Илкирх, Франция; Inserm, U 964,

⁵ CNRS UMR 7104, Страсбургский университет, Страсбург, Франция,

Сусана Альварес

⁶ Departamento de Química Orgánica и CINBIO, Facultad de Química, Universidade de Vigo, Виго, Испания,

⁷ Институт биомедицинских исследований Виго (IBIV), Виго, Испания,

Моника Шкленар

² Paprika Bioanalytics BT, Дебрецен, Венгрия,

Ласло Надь

⁵ DE-MTA «Lendület» Исследовательская группа иммуногеномики, Университет Дебрецен, Дебрецен, Венгрия,

Энджел Р.de Lera

⁶ Departamento de Química Orgánica и CINBIO, Facultad de Química, Universidade de Vigo, Виго, Испания,

⁷ Институт биомедицинских исследований Виго (IBIV), Виго, Испания,

Войцех Кренжел

³ Институт генетики и биологической медицины и медицины (IGBMC), Илкирх, Франция; Inserm, U 964,

⁵ CNRS UMR 7104, Страсбургский университет, Страсбург, Франция,

Питер Маккаффери, редактор

¹ Кафедра биохимии и молекулярной биологии медицинского факультета, Дебрецен, Венгрия,

² Paprika Bioanalytics BT, Дебрецен, Венгрия,

³ Институт генетики и биологической медицины и медицины (IGBMC), Илкирх, Франция; Inserm, U 964,

⁵ CNRS UMR 7104, Страсбургский университет, Страсбург, Франция,

⁵ DE-MTA «Lendület» Исследовательская группа иммуногеномики, Университет Дебрецен, Дебрецен, Венгрия,

⁶ Departamento de Química Orgánica и CINBIO, Facultad de Química, Universidade de Vigo, Виго, Испания,

⁷ Институт биомедицинских исследований Виго (IBIV), Виго, Испания,

Университет Абердина, США,

^# Внесено поровну.

Я прочитал политику журнала, и у авторов этой рукописи есть следующие конкурирующие интересы: RR является владельцем Paprika Bioanalytics BT; RR и MS являются сотрудниками Paprika Bioanalytics BT; WK, RR и ARdL являются авторами патента на синтез и биомедицинские применения 9CDHRA.

Задумал и спроектировал эксперименты: WK RR ARdL. Проведены эксперименты: RR AK ANC NR LS BV MWS MS WK. Проанализированы данные: RR AK ANC NR LS MWS MS ARdL WK. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: SA LN RR.Написал статью: WK RR ARdL NR LS.

^¤a Текущий адрес: Лаборатория пищевой биоактивации и биоанализа, Исследовательский центр молекулярной медицины (RCMM), Университет Дебрецен, Дебрецен, Венгрия

^¤b Текущий адрес: Лаборатория молекулярных исследований Совета медицинских исследований (MRC) Биология, Кембридж, Великобритания

^¤c Текущий адрес: Департамент патологии и иммунологии Университета Женевы, Женева, Швейцария

^¤d Текущий адрес: Институт медицинских исследований Сэнфорд-Бернхэм, Орландо, Флорида, США Штаты Америки

Получено 24 октября 2014 г .; Принято 13 апреля 2015 г.

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии надлежащего указания автора и источника.

Эта статья цитируется в других статьях в PMC.

Дополнительные материалы

S1 Рис. Нарушение передачи сигналов RXR у мышей Rbp1 — / -. Дефицит рабочей памяти, наблюдаемый в задаче спонтанного чередования в Y-лабиринте, может быть нормализован у мышей Rbp1 — / -, но не у мышей Rxrγ — / — с использованием all- trans -ретиноевой кислоты (ATRA; 5 мг / кг), UVI2108. (1 мг / кг), MA (5 мг / кг), DHA (1 мг / кг), но не TTNPB (5 мг / кг) (n = 8-15 / группа).Все соединения применялись за 5–6 часов до тестирования, и все мыши были протестированы только один раз в этой задаче. Статистические различия, выявленные результатами теста PLSD Fisher, были указаны: **, p

(PDF)

GUID: BD610419-4E81-47FB-BDA7-269B2F0F6231

S2 Рис. Анализ тушения флуоресценции. (а) Пример спектров испускания флуоресценции для связывания возрастающих количеств 9CDHRA с RXRα LBD (1,25 мкМ). Кривые 1–7 соответствуют концентрациям 0, 0,2, 0,45, 0,6, 1, 1.6, 1,2 мкм 9CDHRA; (b) График нескорректированной флуоресценции RXRα LBD в присутствии увеличивающегося количества 9CDHRA. Анализ тушения флуоресценции по графику Когана, как описано в [34], приводит к значению Kd 90 ± 20 нМ и N = 0,7 ± 0,03. N соответствует количеству сайтов связывания.

(PDF)

GUID: DEA7B40C-C662-4FAB-A3CC-289CACD5C769

S3 Рис. Связывание 9CDHRA (R- и S-энантиомеры) с изотипами RAR LBD in silico и кристаллографические анализы связывания 9CDHRA с RX.(а) ESI-масс-спектры белка LBDs hRARα (вверху), hRARβ (в центре) и hRARγ (внизу) после инкубации с 5-кратным молярным избытком лигандов; (b) График распределения относительной доли процента связанного / свободного белка для изотипов hRAR для энантиомеров R- и S-9CDHRA и 9CRA. (c) Общая кристаллическая структура RXRalpha LBD в комплексе с R-9CDHRA. (d) Экспериментальная карта электронной плотности 2Fo-Fc лиганда R-9CDHRA с контуром 1 сигма. (e) Моделирование связывания S-9CDHRA в кармане связывания лиганда RXRalpha и суперпозиции S-9CDHRA (голубой) и R-9CDHRA (зеленый) показало, что боковая цепь S-9CDHRA занимает несколько иное положение из-за обратная конфигурация у C13, которая приводит к аналогичному взаимодействию карбоксильной группы, но требует изменения положения боковой цепи Phe313 (Helix H5), что должно приводить к более низкому сродству к RXR.S-9CDHRA, созданный с помощью программы Marvin, стыковался с белковой структурой комплекса R-9CDHRA.

(PDF)

GUID: 109579E7-1F92-4FD5-B692-5A2E49BD1C3D

S1 Таблица: Статистика сбора и уточнения данных. ^a R _sym = 100 × S _{h j} | I _{ч j} — I _ч > | / S _{ч j} I _{h j} , где I _{h j} — это j -е измерение интенсивности отражения h и I _ч > — его среднее значение. ^b R _крист. = 100 × S || F _o | — | F _c || / S | F _o |, где | F _o | и | F _c | — наблюдаемые и рассчитанные амплитуды структурных факторов соответственно. ^c Рассчитано с использованием случайного набора, содержащего 10% наблюдений, не учтенных при уточнении [57].

(PDF)

GUID: 2E9C95CE-2C6A-4CB0-BD20-B6D6F226A01B

S1 Текст: Дополнительная информация о материалах и методах и подробное описание процедур химического синтеза.(DOC)

GUID: B2F0EBC7-4EDF-42CA-9AFA-48952321CA1C

Заявление о доступности данных

Все соответствующие данные находятся в документе и файлах вспомогательной информации. Транскриптомные данные были депонированы в базу данных Gene Expression Omnibus под номером доступа. GSE48573.

Abstract

Ретиноидные X-рецепторы (RXR) представляют собой активируемые лигандом факторы транскрипции, которые гетеродимеризуются с рядом ядерных гормональных рецепторов, тем самым контролируя различные (пато) -физиологические процессы.Хотя синтетические лиганды RXR разработаны для лечения различных заболеваний, эндогенные лиганды для этих рецепторов окончательно не идентифицированы. Мы показываем здесь, что мыши, лишенные клеточного белка, связывающего ретинол ( Rbp1 — / — ), демонстрируют дефицит памяти, отражающий нарушенную передачу сигналов RXR. Используя ВЭЖХ-МС и химический синтез, мы идентифицировали у мышей Rbp1 — / — снижение уровней 9- цис--13,14-дигидроретиновой кислоты (9CDHRA), которая действует как лиганд RXR, поскольку связывает и трансактивирует RXR в различных анализы.9CDHRA восстанавливает фенотип Rbp1 — / — аналогично синтетическому лиганду RXR и проявляет аналогичную транскрипционную активность в культивируемых дендритных клетках человека. Высокие эндогенные уровни 9CDHRA у мышей указывают на физиологическую значимость этих данных и на то, что 9CDHRA действует как эндогенный лиганд RXR.

Об авторе

Ежедневное питание, помимо того, что является источником энергии, содержит микроэлементы, класс питательных веществ, включая витамины, которые необходимы для жизни и которые действуют, управляя огромным количеством физиологических и физиологических процессов, связанных с развитием.В процессе метаболизма питательные микроэлементы часто превращаются в свои биоактивные формы. Рецепторы ядерных гормонов представляют собой семейство белков, функционирующих как регулируемые лигандом факторы транскрипции, которые могут воспринимать такие биоактивные молекулы и транслировать эти сигналы в транскрипционные, адаптивные ответы. Рецепторы ретиноидов X занимают центральное место в этой передаче сигналов, поскольку они напрямую взаимодействуют и тем самым контролируют деятельность нескольких рецепторов ядерных гормонов. Мы сообщаем об идентификации новой биоактивной формы витамина А, которая является первой эндогенной формой этого витамина, способной связывать и активировать ретиноидные рецепторы X.Соответственно, мы показываем, что эта единственная молекула проявляет биологическую активность, аналогичную синтетическим агонистам ретиноидных рецепторов X, и координирует транскрипционную активность нескольких сигнальных путей ядерных рецепторов. Эти открытия могут иметь непосредственное биомедицинское значение, поскольку рецепторы ретиноидов X участвуют в контроле ряда физиологических функций и их патологии.

Введение

Микроэлементы, такие как витамин А и полиненасыщенные жирные кислоты, являются важными ингредиентами рациона млекопитающих и могут действовать как биоактивные молекулы.Рецепторы ядерных гормонов воспринимают такие молекулярные сигналы и, соответственно, регулируют экспрессию генов, таким образом функционируя как факторы транскрипции, контролируемые лигандами. Ретиноидные рецепторы X (RXR) занимают центральное место в передаче сигналов ядерных рецепторов как обязательные партнеры гетеродимеризации для некоторых из этих рецепторов. Лиганды RXR могут регулировать активность только некоторых гетеродимеров, включая, например, LXR-RXR или PPAR-RXR, которые вместе называются пермиссивными гетеродимерами в противоположность непермиссивным гетеродимерам, таким как RAR-RXR, которые не могут быть активированы только лигандами RXR [1,2 ].Лиганд-зависимая модуляция может быть особенно актуальной для контроля широкого спектра физиологических событий. Например, среди сложных функций рабочая память оказалась чувствительной к активности лиганда RXR у мышей [3], тогда как на клеточном и молекулярном уровне дифференцировка дендритных клеток, полученных из моноцитов, является одной из хорошо изученных экспериментальных моделей, используемых для изучения активности лигандов RXR [4,5]. Также известно, что такие лиганды действуют как мощные индукторы апоптоза в раковых клетках [6,7] или как модуляторы метаболизма липидов и глюкозы, что стимулировало их клиническое развитие для лечения рака и метаболических заболеваний [8].Недавние исследования антидепрессивной или нейрорегенеративной активности специфических агонистов RXR предполагают также их полезность для лечения некоторых психоневрологических или нейродегенеративных расстройств [3,9,10].

Параллельно с разработкой и использованием синтетических лигандов RXR было предложено несколько эндогенных агонистов [11,12,13], но их физиологическое значение остается под вопросом по разным причинам. Например, 9 -цис--ретиноевая кислота (9CRA), изомер полностью--транс--ретиноевой кислоты (ATRA), была предложена и широко принята в качестве эндогенного лиганда RXR [14,15].Однако, хотя 9CRA может связывать и активировать RXR в низких концентрациях, он либо не был обнаружен [16,17,18,19,20,21], либо не присутствовал в достаточных концентрациях [22], чтобы включить RXR-опосредованную передачу сигналов в организмах млекопитающих. Докозагексаеновая кислота (DHA), альтернативный лиганд RXR, как было показано, связывает и трансактивирует RXR в фармакологических условиях [11,23,24], но в физиологических условиях она может быть обнаружена в мозге в основном в этерифицированной форме, способствуя, например, структурные компоненты клетки, в то время как пул этой жирной кислоты, доступной для активации RXR, остается слишком низким [25,26].Наконец, фитановая кислота [27,28], также предполагаемая для связывания RXR, не была окончательно доказана физиологически значимой.

В этом исследовании мы рассмотрели природу известных и новых эндогенных ретиноидов и их роль в передаче сигналов RXR in vivo путем химических, молекулярных и функциональных исследований на различных моделях.

Результаты

Для поиска эндогенных ретиноидов, которые могут действовать как лиганд (ы) RXR, мы сначала использовали поведенческий и фармакологический анализы, чувствительные к передаче сигналов RXR, в качестве инструмента для идентификации моделей животных с пониженной передачей сигналов RXR.В частности, мы сосредоточились на пространственной рабочей памяти, о которой ранее сообщалось, что она зависит от функций RXR, а не RAR и, что более важно, также зависит от активности лиганда RXR [3]. Используя задачу отсроченного несоответствия месту (DNMTP), мы обнаружили, что мыши, несущие нулевую мутацию клеточного ретинол-связывающего белка I (RBP1), известного своей ролью в метаболизме ретиноидов [29], демонстрируют дефицит памяти, который фенокопирует эффект потеря функции Rxrγ, функционально преобладающего RXR в управлении рабочей памятью (и исх.[3]). В частности, Rbp1 ^{— / —} и Rxrγ ^{— / —} мыши показали значительно худшие результаты по сравнению с мышами дикого типа (WT) с 3 или 6-минутными интервалами между испытаниями (ITI) в задаче DNMTP, достигая уровня вероятности (полное забывание) уже через 6 минут, тогда как WT мыши работали на уровне случайности только через 12 или 18 минут в зависимости от индивидуума (см. серую часть левой панели). Эти данные предполагают, что передача сигналов RXR нарушена в Rbp1 ^{— / —} мышей.

Скомпрометированная сигнализация RXR в Rbp1 ^{— / —} мышей.

(а) Rbp1 ^{— / —} (n = 8) и Rxrγ ^{— / —} (n = 7) мыши приобрели задачу DNMTP рабочей памяти аналогично мышам WT (n = 8) (F [8,160] = 14, p <0,001; ANOVA на повторных измерениях) при обучении с 15 с интервалами между испытаниями (ITI), но показал забывание при тестировании через 3 и 6 минут ITI, которое было более быстрым, чем 12 или 18 минут у мышей WT (обозначено на графике как 12 минут ITI).(b) Агонист RXR или ATRA улучшили производительность рабочей памяти через 6 часов после обработки Rbp1 ^{— / —} мышей (n = 8), испытанных через 6 минут ITI или WT мышей (n = 8) через 12 или 18 минут ITI, но были неактивными в Rxrγ ^{— / —} мышей (n = 7) при ITI 6 мин. Скомпрометированная сигнализация RXR в Rbp1 ^{— / —} дополнительно поддерживался в задаче спонтанного чередования, отдельном тесте на рабочую память (S1 рис.).Статистические различия, выявленные с помощью теста Фишера PLSD, были обозначены как: *, p <0,05; **, p <0,01 по сравнению с контролем WT в соответствующих группах; $, p <0,05; $$, p <0,01; $$$, p <0,001 по сравнению с уровнем вероятности 50%.

Чтобы функционально оспорить эту гипотезу, мы воспользовались чувствительностью производительности рабочей памяти в отложенной задаче к лечению агонистами RXR [3]. Активация передачи сигналов RXR синтетическим агонистом RXR, UVI2108 (также известным как SR11217 или BMS649) или ATRA, который в фармакологических условиях быстро трансформирует in vivo в агонист RXR 9CRA [12,30], устраняет дефицит памяти в Rbp1. ^{— / —} мышей, но оставался неэффективным у мышей, лишенных RXRγ ().Дефицит рабочей памяти также наблюдался в отдельном, специфическом для грызунов тесте памяти спонтанного чередования в Y-лабиринте (S1 Рис). Лечение ATRA, UVI2108 и другими агонистами RXR, включая DHA и метопреновую кислоту, но не пан-RAR агонистом TTNPB, приводило к промнемоническим эффектам в Rbp1 ^{— / —} , но не Rxrγ ^{— / —} мышей (S1 фиг.), Что подтверждает возможность нарушения передачи сигналов RXR из-за пониженной доступности лиганда (ов) RXR в Rbp1 ^{— / —} мышей.Соответственно, сниженная экспрессия RXRγ не может объяснить поведенческие дефициты в Rbp1 ^{— / —} мышей. Напротив, экспрессия RXRγ явно увеличивалась в Rbp1 ^{— / —} полосатое тело с достижением уровня 3,2 ± 0,6 в Rbp1 ^{— / —} мышей по сравнению с 1,2 ± 0,3 условными единицами РНК (qRT-PCR).

Для оценки доступности лиганда RXR в Rbp1 ^{— / —} мышей, мы сначала рассмотрели концентрацию 9CRA в мозге и сыворотке мышей.Используя чувствительный метод обнаружения ретиноевой кислоты, основанный на разделении ВЭЖХ с последующим высокоспецифическим обнаружением DAD и деструктивным МС-МС [20], мы четко идентифицировали ATRA в сыворотке (0,3 ± 0,1 нг / мл) и головном мозге (0,6 ± 0,1 нг / г). ) образцов от мышей WT, тогда как в диапазоне элюции 9CRA не было идентифицировано убедительного пика, указывающего на то, что 9CRA отсутствует или его уровни были ниже нашего предела обнаружения 0,1 нг / г и, следовательно, слишком низки для достаточной активации RXR у WT () и Rbp1 ^{— / —} животных.Затем мы сосредоточились на дигидроретиноидах, описанных как новые эндогенные ретиноиды [31,32]. Используя стерео- и энантиоконтролируемый органический синтез, мы получили ряд дигидроретиноидов, включая полностью- транс -13,14-дигидроретиноевую кислоту (ATDHRA) и ее стереоизомер 9- цис -13,14-дигидроретиноевую кислоту (9CDHRA; см. Материалы и методы для деталей его синтеза), которые мы затем использовали в качестве контрольных молекул в анализах HPLC-MS-MS. Такие анализы были сосредоточены на печени, как основном месте экспрессии Rbp1, сыворотке, через которую ретиноиды распределяются в органы-мишени, и головном мозге с отдельными участками, экспрессирующими Rbp1 [33].Мы идентифицировали два основных пика, которые совместно элюировались стандартами ATDHRA и 9CDHRA при УФ-специфическом поглощении 290 нм (левая панель). Такое совместное элюирование также наблюдали при настройках МС-МС, специфичных для дигидроретиноидов (правая панель). Концентрации 9CDHRA были высокими в образцах сыворотки и достигли 118 ± 15 нг / мл (соответствует ~ 4 x 10 ^-7 M), 135 ± 12 нг / г в печени мыши (соответствует концентрации ~ 7×10 ^-7 . M) и относительно низкий (7 ± 1 нг / г, что соответствует ~ 2 x 10 ^-8 M) в головном мозге.Прямое сравнение этих метаболитов ретинола у дикого животного и однопометника Rbp1 ^{— / —} мышей () показали сравнимую концентрацию ATDHRA в отличие от значительно сниженных уровней 9CDHRA в сыворотке, печени и головном мозге Rbp1 ^{— / —} мышей. Важно отметить, что в то время как такое снижение сыворотки может быть причиной системного снижения передачи сигналов RXR, почти полная потеря доступности 9CDHRA в мозге Rbp1 ^{— / —} мышей предполагают более значительное снижение локальной передачи сигналов RXR в этом органе.Более того, измерения всего мозга, скорее всего, отражают более драматические изменения уровней 9CDHRA в отдельных областях мозга, экспрессирующих Rbp1 [33]. К сожалению, технически невозможно определить концентрацию ретиноидов в этих небольших областях, что может быть вызвано только измерениями всего мозга.

9CDHRA присутствует в сыворотке, мозге и печени мышей.

(a) Профили элюции образцов сыворотки мышей дикого типа (n = 7) и мозга (n = 3) в сравнении с тремя стандартами ретиноевой кислоты (все — транс [ATRA], 13– цис [13CRA] и 9 -цис ретиноевой кислоты [9CRA] со временем удерживания 10.4, 9,6 и 9,9 мин соответственно) позволяют идентифицировать ПТРК, но не 9CRA. Прямоугольники представляют области со сравнимым временем удерживания для определения пиков совместного элюирования. (b) 9- цис--13,14-дигидроретиновая кислота (9CDHRA; время удерживания 9,4 мин, выделено пунктирной линией) присутствует в сыворотке мыши (n = 7), головном мозге (n = 3) и печени (n = 7) образцы, определяемые совместным элюированием смесью 9CDHRA и всего — транс -13,14-дигидроретиновой кислоты (ATDHRA; время удерживания 9,9 мин, выделено сплошной линией) стандартным раствором и подтверждено МС- Детектирование МС (303-> 207 m / z) и DAD (290 нм).(c) Значительное снижение уровней 9CDHRA, но не ATDHRA в сыворотке, головном мозге и печени Rbp1 ^{— / —} животных (n = 8, n = 3 для мозга) по сравнению с мышами WT (n = 8, n = 3 для мозга). Все полосы погрешностей представляют S.E.M.

Прямое доказательство связывания 9CDHRA с RXR было получено с помощью масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением (ESI-MS), выполняемой в неденатурирующих условиях с очищенными доменами связывания лиганда RXR (LBD). Чтобы оценить относительное сродство R- и S-энантиомеров и 9CDHRA к RXR LBD, эксперименты по титрованию контролировали с помощью ESI-MS.Как показано на фиг.4, все ретиноиды связываются с hRXRα LBD, используемым в этих исследованиях в качестве модели RXR LBD из-за высокой консервативности структуры LBD среди всех RXR. Анализ амплитуды пиков показал, что сродство R-9CDHRA примерно на 30% ниже, чем сродство 9CRA, но примерно на 65% выше сродства, чем сродство S-9CDHRA. Количественная аффинность связывания с RXRa LBD, полученная с помощью анализа тушения флуоресценции (рис. S2), равна 90 ± 20 нМ для R-9CDHRA и 20 ± 10 нМ для 9CRA и попадает в диапазон опубликованных значений Kd [34], что указывает на то, что 9CDHRA связывает RXR. с высоким сродством в физиологически значимых концентрациях.Поскольку 9CRA может связываться с RAR, мы также протестировали сродство 9CDHRA ко всем трем изотипам RAR. Эксперименты ESI-MS, проведенные с LBD hRARα, β и γ (S3A и S3B, фиг.), Показали, что 9CDHRA (R и S) связывается со всеми изотипами LBD RAR.

9CDHRA связывает и трансактивирует RXR in vitro и проявляет активность, подобную агонистам RXR in vivo .

(a) ESI-масс-спектры белка hRXRα LBD после инкубации с 5-кратным молярным избытком 9CRA, R-9CDHRA и S-9CDHRA. (b) График распределения процентного содержания связанного hRXRα.(c) Увеличенное изображение, показывающее лиганд-связывающий карман RXRα, связанного с R-9CDHRA (серым цветом). Обозначены остатки в тесных контактах (<3,5 Å). Пунктирными линиями обозначены водородные связи, а красной сферой - молекула воды. (d) Наложение лиганд-связывающего кармана RXRalpha, связанного с R-9CDHRA (серый) и 9CRA (голубой, код PDB: 1XDK). На белок производили суперпозицию. Водородные связи с R-9CDHRA или 9CRA показаны серыми и голубыми пунктирными линиями соответственно. Молекулы воды показаны сферами (красный для RXR-R-9CDHRA и голубой для RXR-9CRA).(e) Активация транскрипции RXRα с помощью R-9CDHRA и S-9CDHRA по сравнению с 9CRA (10 ^-5 -10 ^-9 M) в RXR-репортерных клетках COS1. (f) 9CRA (10 ^-7 M) и оба энантиомера 9CDHRA (10 ^-5 M) индуцировали RXRα-опосредованную передачу сигналов. RXR-антагонист {«type»: «entrez-нуклеотид», «attrs»: {«text»: «LG101208», «term_id»: «1041427845», «term_text»: «LG101208»}} LG101208 (LG; 10 ^-6 M) снижение активности обоих энантиомеров 9CDHRA (10 ^-5 M).(g) Активация транскрипции гетеродимеров RAR-RXR с помощью R- и S-9CDHRA по сравнению с ATRA в RARα-RXRα-репортерных клетках COS1. (h) Возрастающие дозы R-9CDHRA обращали вспять дефицит рабочей памяти в Rbp1 ^{— / —} мышей и продемонстрировали промнемоническую активность у мышей WT (n = 8 / группа) в задаче DNMTP при тестировании с минимальным ITI, при котором мыши выполняли задания на уровне случайности (50%) и который составлял 6 мин. для Rbp1 — / — или 12 мин для мышей WT. ttt: ATRA в концентрации 10 ^–5 M был цитотоксичным.*, р <0,05. #, p <0,05; ##, p <0,01 по сравнению с лечением носителем в той же группе; $, p <0,05; $$, p <0,01; t-тест студента одной группы для сравнения с успеваемостью 50%. Все полосы погрешностей представляют S.E.M.

Для получения структурных доказательств связывания R-9CDHRA с RXR, hRXRα LBD кристаллизовали в комплексе с R-9CDHRA и пептидом из 13 остатков, содержащим ядерный рецептор-связывающую поверхность NR2 NCoA2. Обратите внимание, что остатки, выстилающие карман для связывания лиганда, строго консервативны между RXRα и RXRγ, и что выводы, сделанные для RXRα, будут также действительны для RXRγ.Структура, уточненная с разрешением 1,8 Å (таблица S1), выявила каноническую конформацию активного агониста, общую для всех ранее описанных LBD ядерного рецептора, связанного с агонистом, с 12 или 13 α-спиралями, организованными в трехслойный сэндвич (S3C и S3D, рис.). R-9CDHRA принимает такой же способ связывания, что и 9CRA [35,36], включая взаимодействия карбоксилатной группы лиганда с Arg316 (H5) и водородные связи с амидной группой Ala327 в бета-повороте (). Количество контактов между двумя лигандами одинаково, хотя некоторые взаимодействия слабее в случае R-9CDHRA по сравнению с 9CRA, например, взаимодействия с Leu436 (4.0 Å вместо 3,6 Å для 9CRA), Arg316 (2,7 Å вместо 2,3 Å) или Trp305 (4,3 Å вместо 3,5 Å), которые объясняют более слабое связывание R-9CDHRA. Сравнение in silico режима связывания S- и R-9CDHRA в RXRα LBP показало, что противоположная конфигурация в C13, приводящая к несколько иной конформации боковой цепи S-9CDHRA, может лежать в основе его более низкого сродства к RXR (S3E фиг.), Что дополнительно подтверждается более низким относительная аффинность связывания, измеренная с помощью ESI-MS.

Релевантность связывания рецепторов R-9CDHRA и S-9CDHRA для транскрипционной активности RXR была протестирована на линиях репортерных клеток COS1, трансфицированных экспрессионным вектором RXRα ().В соответствии с предыдущими сообщениями, 9CRA индуцировал транскрипцию репортерного гена в концентрациях, начинающихся от 10 ^-9 M, тогда как R-9CDHRA или S-9CDHRA проявляли активность, аналогичную 9CRA, хотя и в концентрациях выше 10 ^-7 M. Важно. , активность R- и S-9CDHRA на 10 ^-5 M предотвращалась совместной обработкой с RXR-антагонистом {«type»: «entrez-нуклеотид», «attrs»: {«text»: «LG101208 «,» term_id «:» 1041427845 «,» term_text «:» LG101208 «}} LG101208 на 10 ^-6 M ().9CDHRA также активировали передачу сигналов RAR-RXR в репортерных клетках модели COS1 (трансфицированных векторами экспрессии RARα и RXRα), начиная с 10 ^-6 M (). Учитывая, что все изотипы RXR имеют одинаковую структуру своих карманов связывания лиганда, настоящие данные, полученные с изотипом RXRα, показывают, что 9CDHRA может эффективно связываться со всеми RXR и индуцировать их транскрипционную активность в концентрациях, обнаруживаемых в физиологических условиях.

Поведенческий анализ показал, что модуляция 9CDHRA функций RXR также актуальна in vivo .Соответственно, острое лечение с помощью R-9CDHRA улучшило показатели памяти на Rbp1 ^{— / —} мышей по сравнению с обработкой носителем или уровнем вероятности 50% при тестировании в задаче DNMTP при ITI 6 мин (). Обработка R-9CDHRA также повышала производительность мышей WT при тестировании при длительных интервалах ITI, составляющих 12 или 18 минут, при этом соответствующие мыши WT, получавшие носитель, работали на уровне случайности. Такая обработка не улучшила характеристики Rxrγ . ^{— / —} мышей (57 ± 7% правильного выбора), что указывает на RXR-специфичность эффектов 9CDHRA, что дополнительно подтверждается аналогичными эффектами обработок 9CDHRA и UVI2108 (сравните).

Чтобы определить специфичность 9CDHRA для индукции RXR-зависимой транскрипционной активности на транскриптомном уровне и его способность активировать пермиссивные гетеродимеры, мы воспользовались преимуществами дифференцирующихся культур дендритных клеток, полученных из моноцитов человека, хорошо охарактеризованной модели in vitro для изучение передачи сигналов через RXR и его гетеродимеры [4,5]. Изменения экспрессии генов, индуцированные R-9CDHRA, S-9CDHRA, другими лигандами RXR или лигандами для партнеров RXR, показали, что R-9CDHRA и 9CRA регулируют примерно одинаковое количество транскриптов (518 и 450 соответственно;).Важно отметить, что 384 транскрипта одинаково регулируются обоими агонистами (), что соответствует 85% всех транскриптов, регулируемых 9CRA. В этом наборе группа из 61 транскрипта также регулируется LG268, синтетическим лигандом, специфичным для RXR, который использовался в нашем анализе в качестве эталона в предыдущих исследованиях этой модели [4,5]. Примечательно, что ни один из транскриптов не регулировался исключительно 9CRA и LG268, а не 9CDHRA, что указывает на то, что 9CDHRA индуцирует аналогичные изменения экспрессии генов, как 9CRA.

Молекулярные доказательства избирательной активации 9CDHRA RXR.

(a) Значительное перекрытие между глобальными изменениями транскрипции, вызванными R-9CDHRA (10 ^-5 M), 9CRA (10 ^-6 M) или синтетическим агонистом RXR (LG268; 10 ^-7 M), выявленные с помощью анализа ДНК-микрочипов в дифференцирующихся дендритных клетках человека, происходящих из моноцитов. (b) Сравнение диаграммы разброса кратных изменений для транскриптов, измененных обработками 9CRA и R-9CDHRA. (c) S- и R-9CDHRA, аналогично 9CRA и / или LG268 (см. столбцы «RXR»), индуцировали экспрессию генов (см. строки), идентифицированных ранее как прямые транскрипционные мишени LXR-RXR, PPAR-RXR и RAR. -RXR.Соответствующие транскрипты также индуцировались агонистами соответствующих RXR-гетеродимерных партнеров (см. Столбец «партнеры» и стрелки): GW3965 (LXRα / β; 10 ^-6 M), RSG (PPARγ; 10 ^{— 6} M), GW1516 (PPARδ; 10 ^-6 M) и AM580 (RAR; 10 ^-7 M).

Мы также исследовали способность 9CDHRA активировать пермиссивные гетеродимеры, например LXRα / γ-RXR, PPARγ -RXR и PPARδ-RXR.Как и ожидалось, мы обнаружили, что R-9CDHRA, подобно 9CRA и LG268, может индуцировать экспрессию многих генов, которые известны как прямые мишени пермиссивных гетеродимеров RXR. Соответственно, эти гены также регулируются LXR или PPAR-специфическими лигандами (). Чтобы выяснить, активирует ли 9CDHRA гены-мишени RAR-RXR, мы сравнили эффект лигандов RXR и AM580, синтетического селективного лиганда RARα. Обычно гены, индуцированные AM580, не индуцировались каким-либо другим агонистом пермиссивных партнеров (), но также индуцировались 9CDHRA или 9CRA.В совокупности профили экспрессии генов показали, что R- и S-9CDHRA проявляют активность агонистов RXR, но могут также активировать RAR, действуя таким образом с селективностью, аналогичной 9CRA.

Обсуждение

Хотя RXR занимают центральное положение в передаче сигналов нескольких ядерных гормональных рецепторов, действующих как их партнер по гетеродимеризации, эндогенный лиганд (ы) RXR, его метаболический путь и физиологические функции окончательно не определены. Оказалось, что Rbp1 ^{— / —} продемонстрировал фенотип, свидетельствующий о снижении передачи сигналов RXR, что нельзя отнести к снижению уровней экспрессии RXR или 9CRA, потенциального эндогенного лиганда RXR, который мы и другие не смогли обнаружить [16,17,18 , 19,20] у животных дикого типа.Используя химические подходы HPLC-MS и органического синтеза, мы идентифицировали 9CDHRA, новый эндогенный ретиноид, концентрации которого были значительно снижены в сыворотке, печени и головном мозге на Rbp1 ^{— / —} мышей. Несколько линий доказательств указывают на то, что обработка 9CDHRA активирует RXR in vitro и in vivo в физиологически значимых концентрациях, предполагая, что она действует как эндогенный агонист RXR.

Мы сообщаем здесь, что RBP1 модулирует поведение животных, контролируя доступность лиганда RXR.Соответственно, мыши, несущие нулевую мутацию RBP1, демонстрируют дефицит рабочей памяти, отличительный признак недостаточной передачи сигналов через RXRγ, функционально преобладающий RXR в контроле рабочей памяти у взрослых мышей [3,37]. Сниженная экспрессия RXRγ не учитывает эти изменения, предполагая скомпрометированную доступность лиганда RXR. Эта уникальная модель позволила нам найти эндогенный (ые) лиганд (ы) RXR. Поскольку наши первоначальные анализы не смогли обнаружить 9CRA у дикого типа и Rbp1 ^{— / —} мы обратили внимание на дигидроретиноиды, предложенные недавно в качестве новой группы биоактивных эндогенных ретиноидов [31].Используя условия ВЭЖХ-МС-МС, специфичные для обнаружения дигидроретиноевых кислот, включая 13,14-дигидроретиноевую кислоту, и с помощью органического синтеза мы обнаружили присутствие ATDHRA и 9CDHRA в сыворотке, печени и мозге мышей WT и Rbp1 ^{— / —} мышей. Концентрация 9CDHRA в сыворотке и печени была особенно высокой, в диапазоне от 4 до 7 × 10 ^-7 M, и намного ниже в экстрактах всего мозга у животных WT. Тем не менее они были значительно снижены во всех соответствующих образцах Rbp1 ^{— / —} мышей.

Пониженная доступность 9CDHRA в сыворотке крови в Rbp1 ^{— / —} мышей может быть результатом снижения синтеза 9CDHRA в печени, главном сайте экспрессии RBP1 [29]. Поскольку уровни ATDHRA были сопоставимы в сыворотке, печени и головном мозге WT и Rbp1 ^{— / —} мышей, сниженные уровни 9CDHRA в Rbp1 ^{— / —} мышей указывают на то, что RBP1 играет важную роль, в частности, в генерации различных форм 9- цис- -ретиноидов, как предполагалось ранее [38].Таким образом, 9CDHRA, подобно ATRA и 1,25-дигидрокси-витамину D3, может действовать эндокринным и паракринным образом как липидный гормон пищевого происхождения, распределяясь в сыворотке, но также синтезируясь локально в определенных органах [39,40]. Как следствие, снижение системных уровней 9CDHRA может взаимодействовать с локальным снижением его синтеза в определенных областях мозга Rbp1 ^{— / —} мышей, что приводит к нарушению активности RXR и мнемоническому дефициту. В пользу этой гипотезы, системное введение R-9CDHRA, энантиомера 9CDHRA, полученного стереоселективным химическим синтезом, нормализовало дефицит рабочей памяти в Rbp1 ^{— / —} мышей.То, что такие эффекты опосредуются RXR, можно предположить из-за отсутствия промнемонических эффектов 9CDHRA и других лигандов RXR у мышей, несущих нулевую мутацию RXRγ, функционально преобладающего RXR в контроле этих функций мозга [3].

Прямое доказательство связывания 9CDHRA с RXR обеспечивается масс-спектрометрией с ионизацией электрораспылением (ESI-MS), выполняемой в неденатурирующих условиях с использованием очищенного RXR LBD и анализа тушения флуоресценции. В частности, R-9CDHRA связывает RXR LBD с аффинностью, близкой к аффинности 9CRA, на что указывают соответствующие значения Kd 90 ± 20 нМ для 9CDHRA и 20 ± 10 нМ для 9CRA.Такие данные подтверждаются кристаллической структурой комплекса R-9CDHRA с RXR LBD, в котором R-9CDHRA принимает каноническую конформацию активного агониста, а карбоксилат взаимодействует с Arg316. Важно отметить, что энантиомер R-9CDHRA эффективно индуцирует транскрипционную активность RXR в анализах репортерных клеток при физиологически значимых концентрациях ниже 10 ^-6 М, что можно предотвратить совместным введением панантагониста RXR {«тип»: «энрез-нуклеотид» «,» attrs «: {» text «:» LG101208 «,» term_id «:» 1041427845 «,» term_text «:» LG101208 «}} LG101208.Хотя S-9CDHRA проявляет более низкое сродство к связыванию RXR LBD в ESI-MS, скорее всего, из-за обратного расположения атома углерода C20, он также активен в трансактивации RXR in vitro с пороговой концентрацией между 10 ^–7 и 10 ^-6 M.

На дальнейшую значимость 9CDHRA для активации RXR in vitro указывает регуляция транскрипционных мишеней пермиссивных гетеродимеров LXR-RXR или PPAR-RXR, которые, как известно, чувствительны к фармакологическим воздействиям. активация RXR, а также его партнеров-ядерных рецепторов.Такая активация была продемонстрирована на человеческих дендритных клетках, культивируемых in vitro , хорошо зарекомендовавшей себя модели для анализа передачи сигналов RXR [4,5]. Важно отметить, что почти все (68 из 72) транскриптов, регулируемых LG268 (RXR-специфический агонист), также регулируются 9CDHRA. Такой результат, полученный в ходе исследования транскриптомики, был очень похож на данные, полученные для 9CRA, который контролировал 61 из 72 транскрипционных мишеней LG268, что указывает на чрезвычайно высокую способность 9CDHRA и 9CRA контролировать транскрипционные мишени RXR.Такие гены, скорее всего, соответствуют пермиссивным гетеродимерам, а непрямые мишени лигандированных RXR и их регуляция свидетельствуют о том, что 9CDHRA может контролировать передачу сигналов RXR также в клетках человека. Высокая степень перекрытия между транскрипционной активностью 9CRA и 9CDHRA, которая выходит за рамки активации RXR-специфичных транскриптов, отражает их способность связывать и трансактивировать также RAR. То, что 9CRA и 9CDHRA действуют как смешанные агонисты RXR и RAR, подтверждается примерно 80% перекрытием транскрипционных изменений, индуцированных R-9CDHRA (или S-9CDHRA) и 9CRA.

В то время как 13,14-дигидроретинол был обнаружен Моисе и его коллегами [31] как метаболит печеночного ретинолсатуразы (RETSAT) в организме млекопитающих, другие дигидроретиноиды или их предшественники были также идентифицированы у других позвоночных [41,42], а также не были обнаружены. -позвоночные [43]. Помимо RETSAT-опосредованного метаболизма ретинола в качестве основного потенциального пути для эндогенного синтеза 9CDHRA, также апокаротиноиды и каротиноиды могут служить субстратами для дегидрирования через RETSAT или другие сатуразы с последующим синтезом дигидроретиноевых кислот [44,45].

Этот метаболический путь может быть филогенетически древним, поскольку ортологи RXR от нескольких видов беспозвоночных, включая моллюсков [46], примитивных хордовых, таких как amphioxus [47], и некоторых примитивных насекомых, таких как Tribolium [48] или Locusta migratoria [49] , 50] также обладают способностью связывать лиганды RXR. Вдобавок, Locusta migratora ultraspiracle (ортолог RXR мух) обнаруживает более высокое сродство к связыванию 9CRA, чем человеческий RXR [49], что повышает вероятность того, что 9CDHRA также может активировать путь USP и быть предковым лигандом RXR.Основываясь на наших данных, возникает соблазн предположить, что в дополнение к активным лигандам, происходящим из витамина A1 и витамина A2, 9CDHRA и его пищевые предшественники могут представлять третий новый отдельный путь метаболизма и передачи сигналов витамина A, который развился специально для контроля RXR. деятельность.

Таким образом, мы охарактеризовали 9CDHRA как первый эндогенный и физиологически значимый ретиноид, который действует как лиганд RXR у млекопитающих. Снижение функций памяти из-за нарушения передачи сигналов, опосредованной RXR, в Rbp1 ^{— / —} мышей являются результатом более низких уровней 9CDHRA в головном мозге, что отражает снижение транспорта в сыворотке и локальный синтез 9CDHRA в мозге в Rbp1 ^{— / —} мышей.Дальнейшее определение метаболических путей, участвующих в синтезе и передаче сигналов 9CDHRA, и его тканевой специфичности будет важно для дальнейшего понимания функционального значения 9CDHRA для физиологии, патологии и эволюции животных.

Материалы и методы

Животные

Rbp1 ^{— / —} и Rxrγ ^{— / — Мутанты} , а также контрольные мыши дикого типа (WT) были выращены на смешанном генетическом фоне (50% C57BL / 6J и 50% 129SvEms / j; разведение более 10 поколений) от гетерозиготных скрещиваний, как описано [29,51] и протестированы в возрасте 3 месяцев для химического анализа и 3–6 месяцев для поведенческого анализа.Всех мышей содержали группами по 4–5 мышей на клетку в цикле свет / темнота с 7 до 19 часов в индивидуально вентилируемых клетках (Techniplast, Италия). Еда (стандартная диета, D04 от SAFE, Франция) и вода были в свободном доступе. Все эксперименты проводились в соответствии с директивами Совета Европейского сообщества от 24 ноября 1986 г. (86/609 / EEC) и в соответствии с руководящими принципами CNRS и Министерства сельского и лесного хозяйства Франции (постановление 87848).

Поведенческие процедуры

Все поведенческие тесты проводились в Институте Clinique de la Souris (http: // www.ics-mci.fr/) в соответствии со стандартными рабочими процедурами. Для изучения рабочей памяти группы мышей, наивных в поведении, были протестированы в DNMTP в Т-лабиринте согласно протоколу, описанному ранее [52], с модификациями, облегчающими фармакологические тесты [3]. Спонтанное чередование оценивали в Y-лабиринте согласно протоколу, подробно описанному в S1 Text.

Аналитические процедуры

Образцы сыворотки и тканей для химического анализа были собраны во время световой фазы цикла свет / темнота между 3 и 4 часами дня, примерно через 9–10 часов после последнего основного приема пищи, что в наших условиях освещения происходит примерно 6-7 утра.Высокоэффективная жидкостная хроматография, масс-спектрометрия-масс-спектрометрия (ВЭЖХ-МС-МС) проводились при темно-желтом / желтом свете с использованием ранее утвержденного протокола [20]. Для обнаружения 13,14-дигидроретиноевой кислоты настройки MS-MS составляли 303 -> 207 m / z с использованием того же времени пребывания и энергии столкновения, сравнимых со специфическими настройками MS-MS ретиноевых кислот. Количественный анализ проводили, как описано ранее [20]. Для получения подробной информации о пробоподготовке см. S1 Text.

Репортерные линии клеток

Клетки COS1 поддерживали в среде DMEM с 10% FBS, 5% L-глутамином, 1% пенициллина стрептомицином в 24-луночных планшетах, и трансфекции проводили в трех повторностях.Клетки трансфицировали равными количествами соответствующих плазмид, включая Gal-RXRα-LBD для репортерной линии RXR или Gal-RARα-LBD и Gal-RXRα-LBD для репортерной линии RAR-RXR, репортерную плазмиду (репортерную конструкцию люциферазы Mh200-TKLuc с Сайт связывания GAL [53] и бета-галактозидаза (для расчета эффективности трансфекции). Подробные сведения о трансфекции и измерениях см. В S1 Text.

Анализы связывания

кДНК, кодирующих hRXRα LBD (223–462), hRARα LBD (153– 421), hRARβ LBD (169–414) и hRARγ LBD (178–423) клонировали в вектор pET28b для генерации слитых белков с N-концевым His-tag.Очистку проводили, как описано ранее [54,55], включая аффинную хроматографию с металлом и гель-фильтрацию. Для получения подробной информации о пробоподготовке, ESI-MS и анализе тушения флуоресценции см. S1 Text.

Структурный анализ RXR-LBD в комплексе с R-9CDHRA

Подробную информацию о кристаллизации, сборе рентгеновских данных и определении структуры можно найти в тексте S1, фигуре S3 и таблице S1. Координаты и структурные факторы хранятся в базе данных белков под кодами доступа 4ZSH.

Обработки животных

R-9CDHRA, UVI2108, ATRA (Sigma), DHA (Sigma), MA (Sigma) и TTNPB (Sigma) растворяли в этаноле и ДМСО, а затем смешивали с подсолнечным маслом, так что конечный раствор содержал 3% этанола и 3% ДМСО. Обработка носителя состояла из 3% этанола и 3% раствора ДМСО в подсолнечном масле. Лечение проводилось внутрибрюшинными инъекциями в соотношении объем / масса 3 мл / кг между 8-10 часами утра и за 5-6 часов до теста, как было ранее подтверждено [3].

Статистический анализ

Сравнение поведенческих характеристик мышей Rbp1 — / — и Rxrγ — / — проводили с использованием критерия Фишера с защищенным наименьшим значимым различием (PLSD).Фармакологические данные для лечения мышей WT и Rbp1 — / — или Rxrγ — / — были проанализированы с использованием двухфакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с лечением и генотипом как двумя независимыми факторами и поведенческими ответами как зависимыми переменными. Эволюцию кривых обучения у мышей WT, Rbp1 — / — и Rxrγ — / — проводили с использованием дисперсионного анализа с повторными измерениями. Глобальный и апостериорный статистический анализ проводился с использованием t-критерия Стьюдента для двухгрупповых сравнений. Существенные отличия указаны на соответствующих рисунках.

Химический синтез — Синтез дигидроретиноидов

Чтобы подтвердить, соответствует ли относительный сигнал MS-MS, обнаруженный при 303> 207 m / z, 9CDHRA, был проведен стереоселективный синтез обоих энантиомеров 9- цис -13,14-дигидроретиноевой кислоты осуществляют в соответствии с ранее описанной стратегией на основе катализируемого палладием сочетания Csp ² -Csp ² Suzuki [56]. Подробная информация о стереоконтролируемом синтезе, очистке и характеристике ( R ) — и ( S ) -энантиомеров 9- цис -13,14-дигидроретиноевой кислоты представлены в тексте S1.

Вспомогательная информация

S1 Рис.

Скомпрометированная передача сигналов RXR у мышей Rbp1 — / -.

Дефицит рабочей памяти, наблюдаемый в задаче спонтанного чередования в Y-лабиринте, может быть нормализован у мышей Rbp1 — / -, но не у мышей Rxrγ — / — с использованием all- trans -ретиноевой кислоты (ATRA; 5 мг / кг) , UVI2108 (1 мг / кг), MA (5 мг / кг), DHA (1 мг / кг), но не TTNPB (5 мг / кг) (n = 8-15 / группа). Все соединения применялись за 5–6 часов до тестирования, и все мыши были протестированы только один раз в этой задаче.Статистические различия, выявленные по результатам теста Фишера PLSD, указаны: **, p <0,01; ***, p <0,001 по сравнению с животными WT в соответствующей группе.

(PDF)

S2 Рис.

Анализ тушения флуоресценции.

(а) Пример спектров флуоресцентного излучения для связывания возрастающих количеств 9CDHRA с RXRα LBD (1,25 мкМ). Кривые 1–7 соответствуют концентрации 0, 0,2, 0,45, 0,6, 1, 1,6, 1,2 мкМ 9CDHRA; (b) График нескорректированной флуоресценции RXRα LBD в присутствии увеличивающегося количества 9CDHRA.Анализ тушения флуоресценции по графику Когана, как описано в [34], приводит к значению Kd 90 ± 20 нМ и N = 0,7 ± 0,03. N соответствует количеству сайтов связывания.

(PDF)

S3 Рис.

Связывание 9CDHRA (R- и S-энантиомеры) с изотипами LBD RAR in silico и кристаллографические анализы связывания 9CDHRA с RXR.

(a) ESI-масс-спектры белка LBDs hRARα (вверху), hRARβ (в центре) и hRARγ (внизу) после инкубации с 5-кратным молярным избытком лигандов; (b) График распределения относительной доли процента связанного / свободного белка для изотипов hRAR для энантиомеров R- и S-9CDHRA и 9CRA.(c) Общая кристаллическая структура RXRalpha LBD в комплексе с R-9CDHRA. (d) Экспериментальная карта электронной плотности 2Fo-Fc лиганда R-9CDHRA с контуром 1 сигма. (e) Моделирование связывания S-9CDHRA в кармане связывания лиганда RXRalpha и суперпозиции S-9CDHRA (голубой) и R-9CDHRA (зеленый) показало, что боковая цепь S-9CDHRA занимает несколько иное положение из-за обратная конфигурация у C13, которая приводит к аналогичному взаимодействию карбоксильной группы, но требует изменения положения боковой цепи Phe313 (Helix H5), что должно приводить к более низкому сродству к RXR.S-9CDHRA, созданный с помощью программы Marvin, стыковался с белковой структурой комплекса R-9CDHRA.

(PDF)

S1 Таблица

Статистика сбора и уточнения данных.

^a R _sym = 100 × S _{h j} | I _{ч j} — < I _ч > | / S _{ч j} I _{h j} , где I _{h j} — это j -е измерение интенсивности отражения h и < I _ч > — его среднее значение. ^b R _крист. = 100 × S || F _o | — | F _c || / S | F _o |, где | F _o | и | F _c | — наблюдаемые и рассчитанные амплитуды структурных факторов соответственно. ^c Рассчитано с использованием случайного набора, содержащего 10% наблюдений, не учтенных при уточнении [57].

(PDF)

S1 Текст

Дополнительная информация о материалах и методах, а также подробное описание процедур химического синтеза.

(DOC)

Благодарности

Пьера Шамбона и Паскаля Долле за критическое прочтение рукописи, Норберту Гизелинку и П.К. за предоставление руб1 ^{— / — линии мышей} , Анне Подлесны, Авроре Фернандес, Еве Папп и Кэрол Пелусо-Илтис за техническую помощь, Далиле Али-Хаджи и Элизе ЛеМаршан за уход за животными, Адлайн Пейдж за экспертизу в анализе рассеянного склероза. Аластеру МакИвену и персоналу, работающему с каналом луча в ESRF (Гренобль, Франция), за помощь во время сбора данных.

Заявление о финансировании

AK получил докторскую степень от министра науки Франции, ANC и MWS были поддержаны Национальным агентством исследований и Фондом медицинских исследований соответственно. NR признает ANR (ANR-11-BSV8-023) и Французскую инфраструктуру для интегрированной структурной биологии (FRISBI). Работа также поддержана проектом TÁMOP-4.2.2.A-11/1 / KONV-2012-0023 «ВЭД-ЭЛЕМ» и проектом TÁMOP-4.2.2.A-11/1 / KONV-2012-0031. . Проект реализуется в рамках Плана развития Новой Венгрии, софинансируемого Европейским социальным фондом и Европейским фондом регионального развития.Работа в лаборатории ARdL была поддержана грантами испанской MINECO (SAF2010-17935), Xunta de Galicia (грант 08CSA052383PR от DXI + D + i; Consolidación 2006/15 от DXPCTSUG; INBIOMED-FEDER «Unha maneira de facer Europa»; Parga Pondal Contract to BV). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Доступность данных

Все соответствующие данные находятся в документе и его файлах с вспомогательной информацией.Транскриптомные данные были депонированы в базу данных Gene Expression Omnibus под номером доступа. GSE48573.

Ссылки

1. Perez E, Bourguet W, Gronemeyer H, de Lera AR (2012) Модуляция функции RXR через дизайн лиганда. Биохим Биофиз Акта 1821: 57–69. 10.1016 / j.bbalip.2011.04.003 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 2. Шульман А.И., Ларсон С., Мангельсдорф Д.Д., Ранганатан Р. (2004) Структурные детерминанты активации аллостерического лиганда в гетеродимерах RXR. Клетка 116: 417–429.[PubMed] [Google Scholar] 3. Wietrzych-Schindler M, Szyszka-Niagolov M, Ohta K, Endo Y, Perez E, et al. (2011) Гамма рецептора ретиноида x участвует в модуляции докозагексаеновой кислотой поведения отчаяния и рабочей памяти у мышей. Биологическая психиатрия 69: 788–794. 10.1016 / j.biopsych.2010.12.017 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 4. Сатмари И., Торочик Д., Агостини М., Надь Т., Гурнелл М. и др. (2007) PPARgamma регулирует функцию дендритных клеток человека, прежде всего, изменяя метаболизм липидов.Кровь 110: 3271–3280. [PubMed] [Google Scholar] 5. Szeles L, Poliska S, Nagy G, Szatmari I, Szanto A, et al. (2010) Ресурсы исследований: профили транскриптомов генов, регулируемых RXR и его пермиссивными и непермиссивными партнерами в дифференцировке дендритных клеток, происходящих из моноцитов. Мол Эндокринол 24: 2218–2231. 10.1210 / me.2010-0215 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 6. Бём М.Ф., Чжан Л., Чжи Л., МакКлерг М.Р., Бергер Э. и др. (1995) Дизайн и синтез сильнодействующих селективных лигандов рецептора ретиноида X, которые индуцируют апоптоз в лейкозных клетках.J Med Chem 38: 3146–3155. [PubMed] [Google Scholar] 7. Шанкаранараянан П., Россин А., Ханвалкар Х., Альварес С., Альварес Р. и др. (2009) Рексиноидный апоптоз, антагонизированный факторами роста, включает пермиссивные гетеродимеры PPARgamma / RXR для активации внутреннего пути смерти под действием NO. Раковая клетка 16: 220–231. 10.1016 / j.ccr.2009.07.029 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 8. Altucci L, Leibowitz MD, Ogilvie KM, de Lera AR, Gronemeyer H (2007) Модуляция RAR и RXR при раке и метаболических заболеваниях. Nat Rev Drug Discov 6: 793–810.[PubMed] [Google Scholar] 9. Хуанг Дж. К., Джарджур А. А., Наит Умесмар Б., Кернинон С., Уильямс А. и др. (2011) Передача гамма-сигналов рецептора ретиноида X ускоряет ремиелинизацию ЦНС. Nat Neurosci 14: 45–53. 10.1038 / нн.2702 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 10. Лернер В., Миодовник С., Гибель А., Коваленок Е., Шлейфер Т. и др. (2008) Бексаротен как дополнение к антипсихотическому лечению пациентов с шизофренией: пилотное открытое испытание. Клин Нейрофармакол 31: 25–33. 10.1097 / WNF.0b013e31806450da [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 11.de Urquiza AM, Liu S, Sjoberg M, Zetterstrom RH, Griffiths W. и др. (2000) Докозагексаеновая кислота, лиганд ретиноидного рецептора X в мозге мыши. Наука 290: 2140–2144. [PubMed] [Google Scholar] 12. Heyman RA, Mangelsdorf DJ, Dyck JA, Stein RB, Eichele G, et al. (1992) 9-цис-ретиноевая кислота является лигандом с высоким сродством к рецептору ретиноида X. Клетка 68: 397–406. [PubMed] [Google Scholar] 13. Левин А.А., Штурценбекер Л.Дж., Казмер С., Босаковски Т., Хуселтон С. и др. (1992) Стереоизомер 9-цис-ретиноевой кислоты связывает и активирует ядерный рецептор RXR альфа.Природа 355: 359–361. [PubMed] [Google Scholar] 14. Алленби Г., Боквель М.Т., Сондерс М., Казмер С., Спек Дж. И др. (1993) Рецепторы ретиноевой кислоты и рецепторы ретиноидов X: взаимодействия с эндогенными ретиноевыми кислотами. Proc Natl Acad Sci U S A 90: 30–34. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 16. Сахи А.К., Гундерсен Т.Е., Ульвен С.М., Бломхофф Р., Лунданес Э. (1998) Количественное определение эндогенных ретиноидов в эмбрионах мыши с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с твердофазной экстракцией в режиме онлайн, переключением колонок и электрохимическим детектированием.J Хроматограф A 828: 451–460. [PubMed] [Google Scholar] 17. Ulven SM, Gundersen TE, Sakhi AK, Glover JC, Blomhoff R (2001) Количественные аксиальные профили ретиноевой кислоты в эмбриональном спинном мозге мыши: 9-цис-ретиноевая кислота обнаруживается только после экспериментального сверхвысокого уровня транс-ретиноевой кислоты . Дев Дин 222: 341–353. [PubMed] [Google Scholar] 18. Kane MA, Chen N, Sparks S, Napoli JL (2005) Количественная оценка эндогенной ретиноевой кислоты в ограниченных биологических образцах с помощью ЖХ / МС / МС. Biochem J 388: 363–369.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 19. Gundersen TE, Bastani NE, Blomhoff R (2007) Количественное высокопроизводительное определение эндогенных ретиноидов в плазме человека с использованием трехступенчатой ​​жидкостной хроматографии / тандемной масс-спектрометрии. Масс-спектрометр Rapid Commun. 21: 1176–1186. [PubMed] [Google Scholar] 20. Rühl R (2006) Метод определения 4-оксо-ретиноевой кислоты, ретиноевой кислоты и ретинола в сыворотке и экстрактах клеток с помощью жидкостной хроматографии / тандемной масс-спектрометрии с химической ионизацией при атмосферном давлении.Масс-спектрометр Rapid Commun. 20: 2497–2504. [PubMed] [Google Scholar] 21. Вольф G (2006). Является ли 9-цис-ретиноевая кислота эндогенным лигандом для рецептора X ретиноевой кислоты? Nutr Rev 64: 532–538. [PubMed] [Google Scholar] 22. Арнольд С.Л., Амори Дж. К., Уолш Т. Дж., Изохерранен Н. (2012) Чувствительный и специфический метод измерения нескольких ретиноидов в сыворотке человека с помощью УВЭЖХ-МС / МС. J Lipid Res 53: 587–598. 10.1194 / мл. D019745 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 23. Fan YY, Spencer TE, Wang N, Moyer MP, Chapkin RS (2003) Химиопрофилактические жирные кислоты n-3 активируют RXRalpha в колоноцитах.Канцерогенез 24: 1541–1548. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 24. Egea PF, Mitschler A, Moras D (2002) Молекулярное распознавание агонистических лигандов с помощью RXR. Мол Эндокринол 16: 987–997. [PubMed] [Google Scholar] 25. Элабдин Х.Р., Мустафа М., Шкленар М., Рюль Р., Али Р. и др. (2013) Соотношение про-рассасывающихся и провоспалительных предшественников липидных медиаторов как потенциальных маркеров агрессивного пародонтита. PLoS One 8: e70838 10.1371 / journal.pone.0070838 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 26.Szklenar M, Kalkowski J, Stangl V, Lorenz M, Rühl R (2013) Эйкозаноиды и докозаноиды в плазме и аорте здоровых и атеросклеротических кроликов. J Vasc Res 50: 372–382. 10.1159 / 000350865 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 27. Китареван С., Бурка Л.Т., Томер К.Б., Паркер С.Е., Детердинг Л.Дж. и др. (1996) Метаболиты фитола представляют собой циркулирующие пищевые факторы, которые активируют ядерный рецептор RXR. Клетка Mol Biol 7: 1153–1166. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 28. Lemotte PK, Keidel S, Apfel CM (1996) Фитановая кислота является лигандом ретиноидного рецептора X.Eur J Biochem 236: 328–333. [PubMed] [Google Scholar] 29. Гизелинк Н.Б., Бавик С., Сапин В., Марк М., Бонье Д. и др. (1999) Клеточный ретинол-связывающий белок I необходим для гомеостаза витамина А. Embo J 18: 4903–4914. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 30. Duell EA, Kang S, Voorhees JJ (1996) Изомеры ретиноевой кислоты, нанесенные на кожу человека in vivo, индуцируют 4-гидроксилазу, которая инактивирует только транс-ретиноевую кислоту. J Invest Dermatol 106: 316–320. [PubMed] [Google Scholar] 31. Моис А.Р., Кукса В., Иманиши Ю., Пальчевски К. (2004) Идентификация полностью транс-ретинола: полностью-транс-13,14-дигидроретинол сатуразы.J Biol Chem 279: 50230–50242. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 32. Ширли М.А., Беннани Ю.Л., Бём М.Ф., Бро А.П., Патирана С. и др. (1996) Окислительный и восстановительный метаболизм 9-цис-ретиноевой кислоты у крыс. Идентификация 13,14-дигидро-9-цис-ретиноевой кислоты и ее тауринового конъюгата. Утилизация метаболизма лекарств 24: 293–302. [PubMed] [Google Scholar] 33. Lein ES, Hawrylycz MJ, Ao N, Ayres M, Bensinger A и др. (2007) Полногеномный атлас экспрессии генов в мозге взрослой мыши. Природа 445: 168–176.[PubMed] [Google Scholar] 34. Чен З.П., Шемшдини Л., Дюран Б., Ной Н., Шамбон П. и др. (1994) Чистый и функционально гомогенный рекомбинантный рецептор ретиноида X. J Biol Chem 269: 25770–25776. [PubMed] [Google Scholar] 35. Эгеа П.Ф., Митчлер А., Рохель Н., Руфф М., Шамбон П. и др. (2000) Кристаллическая структура лиганд-связывающего домена RXRalpha человека, связанного с его природным лигандом: 9-цис-ретиноевой кислотой. Embo J 19: 2592–2601. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 36. Погенберг В., Гишоу Дж. Ф., Виват-Ханна В., Каммерер С., Перес Э. и др.(2005) Характеристика взаимодействия между гетеродимерами рецептора ретиноевой кислоты / ретиноидного рецептора X (RAR / RXR) и транскрипционными коактиваторами посредством исследований структурной и флуоресцентной анизотропии. J Biol Chem 280: 1625–1633. [PubMed] [Google Scholar] 37. Krzyzosiak A, Szyszka-Niagolov M, Wietrzych M, Gobaille S, Muramatsu S и др. (2010) Гамма-контроль ретиноидных рецепторов аффективного поведения включает передачу дофаминергических сигналов у мышей. Нейрон 66: 908–920. 10.1016 / j.neuron.2010.05.004 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 38.Kane MA, Bright FV, Napoli JL (2011) Сродство связывания CRBPI и CRBPII для 9-цис-ретиноидов. Биохим Биофиз Акта 1810: 514–518. 10.1016 / j.bbagen.2011.02.009 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 39. Prosser DE, Jones G (2004) Ферменты, участвующие в активации и инактивации витамина D. Trends Biochem Sci 29: 664–673. [PubMed] [Google Scholar] 40. Rühl R, Bub A, Watzl B (2008) Модуляция концентраций транс-ретиноевой кислоты в плазме за счет потребления овощей, богатых каротиноидами.Питание 24: 1224–1226. 10.1016 / j.nut.2008.05.022 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 41. Айдемир Дж., Касири Й., Бирта Э, Беке Дж., Гарсия А. Л. и др. (2013) Производные ликопина биоактивные рецепторы ретиноевой кислоты / метаболиты, активирующие рецепторы ретиноида-X, могут иметь отношение к противораковому потенциалу ликопина. Мол Нутр Фуд Рес 57: 739–747. 10.1002 / mnfr.201200548 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 42. Моис А.Р., Искен А., Домингес М., де Лера А.Р., фон Линтиг Дж. И др. (2007) Специфичность ретинолсатуразы рыбок данио: образование полностью транс-13,14-дигидроретинола и полностью транс-7,8-дигидроретинола.Биохимия 46: 1811–1820. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 43. Foster JM, Pennock JF, Marshall I, Rees HH (1993) Биосинтез изопреноидных соединений в Schistosoma mansoni. Мол Биохим Паразитол 61: 275–284. [PubMed] [Google Scholar] 44. Гурантон Э., Айдемир Г, Рейно Э., Маркоторчино Дж., Малезет С. и др. (2011) Апо-10′-ликопеновая кислота влияет на биологию жировой ткани через рецепторы ретиноевой кислоты. Биохим Биофиз Акта 1811: 1105–1114. 10.1016 / j.bbalip.2011.09.002 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 45.Sicilia T, Bub A, Rechkemmer G, Kraemer K, Hoppe PP, et al. (2005) Новые метаболиты ликопина обнаруживаются в плазме недожвачных телят после приема ликопина. J Nutr 135: 2616–2621. [PubMed] [Google Scholar] 46. де Гроот А., де Росни Э., Джуллан-Бинар С., Феррер Дж. Л., Лауде В. и др. (2005) Кристаллическая структура нового тетрамерного комплекса связанного с агонистом лиганд-связывающего домена ретиноидного X-рецептора Biomphalaria glabrata. Дж Мол Биол 354: 841–853. [PubMed] [Google Scholar] 47. Tocchini-Valentini GD, Rochel N, Escriva H, Germain P, Peluso-Iltis C, et al.(2009) Структурное и функциональное понимание лиганд-связывающего домена недуплицированного ретиноидного ядерного рецептора X из хордовых амфиоксусов беспозвоночных. J Biol Chem 284: 1938–1948. 10.1074 / jbc.M805692200 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 48. Ивема Т., Биллас И.М., Бек Й., Боннетон Ф., Ниренгартен Х. и др. (2007) Структурная и функциональная характеристика нового типа лиганд-независимого рецептора RXR-USP. Embo J 26: 3770–3782. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 49. Новицкий С.М., Читален Ю.В., Камерон Д., Тышенко М.Г., Петкович М. и др.(2008) Ретиноидные рецепторы X саранчи: 9-цис-ретиноевая кислота в эмбрионах примитивных насекомых. Proc Natl Acad Sci U S A 105: 9540–9545. 10.1073 / pnas.0712132105 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 50. Palli SR, Kapitskaya MZ, Potter DW (2005) Влияние гетеродимерного партнера ультраспиракла / ретиноидного рецептора X на функцию рецептора экдизона. FEBS J 272: 5979–5990. [PubMed] [Google Scholar] 51. Крезель В., Дупе В., Марк М., Диерих А., Кастнер П. и др. (1996) RXR gamma null мыши, очевидно, нормальны, а мыши с мутантными RXR alpha + / — / RXR beta — / — / RXR gamma — / — жизнеспособны.Proc Natl Acad Sci U S A 93: 9010–9014. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 52. Wietrzych M, Meziane H, Sutter A, Ghyselinck N, Chapman PF и др. (2005) Дефицит рабочей памяти у мышей с гамма-дефицитом ретиноидных рецепторов X. Learn Mem 12: 318–326. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 53. Надь Л., Као Х.Й., Лав Д.Д., Ли С., Банайо Э. и др. (1999) Механизм связывания и высвобождения корепрессора из рецепторов ядерных гормонов. Genes Dev 13: 3209–3216. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 54.Липперт В.П., Буршка С., Гоц К., Каупп М., Иванова Д. и др. (2009) Кремниевые аналоги RXR-селективного ретиноидного агониста SR11237 (BMS649): химия и биология. ChemMedChem 4: 1143–1152. 10.1002 / cmdc.200

0 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 55. Osz J, Brelivet Y, Peluso-Iltis C, Cura V, Eiler S и др. (2012) Структурная основа молекулярного аллостерического механизма контроля связывания кофактора с ядерными рецепторами. Proc Natl Acad Sci U S A 109: E588–594. 10.1073 / pnas.1118192109 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 56.Pazos Y, Iglesias B, de Lera AR (2001) Реакция сочетания Сузуки в стереоконтролируемом синтезе 9-цис-ретиноевой кислоты и ее деметилированных по кольцу аналогов. J Org Chem 66: 8483–8489. [PubMed] [Google Scholar] 57. Brunger AT (1992) Free R value: новая статистическая величина для оценки точности кристаллических структур. Природа 355: 472–475. [PubMed] [Google Scholar]

CD44 — это маркер отрицательной клеточной поверхности для идентификации плюрипотентных стволовых клеток во время репрограммирования человеческих фибробластов

Цитата: Quintanilla RH Jr, Asprer JST, Vaz C, Tanavde V, Lakshmipathy U (2014) CD44 Маркер отрицательной клеточной поверхности для идентификации плюрипотентных стволовых клеток во время репрограммирования человеческих фибробластов.PLoS ONE 9 (1): e85419. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0085419

Редактор: Маурилио Сампаолези, Институт исследования стволовых клеток, Бельгия

Поступила: 1 сентября 2013 г .; Принята к печати: 26 ноября 2013 г .; Опубликовано: 9 января 2014 г.

Авторские права: © 2014 Quintanilla et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Нет текущих внешних источников финансирования для этого исследования.

Конкурирующие интересы: Обратите внимание, что авторы RHQ, JSTA и UL работают в Life Technologies и получают финансовую компенсацию. Это не влияет на соблюдение авторами всех политик PLOS One в отношении обмена данными и материалами.

Введение

Технологии репрограммирования позволяют множеству соматических клеток, включая фибробласты и лимфоциты, переходить в состояние, подобное эмбриональным стволовым клеткам (ESC), что приводит к образованию индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) [1], [2] ], [3], [4].На сегодняшний день исследования показывают, что репрограммирование — это сложный процесс с промежуточными стадиями репрограммирования, характеризующимися уникальными паттернами экспрессии генов [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]. Недавно сообщалось, что для репрограммирования фибробластов эти промежуточные продукты временно повышают регуляцию эпидермальных генов, в то же время подавляя гены фибробластов и повышая регуляцию генов плюрипотентности [12].

Процесс репрограммирования занимает недели и требует ранней идентификации и выделения полностью перепрограммированных колоний ИПСК из мастер-планшета, в котором часто преобладают неперепрограммированные фибробласты и частично перепрограммированные промежуточные соединения [13].Современные методы выделения включают визуальный осмотр морфологии колоний или окрашивание на маркеры поверхности стволовых клеток, такие как стадийно-специфический эмбриональный антиген (SSEA4) и антигены отторжения опухоли (TRA-1-60, TRA-1-81) [14], [15] , [16]. Окрашивание щелочной фосфатазой (ЩФ) также используется для идентификации плюрипотентных стволовых клеток (PSC), хотя общие протоколы нарушают целостность клеток и поэтому применимы только для концевого окрашивания [17], [18], [19]. Недавно мы сообщили о новом методе окрашивания AP-положительных клеток при сохранении здоровья клеток [20].

Вышеупомянутые методы позволяют различать непрограммированные родительские соматические клетки и перепрограммированные клетки. Однако они не могут отличить полностью перепрограммированные ИПСК от частично перепрограммированных промежуточных продуктов, которые часто образуют сходные колонии и экспрессируют гены плюрипотентности [13], [21]. Двойное окрашивание положительными и отрицательными маркерами PSC предлагает более надежный метод отличия полностью перепрограммированных iPSC от промежуточных продуктов репрограммирования. Такая комбинация маркеров ранее использовалась для уточнения идентификации полностью перепрограммированных колоний на основе SSEA4, TRA-1-60 и маркера фибробластов CD13 [21].

Здесь мы создали и охарактеризовали 8 полностью перепрограммированных и 2 частично перепрограммированных образца. Затем мы провели скрининг на дифференциально экспрессируемые маркеры в глобальном исследовании экспрессии генов, сравнивая эти образцы, а также родительские фибробласты и ESC. Одним маркером, который дифференциально экспрессировался между плюрипотентными клетками и частично перепрограммированными или неперепрограммированными фибробластами, был CD44. CD44 — поверхностный гликопротеин, который служит рецептором гиалуроновой кислоты [22]. Он экспрессируется в большом количестве типов клеток, включая эпителиальные клетки и лимфоциты [23], [24], и участвует в клеточной адгезии, миграции клеток, хоминге лимфоцитов и эпителиально-мезенхимальных переходах [23], [25].

Используя непрямую иммунофлуоресценцию и проточную цитометрию, мы подтвердили, что CD44 устойчиво экспрессируется в человеческих фибробластах, постепенно теряется по мере продвижения репрограммирования и отсутствует в установленных PSC. Хотя клоны могут образовывать отдельные колонии и экспрессировать маркеры плюрипотентности, они различаются по степени репрограммирования и экспрессии CD44. Комбинированное использование маркера отрицательной селекции CD44 и маркера положительной плюрипотентности SSEA4 позволяет легче и раньше обнаруживать полностью перепрограммированные колонии ИПСК.

Материалы и методы

Все реагенты были от Life Technologies, если не указано иное.

Ячейки

Эмбриональные стволовые клетки человека H9 (WA09), полученные от исследовательского института WiCell, и линия эпизомальных ИПСК человека Gibco® доступны в продаже. Фибробласты крайней плоти новорожденных человека (штамм BJ) были приобретены в ATCC® и выращены в среде фибробластов, состоящей из DMEM, 10% ESC-квалифицированного FBS и 10 мМ MEM заменимых аминокислот (MEM-NEAA). Митотически инактивированные эмбриональные фибробласты мыши (MEF) были приобретены у Millipore и выращены на белке фактора прикрепления (коллаген) в среде DMEM, содержащей 10% FBS, пригодный для клеток ESC, 10 мМ раствор MEM-NEAA и 55 мМ 2-меркаптоэтанол.

Культура ЭСК и ИПСК человека

Питатель-зависимые ЭСК H9, коммерчески доступные линии ИПСК и созданные внутри страны ИПСК культивировали в среде ИПСК человека, содержащей среду DMEM / F-12, содержащую 20% KnockOut. ^TM Замена сыворотки (KSR), 10 мМ раствор MEM-NEAA, 55 мМ 2-меркаптоэтанола и 4 нг / мл основного FGF на питающих слоях MEF и выдерживают в увлажненном инкубаторе с 5% CO ₂ , 37 ° C. Для культур без питателя, ESC и iPSC культивировали в StemPro® hESC SFM с добавлением 100 мМ 2-меркаптоэтанола и 8 нг / мл основного FGF, и выращивали на не содержащей LDEV hESC, квалифицированной матрице базальной мембраны с пониженным фактором роста Geltrex®, покрытой поверхности, обработанные культурой ткани.ЭСК и ИПСК обычно пассировали с использованием коллагеназы IV типа. Клоны ИПСК были механически собраны и размножены на ранних стадиях репрограммирования.

Перепрограммирование

фибробластов BJ высевали с подходящей плотностью посева на чашки, обработанные культурой ткани, в среде для фибробластов. Клетки трансдуцировали в течение ночи с помощью набора для репрограммирования CytoTune®-iPS Sendai с использованием множественности инфицирования (MOI) 3 для каждого содержащего фактор вируса (OKSM) в соответствии с руководством по продукту.Ночные трансдукции, выполненные на фибробластах BJ с использованием набора для репрограммирования CytoTune®-iPS 2.0 Sendai, использовали MOI 5-5-3 для вирусов, кодирующих KOS, hc-myc и hKlf4, соответственно. Через семь дней после трансдукции клетки собирали в суспензию отдельных клеток и повторно высевали при желаемой плотности на питатели MEF в среде iPSC человека или на Geltrex ™ и StemPro® hESC SFM. Компактные колонии с отличительными чертами плюрипотентных стволовых клеток начинают появляться примерно через 2 недели после трансдукции. Колонии через 21–28 дней после трансдукции были идентифицированы на основании высокой активности щелочной фосфатазы с использованием AP Live Stain.Индивидуальные клоны оценивали с помощью иглы 27-го размера, отбирали вручную и расширяли дальше.

Epi5 ^TM Эпизомальное репрограммирование ИПСК и репрограммирование на основе мРНК (StemGent) выполняли в соответствии с инструкциями производителей. Для получения дополнительной информации см. Методы S1.

Эксперименты по перепрограммированию проводили с использованием набора для перепрограммирования CytoTune®-iPS Sendai, если не указано иное.

Анализ кариотипирования

Услуги по кариотипированию были предоставлены Cell Line Genetics®.Результаты были основаны на цитогенетическом анализе, проведенном с использованием техники GTL-бэндинга на двадцати метафазных клетках с G-полосой.

Окрашивание AP

культур ESC и iPSC дважды промывали средой DMEM / F-12 перед окрашиванием живых AP. Затем культуры инкубировали в течение 20 минут с AP Live Stain, разведенным 1-500 в DMEM / F-12. После инкубации культуры трижды промывали DMEM / F-12 и визуализировали на наличие зеленых флуоресцентно меченных колоний под стандартным фильтром FITC. Колонии были отмечены для выбора и расширения, где это было необходимо.После визуализации базальную среду заменяли свежей средой для выращивания ИПСК человека, и выбранные колонии либо собирали вручную, либо возвращали в нормальные условия культивирования.

Для окрашивания концевых AP см. Методы S1.

Формирование и дифференциация эмбриоидных телец

колоний PSC были отделены и уменьшены до более мелких кластеров клеток с использованием коллагеназы IV и легкого растирания. Кластеры клеток высевали на необработанные чашки Петри и выращивали в среде ИПСК человека без основного FGF в течение 4 дней с регулярной сменой сред.Затем клеточные кластеры переносили на планшеты, покрытые Geltrex®, для прикрепления и инкубировали в течение 21 дня при регулярной смене среды.

Иммуноцитохимия

Для окрашивания живых клеток и проточной цитометрии антитела к поверхностным маркерам разводили в DMEM / F-12. Неконъюгированные первичные антитела, использованные в этом исследовании, были анти-SSEA4 (1–200), анти-TRA-1-60 (1–200) и анти-CD44 (2 мкг), которые исследовали с помощью Alexa Fluor® 488- ( 1-500) и вторичных антител, конъюгированных с Alexa Fluor® 594- (1-500).Предварительно конъюгированный анти-SSEA4-Alexa Fluor® 647 (15 мкл на реакцию) также использовали для окрашивания. Промывки и визуализации выполнялись с помощью DMEM / F-12.

Истощение CD44-экспрессирующих клеток на основе гранул после окрашивания вживую описано в Методах S1 вместе с последующим анализом количественной полимеразной цепной реакции (QPCR).

Чтобы проверить потенциал трехлинейной дифференцировки 21-дневных EB с помощью внутриклеточной иммуноцитохимии, клетки фиксировали 4% параформальдегидом (US Biologicals) и повышали проницаемость, используя блокирующий раствор, состоящий из 5% нормальной козьей сыворотки, 1% BSA и 0.1% Triton X-100 в dPBS. Первичные антитела против α-фетопротеина (AFP, 1–1000), актина гладких мышц (SMA, 1–50) и тубулина β-III (βIIITub, 1–1000) разводили в том же блокирующем растворе и исследовали с помощью Alexa Fluor. ® 594-конъюгированные вторичные антитела (1–500). Образцы промывали dPBS.

Для исключения неспецифического окрашивания использовали контрольные образцы изотипа

IgG. Изображения были получены с использованием микроскопа Zeiss Axio Observer.Z1 и программного обеспечения Axiovision. Проточную цитометрию выполняли с использованием системы проточной цитометрии BD FACSCanto ™ или цитометра с акустической фокусировкой Attune® и анализировали с помощью аналитического программного обеспечения FlowJo.Получение и анализ изображений с интервальной съемкой выполняли с использованием системы обработки изображений в реальном времени IncuCyte ^TM FLR (Essen BioScience).

Анализ на микрочипах

Образцы, использованные для анализа экспрессии генов, представляли собой фибробласты BJ (n = 2), ESC H9 (n = 4), частично перепрограммированные ИПСК (n = 2) и полностью перепрограммированные ИПСК (n = 8) (Таблица 1). Тотальную РНК выделяли из клеток с использованием реагента TRIzol®, при этом загрязняющую геномную ДНК удаляли с помощью набора DNA-free ™. Полученную РНК оценивали на качество с помощью гель-электрофореза и обрабатывали для матричной гибридизации с HT-12 v4 человека.0 Массив Beadchip, предложенный производителем (Illumina).

Гибридные матрицы сканировали конфокальным сканером Illumina Bead array reader. Данные были проанализированы с помощью сетевого программного обеспечения с открытым доступом PluriTest ™, а также загружены в GenomeStudio (Illumina) для вычитания фона и преобразования в файл Partek для анализа данных в Partek® Genomics Suite ™ (Partek Incorporated). Дифференциально экспрессируемые гены получали с использованием однофакторной модели ANOVA. Три категории образцов, а именно ЭСК H9, частично перепрограммированные ИПСК и полностью перепрограммированные ИПСК, сравнивались с образцами фибробластов BJ (взятыми в качестве контроля), и значимые списки дифференциально экспрессируемых генов были получены с использованием порогового значения ложной скорости обнаружения, равного 0.05 и отсечка кратности изменения 2. Затем дифференциально экспрессируемые гены фильтровали в соответствии с клеточным положением (плазматическая мембрана) с использованием анализа пути изобретательности (Ingenuity® Systems). Канонический анализ пути Wnt / бета-катенина также проводили с использованием анализа пути изобретательности.

Подмножества данных экспрессии генов, которые использовались для построения графиков, также подвергали статистическому анализу ANOVA.

Данные микрочипов, обсуждаемые в этой публикации, депонированы в NCBI Gene Expression Omnibus [26] и доступны через регистрационный номер серии GEO GSE51980 (http: // www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi? acc = GSE51980).

Результаты

Было проведено исследование для сравнения экспрессии генов среди 16 образцов, включая ЭСК H9, родительские фибробласты BJ и недавно полученные клоны ИПСК, которые выращивали в различных условиях и культивировали в течение различных периодов времени. Полный список клонов и их характеристики приведены в таблице 1. Клоны были протестированы, чтобы убедиться, что ≥90% клеток обладают нормальным 46, XY кариотипом. Клоны также характеризовались экспрессией маркеров плюрипотентности.Было обнаружено, что плюрипотентные маркеры AP, SSEA4 и TRA-1-60 являются однородно положительными и устойчивыми во всех клонах ИПСК, использованных в исследовании (рис. 1А).

Рис. 1. Полностью перепрограммированные и частично перепрограммированные клоны различаются путем комбинирования нескольких методов характеристики.

(A) Клоны ИПСК, полученные из фибробластов BJ и охарактеризованные на наличие плюрипотентных маркеров AP, SSEA4 и TRA-1-60. На рисунке показаны объединенные вместе фазово-контрастные и флуоресцентные изображения (шкала: 200 мкм).(B) Анализ главных компонентов данных глобальной экспрессии генов из контролей и ИПСК, созданных в исследовании. Три основных кластера разграничены красным, зеленым и синим прямоугольниками. Темно-синие и голубые прямоугольники обозначают те же клоны, но на P5 и P16 / 17, соответственно. (C) Показатели плюрипотентности, полученные с использованием PluriTest ^TM анализа данных глобальной экспрессии генов для клеток, использованных в исследовании. Область, отмеченная красными линиями, показывает область, в которую, как ожидается, попадут 95% плюрипотентных выборок, а область между синими линиями показывает, куда попадают 95% неплюрипотентных выборок.Темно-синие и голубые прямоугольники снова указывают на те же клоны, но на ранних и поздних пассажах соответственно. (D) Иммуноокрашивание маркеров трехлинейной дифференцировки AFP, βIIITub и SMA (красный) на 21-й день дифференцированных ESC и iPSC, используемых в исследовании (шкала: 200 мкм).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0085419.g001

После предварительной клеточной характеристики все образцы были подвергнуты глобальному транскриптомному анализу. Полученные данные экспрессии были импортированы в Partek® Genomics Suite ™, преобразованы в журнал и нормализованы по количеству.Кластеризация образцов была определена с помощью анализа главных компонентов (PCA) (рисунок 1B). Этот PCA показал три основных кластера, первый из которых представлен фибробластами BJ (рис. 1B, красный прямоугольник). Вторая группа включала все плюрипотентные клоны, а именно ЭСК H9 и образцы ИПСК с разным числом пассажей, культивированные в условиях зависимости от питателя или без него (рис. 1В, зеленая рамка). Эта группа была широко распределена в одном измерении от кластера фибробластов BJ, что предполагает отличную экспрессию фибробластов BJ, но небольшие различия между собой, которые могли быть вызваны условиями культивирования.Интересно, что третья группа состояла из клонов BS3-III и BS3-LLL, которые оба находились в пассаже 5 и экспрессировали плюрипотентные маркеры при предварительной характеристике (рис. 1B, темно-синее поле). Эта группа отличалась как от родительских фибробластов, так и от плюрипотентного кластера. Те же клоны на более высоком пассаже (P> 10) группируются с плюрипотентными линиями (рис. 1B, голубая рамка).

Чтобы независимо подтвердить статус плюрипотентности проанализированных клеток, данные глобального транскриптома также были проанализированы с использованием алгоритма PluriTest ^TM [27] (рисунок 1C, таблица 1).График плюрипотентности для подгруппы образцов показывает, что фибробласты BJ отрицательного контроля имеют низкие показатели плюрипотентности. Напротив, все ESC и большинство протестированных клонов iPSC имеют высокие показатели плюрипотентности и попадают в две красные границы, которые отмечают область, на которую попадает более 95% плюрипотентных клеток. Два клона ИПСК, которые не следуют этому шаблону и показывают низкий показатель плюрипотентности, аналогичный фибробластам BJ, — это BS3-III P5 и BS3-LLL P5 (рисунок 1C, темно-синяя рамка). Эти результаты согласуются с PCA, где одни и те же образцы из ранних пассажей сгруппированы вдали от ESC и установленных iPSC.Также в соответствии с PCA, два клона проходят PluriTest при прохождении не менее 10 пассажей (рис. 1C, голубое поле).

Чтобы дополнительно подтвердить потенциал трехлинейной дифференцировки клонов ИПСК, клетки спонтанно дифференцировали посредством образования эмбриоидных телец (ЭТ). По истечении 3 недель дифференцировки их окрашивали тремя клон-специфическими антителами: AFP для энтодермы, SMA для мезодермы и βIIITub для эктодермы. Большинство клонов образовывали EB и окрашивались положительно по маркерам трехлинейного возраста, таким как положительный контроль H9 ESC, таким образом функционально подтверждая их плюрипотентность.Однако клоны BS3-III и BS3-LLL не смогли образовать EB на пятом пассаже, несмотря на то, что они обладали нормальной ESC-подобной морфологией. Эти клоны успешно образовывали EB и окрашивались положительно на маркеры трехлинейной дифференцировки при культивировании по крайней мере в течение 10 пассажей, что подтверждает их функциональную плюрипотентность (рис. 1D).

Обобщая данные, можно сказать, что большинство клонов ИПСК экспрессировали плюрипотентные маркеры, сгруппированные с ESC, прошли PluriTest и дифференцировались в три зародышевых листка, что указывает на то, что они были полностью перепрограммированы в плюрипотентные клетки.Напротив, два клона на раннем пассаже экспрессировали маркеры плюрипотентности, но сгруппировались вдали от ESC, не прошли PluriTest и не смогли сформировать EB. Поскольку эти клоны проявляли функциональные особенности PSC при дополнительном пассировании, результаты позволяют предположить, что образцы ранних пассажей были частично перепрограммированы.

Приведенные выше наблюдения предполагают, что плюрипотентные маркеры, такие как AP, SSEA4 и TRA-1-60, недостаточны для различения полностью или частично перепрограммированных клонов и подчеркивают необходимость дополнительных поверхностных маркеров.Чтобы идентифицировать дифференциальные маркеры, транскриптом частично перепрограммированных клонов, полностью перепрограммированных клонов и ESC отдельно сравнивали с фибробластами BJ. Чтобы конкретно найти отрицательные поверхностные маркеры PSC, дальнейший анализ данных экспрессии генов был ограничен генами мембранных белков, которые были подавлены по сравнению с фибробластами BJ. Диаграмма Венна для трех наборов генов (рис. 2А) показала, что 135 поверхностных маркеров (таблица S1) были значительно подавлены в полностью перепрограммированных ИПСК и ЭСК H9, но не в частично перепрограммированных клонах.Среди 135 поверхностных маркеров, способных различать полностью или частично перепрограммированные клоны, одним из наиболее дифференциально экспрессируемых был поверхностный гликопротеин CD44 (таблица 2). Интересно, что CD44, член пути Wnt / Beta Catenin, включающий 175 генов, был одним из 53 генов пути WNT, дифференциально экспрессируемых в ESC H9 по сравнению с фибробластами, а также одним из 58 генов пути WNT, дифференциально экспрессируемых в полностью перепрограммированных ИПСК (Таблица S2) [22], [28], [29].

Рисунок 2.CD44 дифференциально экспрессируется во время перепрограммирования фибробластов человека.

(A) Диаграмма Венна генов, кодирующих мембранные белки, которые были подавлены в ЭСК H9, полностью перепрограммированные ИПСК (FR ИПСК) и / или частично перепрограммированные ИПСК (PR ИПСК) по сравнению с фибробластами BJ в соответствии с глобальным анализом экспрессии генов. (B) Гистограмма интенсивности сигнала микрочипа, нанесенная на ось Y для каждого гена для фибробластов BJ (белые столбцы, n = 2), частично перепрограммированных клеток (черные столбцы, n = 2) и клонов ИПСК (серые столбцы, n = 8).(C) Обнаруженные микроматрицы уровни экспрессии ACTB (серые столбцы) и CD44 (черные столбцы), нанесенные на ось Y для фибробластов BJ и типов плюрипотентных клеток, представленных ESC H9, культивируемых с питателями (n = 2) , ESC без питателя (FF) H9 (n = 2), ИПСК с питателем (n = 6) и ИПСК без питателя (FF) (n = 2). Для графиков планки ошибок представляют стандартную ошибку среднего. * обозначает p-значения <0,05, ** обозначает p-значения <0,005, а *** обозначает p-значения <0,0005 по сравнению с фибробластами BJ в анализе ANOVA.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0085419.g002

В анализе микроматрицы CD44 был высоко экспрессирован в родительских фибробластах, поддерживался в частично перепрограммированных клетках и низко — в полностью перепрограммированных ИПСК (рис. 2В). Напротив, обычно используемый маркер фибробластов CD13 [21], [30] был высоким в фибробластах, но был низким в частично перепрограммированных клетках. Маркеры PSC NANOG и LIN28 не были значительно экспрессированы в родительских фибробластах и ​​в частично перепрограммированных клетках, но были высоко экспрессированы в перепрограммированных ИПСК [31], [32], [33], [34].Ген домашнего хозяйства ACTIN B (ACTB) равномерно экспрессировался в разных образцах (рис. 2B). Дальнейшее сравнение фибробластов BJ с ESC и полностью перепрограммированными iPSC показало, что CD44 экспрессируется фибробластами BJ, но не плюрипотентными стволовыми клетками, независимо от того, зависит ли от питателя или нет (рис. 2C).

Поскольку экспрессия белка может отличаться от мРНК [35], мы подтвердили дифференциальный характер экспрессии белка CD44, используя непрямое иммунофлуоресцентное окрашивание живых клеток.Фибробласты MEF и BJ показали устойчивое окрашивание CD44, в то время как ESC H9 и установленные колонии ИПСК, полученные из фибробластов человека, выращенные в условиях отсутствия питателя, не показали видимого окрашивания. В случае зависимых от питателя H9 ESC и iPSC, окружающие MEF были помечены CD44, в то время как плюрипотентные колонии не были (рис. 3A). Этот паттерн также наблюдался с зависимыми от питателя ИПСК, которые были созданы посредством эписомального репрограммирования [36] и репрограммирования мРНК [37] (Рисунок S1).

Рисунок 3.CD44 является положительным маркером фибробластов и отрицательным маркером PSC.

(A) Иммуноокрашивание CD44 (i) MEF, (ii) фибробластов BJ, (iii) ЭСК H9 без питателя, (iv) ИПСК без питателя, (v) ESC H9 на питателях MEF и (vi) ИПСК на питателях MEF. Показанные объединенные изображения состоят из фазового контраста и сигнала CD44 (зеленый) (шкала: 200 мкм). (B) Гистограммы проточной цитометрии интенсивности сигнала CD44-Alexa Fluor® 488 в окрашенных образцах (сплошная черная линия) и неокрашенных образцах (пунктирная серая линия) (i) MEF, (ii) фибробластов BJ, (iii) H9 без питателя. ESC, (iv) ИПСК без фидера, (v) ESC H9 на фидерах MEF и (vi) ИПСК на фидерах MEF.(FF = без кормушки).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0085419.g003

Для количественного измерения экспрессии CD44 в этих клетках окрашенные образцы подвергали анализу проточной цитометрии. В соответствии с результатами иммуноокрашивания, фибробласты MEF и BJ показали единственный пик, который был значительно смещен вправо по сравнению с неокрашенным контролем, следовательно, представляя популяцию клеток, экспрессирующих CD44. Напротив, образцы ESC H9 без фидера и установленные образцы ИПСК человека приводили к гистограммам с пиками, перекрывающими неокрашенные контроли, что соответствует популяции отрицательных клеток по CD44 ^{.Соответственно, ESC и iPSC, выращенные на питателях MEF, показали небольшую популяцию CD44 -положительных клеток , которые, вероятно, соответствовали положительно окрашенным питающим клеткам MEF, но большая часть популяции была представлена ​​CD44 -отрицательной популяцией (Рисунок 3B).}

Поскольку приведенные выше результаты показывают, что CD44 высоко экспрессируется в MEF, родительских фибробластах и ​​частично перепрограммированных ИПСК, но не обнаруживается в полностью перепрограммированных ИПСК и ЭСК, CD44 может функционировать как негативный маркер для идентификации плюрипотентных стволовых клеток.Для дальнейшего изучения характера экспрессии CD44 в процессе репрограммирования фибробласты BJ трансдуцировали с помощью неинтегрирующего набора CytoTune®-iPS Sendai Reprogramming Kit [38] и сравнивали с родительскими фибробластами BJ и контролем ESC H9. Клетки из целых чашек метили с использованием антител против CD44 и SSEA4, затем анализировали с помощью проточной цитометрии. На рисунке 4 показаны точечные диаграммы для клеток, экспрессирующих CD44 и SSEA4.

Рисунок 4. Экспрессия CD44 постепенно теряется во время репрограммирования фибробластов.

Точечные диаграммы проточной цитометрии с сигналом CD44-Alexa Fluor® 488 по оси x и сигналом SSEA4-Alexa Fluor® 647 по оси y. Линии разграничивают квадранты отрицательных и положительных сигналов для двух флуорофоров, а числа в каждом углу указывают процент клеток на квадрант. Данные сравнивают (A) родительские фибробласты BJ, (B) ESC H9, (C) образцы перепрограммирования на 9 день и (D) образцы перепрограммирования на 26 день.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0085419.g004

Фибробласты BJ были преимущественно CD44 ^{положительными} и SSEA4 ^{отрицательными} (фиг. 4A), в то время как ESC H9 были CD44 ^{отрицательными} и SSEA4 ^{положительными} (фигура 4B). На 9 день после трансдукции преобладающая популяция была CD44 ^{положительной} и SSEA4 ^{отрицательной} , как и исходные фибробласты. Однако наблюдалась небольшая популяция SSEA4 ^{с положительным результатом} , из которых небольшой процент составлял CD44 ^{отрицательный} (фигура 4C).Через 26 дней после трансдукции, когда колонии четко сформировались и были готовы к субклонированию, точечный график показал менее отчетливую фибробластоподобную CD44 ^{положительную} SSEA4 ^{отрицательную популяцию} , более заметную двойную положительную популяцию и четкую популяцию CD44 ^{отрицательные} SSEA4 ^{положительные} перепрограммированные клетки (фигура 4D).

Взятые вместе, данные демонстрируют постепенную потерю экспрессии CD44 по мере того, как клетки перепрограммируются на ESC-подобный CD44-негативный и экспрессирующий SSEA4 фенотип.Подробный эксперимент с динамикой времени с использованием набора для перепрограммирования CytoTune®-iPS 2.0 Sendai показывает, что прогрессирующая потеря экспрессии CD44 и появление положительных клеток SSEA4 начинается в течение первых девяти дней перепрограммирования (рис. S2).

Ликвидация CD44 ^{положительных популяций} , обнаруженных на 26 день, и последующий анализ QPCR CD44 ^{отрицательных клеток} , полученных после истощения, показал пониженное присутствие NR2F1 / NR2F2 , SNAI2 , RGS4 90 по сравнению с 144 и IL6ST в необеспеченные клетки (Рисунок S3).Анализ микроматрицы подтвердил, что эти транскрипты имеют высокое содержание в фибробластах BJ и пониженную регуляцию в полностью перепрограммированных ИПСК (таблица S3). Кроме того, в то время как неполные культуры репрограммирования привели к образованию AP ^{-положительных колоний} , а также к нескольким трансформированным клеткам, которые не окрашиваются на AP (фиг. S4A), истощение экспрессирующих CD44 клеток устраняет этот фон, что приводит к присутствию только AP ^{-положительных} колоний ( Рисунок S4B). Поэтому CD44 использовался в качестве отрицательного маркера во время перепрограммирования, где колонии, лишенные экспрессии CD44, легко обнаруживались и отличались от окружающих фибробластов и колоний, экспрессирующих CD44 (фигура S5, видео S1).Эти результаты подчеркивают полезность CD44 в качестве отрицательного маркера плюрипотентных клонов.

Для дальнейшего использования отрицательных и положительных маркеров при идентификации появляющихся ИПСК культуры на 23-й и 26-й день окрашивали антителами против CD44 и SSEA4. В обоих экспериментах было получено несколько колоний с компактными клетками и четко очерченными краями, типичными для колоний плюрипотентных стволовых клеток. Эти колонии экспрессировали SSEA4 и не показали детектируемой экспрессии CD44 (фиг. 5A). Другие колонии экспрессировали SSEA4, но не имели четких границ или содержали участки с экспрессией CD44, что свидетельствует о гетерогенной смеси клеток с различными уровнями репрограммирования (рис. 5В).Третий тип колонии экспрессировал CD44 вместе с SSEA4, что указывает на то, что клетки находятся на промежуточной стадии или перепрограммировании (рис. 5C). Фибробластоподобные клетки, которые были положительными по CD44 и отрицательными по SSEA4, также наблюдались за пределами этих колоний (данные не показаны). Способы эписомного репрограммирования показывают аналогичные клоны с этими паттернами экспрессии CD44 и SSEA4 (фиг. S6).

Рис. 5. Совместное окрашивание CD44 и SSEA4 позволяет различать три типа колоний.

Иммуноокрашивание в двух независимых экспериментах по перепрограммированию через 23 (i) и 26 дней (ii) после трансдукции с использованием антител против SSEA4 (пурпурный) и CD44 (зеленый).Объединенная панель обеспечивает наложение фазово-контрастного изображения с обоими сигналами флуоресценции. Оба эксперимента по перепрограммированию дают (A) CD44 ^{отрицательные} SSEA4 ^{положительные} колонии, (B) гетерогенные колонии и (C) CD44 ^{положительные} SSEA4 ^{положительные} колоний (шкала шкалы: 200 мкм).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0085419.g005

В совокупности результаты показывают, что CD44 можно использовать в качестве окончательного отрицательного маркера, отдельно или в сочетании с положительными маркерами, во время идентификации и выбора Клоны ИПСК.

Дом в Афифе / Гильерме Мачадо Ваз

Дом в Афифе / Гильерме Мачадо Ваз

© Хосе Кампос

+ 22

Поделиться

Почта

Или

https://www.archdaily.com/0/house-in-afife-guilherme-machado-vaz

• Год Год завершения этого архитектурного проекта Год: 2018 г.
• ФотографииФотографии: José Campos
• ПроизводителиБренды продуктов, использованных в этом архитектурном проекте

© José Campos

Текстовое описание предоставлено архитекторами. Дом построен на севере Португалии, в сельском поселении, которое было построено у подножия холма и расширилось до равнины, которая используется как пахотная земля и простирается до моря. Участок отделен от часовни переходом и находится на нижнем уровне. Он длинный (около 60 х 18 м) и имеет пологий спуск. Часовня стоит на фундаменте из гранитных стен с входом на запад и занимает свое место в этой области. Его присутствие повлияло на проект, особенно в том, что касается дизайна объема, его реализации в пространстве и определения конструктивных деталей.Дом стремился не нарушать гармонию этого религиозного пространства. В то же время он не хотел подчиняться его присутствию.

© José Campos

Объем был установлен вдали от улицы, чтобы создать внешнюю зону прибытия и сохранить здание на заднем плане по отношению к часовне и ее связи с общественной улицей. Ширина дома (8,6 м) определялась отклонениями, которые определяла ширина земельного участка. Квадратная имплантация была определена и повторена в бассейне и в пространстве между ними.Стандартный объем, компактный и вертикальный, вызывает суть традиционного типа строительства в районе Минхо.

© José Campos Plantas — Subsolo e Térreo © José Campos

Еще одной целью проекта было соблюдение естественного рельефа местности. Чтобы соответствовать этому, здание было адаптировано к существующим фасадам через половину этажа, что позволило иметь прямую связь с экстерьером на южной и западной стороне дома. Полезное пространство было увеличено за счет установки лестницы в центре, чтобы свести к минимуму зоны циркуляции и продвинуть путь, который завершается на террасе на крыше — пятом возвышении — где несоответствие между уровнями отчетливо видно благодаря объемной организации.При анализе апостериори эта ассоциация пространственных элементов несет в себе некоторые «лузианские» воспоминания.

© José Campos

Внешний вид и интерьер сильно контрастируют. Фасад функционирует как оболочка, которая иногда позволяет через отверстия контактировать между домом и миром. Когда ставни закрыты, фасад — это собственное отрицание, это антифасад. Он отменяет интерьер, предлагая только материю. Это стало бы абстрактной скульптурой, если бы две медные горгульи не осуждали функциональную озабоченность.Преувеличенный орнамент этих горгулий контрастирует с сухостью фасада.

© José Campos

Когда они открываются, порталы открывают интерьер с различными материальностями, который черпает вдохновение из народной архитектуры. Порталы южного фасада (обращенные к часовне) напоминают позолоченную резьбу, а также абстрактно напоминают средневековые религиозные картины, созданные в триптихе. Оконные рамы деревянные, как и плинтус пола у входа, и оба окрашены в цвета, использованные в былые времена.Плинтус имеет свободу передвижения, что позволяет ему перемещаться по местности, принимая одновременно пластичный и функциональный характер. Полы на первом уровне сделаны из терраццо с латунными швами, а остальные уровни имеют деревянные полы с открытыми швами. Межкомнатные двери не прерывают плоскость стены — выбирают одну сторону и откидываются назад. Дом скорее старый, чем современный. Бассейн такой, какой он есть.

От идеи к реальности: ВАЗ / Лада 110/2110

«Ты меня огорчаешь» , — сказал король Артур Черному рыцарю в очень известном фильме о Монти Пайтоне.Я вспоминаю эту сцену каждый раз, когда сравниваю прототипы Lada с готовыми серийными автомобилями: ясно, что дизайн-студии были буквально наводнены яркими идеями и безупречным вкусом, но, несмотря на то, что базовая форма была доведена до производства, что-то потерялось при переводе на листовой металл. Это почти не отличается от того, что обычно случается с концепт-каром, но особенно раздражает Lada 110/2110: подобраться так близко, но упасть так далеко.
Проект, начатый в середине 1980-х годов и производящий управляемые прототипы SVX-приманки в 1990-1991 годах, был запущен в производство в 1995 году и поступил в продажу по всей Европе к 1999 году.Если посмотреть на вдохновение, это оказалось опозданием на десять лет.


На этом снимке показано, как 110-я была протестирована с Audi 80 1986 года, автомобилем, который до сих пор ездит по всей Восточной Европе. Он объясняет размеры и общее внимание к упаковке и аэродинамике.

На этом скетче от 7/87 фургон выглядит действительно потрясающе. Эти окна в стиле SVX на самом деле появились раньше Subaru, представленного на Токийском автосалоне 1989 года, даже если эскизы дизайна, вероятно, широко распространялись годами ранее.

В планах был и элегантный спортивный трехдверный хэтчбек / купе.


Честно говоря, я нахожу удивительным, как они хотели достичь определенного уровня футуризма и как вы можете найти элементы этих концептуальных эскизов в финальной машине, независимо от того, насколько очевидным был конечный результат.


Вот и последняя машина. Поясная линия присутствует, форма фар, стеклянная витрина и общий силуэт соответствуют концепции 1990–1991 годов, но магия исчезла между этими дряблыми промежутками между панелями.


Пресс-фото интерьера.

Снимок продажи автомобиля 1999 года, проданного в Финляндии. К тому времени, как автомобиль прибыл сюда, это был странно ретрофутуристический продукт: настолько устаревший, но все же цепляющийся за соломинку, которая была впереди на десятилетия. Это как из альтернативной временной шкалы.

Модель 110 продавалась в Финляндии до 2007 года, и использованные образцы имели примерно те же цены, что и старые Chrysler Neons. Было бы замечательно, если бы кто-то купил 110 и решил довести его до совершенства, чтобы он выглядел точно так же, как концептуальные версии, с этими раздельными окнами, дымчатым стеклом и деталями концептуального автомобиля конца 1980-х годов.
[Изображения: ВАЗ, Nettiauto]

Как это:

Нравится Загрузка …

CDC говорит, что дети в возрасте до 12 лет должны получить вакцину Pfizer от COVID-19: Обновления от коронавируса: NPR

Флакон и шприц вакцины Pfizer-BioNTech COVID-19. Консультативная группа Центров по контролю и профилактике заболеваний рекомендовала вводить вакцину Pfizer-BioNTech детям в возрасте от 12 до 15 лет. Яап Арриенс / Нур Фото через Getty Images скрыть подпись

переключить заголовок Яап Арриенс / Нур Фото через Getty Images

Флакон и шприц вакцины Pfizer-BioNTech COVID-19.Консультативная группа Центров по контролю и профилактике заболеваний рекомендовала вводить вакцину Pfizer-BioNTech детям в возрасте от 12 до 15 лет.

Яап Арриенс / Нур Фото через Getty Images

Центры по контролю и профилактике заболеваний рекомендуют вводить вакцину Pfizer COVID-19 подросткам в возрасте от 12 до 15 лет.

Директор CDC Рошель Валенски выступила с заявлением, в котором говорилось: «CDC теперь рекомендует использовать вакцину среди этой группы населения, и поставщики медицинских услуг могут начать вакцинацию их сразу.»

Независимый федеральный консультативный комитет в среду проголосовал — 14 за с одним отказом — рекомендовать быстро одобрить вакцину Pfizer-BioNTech для людей в возрасте 12 лет. борьба с COVID-19, так как многие штаты следуют рекомендации.

Ранее вакцины COVID-19 в США.С. был разрешен только для людей в возрасте 16 лет и старше. Pfizer — первый производитель вакцин, получивший разрешение на использование в экстренных случаях для молодых американцев после того, как в мартовском клиническом испытании он продемонстрировал, что его вакцина на 100% эффективна в предотвращении COVID-19 у участников исследования в возрасте от 12 до 15 лет.

«Мы. готов «, — сказал президент Байден в своем обращении в среду днем. «Для этой новой группы населения внедрение вакцины будет быстрым и эффективным. С завтрашнего дня более 15 000 аптек по всей стране будут готовы к вакцинации этой возрастной группы.«

Публично ожидая завершения процесса авторизации CDC и FDA, администрация Байдена начала незаметно закладывать основу для немедленного распространения вакцины среди подростков.

Это включало в себя активную работу по привлечению педиатров и семейных врачей к назначению доз своим пациентам, обеспечение готовности аптек для обслуживания более молодых пациентов и обращение к поставщикам услуг Medicaid, поскольку 40% детей в стране застрахованы через Детское здравоохранение. Программа страхования.

Примечательно, что официальный представитель Белого дома сообщил NPR, что администрация планирует обеспечить доставку небольших упаковок вакцин Pfizer в кабинеты врачей, как только они станут доступны. Это было серьезным препятствием, поскольку вакцина Pfizer в настоящее время поставляется только в упаковках, содержащих около 1200 доз, что больше, чем могут выдержать многие частнопрактикующие врачи. Pfizer заявила, что планирует начать поставки небольших упаковок к концу этого месяца.

По мере того, как лето подходит к концу, молодые люди снова возвращаются в школу, прежде чем они вернутся в классы.Администрация планирует работать над тем, чтобы вакцины от COVID-19 предлагались в рамках ежегодных медосмотров и спортивных осмотров, которые дети и подростки часто обязаны проходить до начала занятий в школе.

Группа считает, что исследования подтверждают использование вакцины среди подростков

Во время почти четырехчасовой встречи консультативный комитет заслушал подробности исследований, показывающих, что вакцина предотвращает COVID-19 у более чем 1000 подростков в этом возрасте, в то время как 16 Случаи произошли у тех, кто получал плацебо.О серьезных побочных эффектах не сообщалось.

Представители общественного здравоохранения, в том числе представители CDC и независимых советников в комитете, заявили, что вакцина еще больше поможет контролировать пандемию коронавируса в США и других странах, которые обычно следуют примеру США. Данные, представленные CDC, показали, что около 20% случаев COVID-19 в США приходится на детей и подростков 17 лет и младше.

Американская академия педиатрии одобрила этот шаг в заявлении, зачитанном во время встречи.

«Это действительно захватывающее событие, которое позволяет нам защитить большое количество детей и помочь им восстановить свою жизнь после действительно тяжелого года», — сказал президент AAP Ли Савио Бирс. «Как педиатр и родитель, я с нетерпением жду возможности вакцинации своих детей и пациентов, и я очень рад, что теперь дети в возрасте от 12 лет и старше могут быть защищены. Данные продолжают показывать, что эта вакцина безопасна и эффективна. Я призвать всех родителей позвонить своему педиатру, чтобы узнать больше о том, как сделать прививки своим детям и подросткам.»

Комментарии общественности во время открытого заседания включали вопросы о том, оправдывает ли относительно низкий риск серьезных осложнений COVID-19 у детей использование вакцины в этой возрастной группе до проведения дополнительных исследований.

Исследование включало более чем 2000 подростков, но были раскритикованы некоторыми общественными комментаторами за недостаточный размер. Комментаторы также выразили обеспокоенность по поводу того, что исследований было недостаточно, чтобы продемонстрировать, есть ли какие-либо долгосрочные эффекты, связанные с этой или другими вакцинами COVID-19.

Представители CDC и Pfizer подчеркнули результаты исследования, которые показывают, что вакцина чрезвычайно безопасна для этой возрастной группы, что аналогично тому, что наблюдали у взрослых в течение нескольких месяцев.

Более 150 миллионов человек в США получили по крайней мере одну дозу одной из вакцин COVID-19 с очень низким уровнем серьезных побочных эффектов.

Разрешение приходит на лето

Разрешение и одобрение приходит вовремя, чтобы многие подростки прошли вакцинацию до участия в летних мероприятиях, таких как кемпинг и групповые виды спорта.Уже предпринимаются усилия по вакцинации как можно большего числа подростков до возобновления школьного обучения в августе и сентябре.

В педиатрических исследованиях CDC и FDA оценили ту же схему приема двух доз, разделенных тремя неделями, которая используется для людей в возрасте от 16 лет и старше.

Хотя дети и подростки обычно имеют более легкие симптомы, если они заражаются COVID-19, по сравнению со взрослыми, они, тем не менее, могут передать коронавирус другим людям. Это заставило родителей обеспокоиться перспективой полного открытия школ осенью.

«Я думаю, что осенью мы должны перейти в полноценную школу, в полноценную очную школу», — сказал директор CDC Валенски на саммите CNBC по вопросам здоровья во вторник.

Несмотря на то, что администрация Байдена настаивает на том, чтобы сделать прививку от COVID-19 достаточному количеству американцев для установления коллективного иммунитета, темпы вакцинации в США в последние недели замедлились, и многие взрослые предпочитают не делать прививки.

Данные CDC показывают, что чуть более трети американцев полностью вакцинированы, при этом 46% получили хотя бы одну дозу.Хотя опросы показали, что только от 46% до 60% родителей заявили, что планируют иммунизацию своих детей-подростков, открытие вакцинации для миллионов подростков, вероятно, приблизит США к цели коллективного иммунитета.

Чтобы помочь в убеждении, чиновник Белого дома говорит, что администрация Байдена уже провела вебинары и слушания с Американской академией педиатрии и многочисленными образовательными ассоциациями.

На этой и следующей неделе будет больше занятий, в том числе с Американской ассоциацией лагерей и поставщиками медицинских услуг для индейцев.

В ближайшие дни и недели будет проводиться телевизионная реклама, кампании в социальных сетях и мероприятия с участием «знаменитостей и влиятельных лиц, у которых есть возможность обратиться к подросткам и их родителям». Белый дом отказался сообщить, кем могут быть эти знаменитости.

Он не знаменитость по любому традиционному определению, но главный хирург США Вивек Мурти собирается провести на следующей неделе круглый стол с родителями, чтобы ответить на вопросы о вакцине.

В марте компании Pfizer и Moderna начали педиатрические испытания своих вакцин на детях в возрасте от 6 месяцев.Результаты ожидаются в начале осени. Ни одна из компаний не обращалась в FDA за разрешением на применение в экстренных случаях у детей младше 12 лет.

Johnson & Johnson возобновила поставки своей однократной вакцины в прошлом месяце после того, как федеральные регулирующие органы США прекратили 10-дневную паузу в введении вакцины, пока есть потенциальная связь. на редкую форму тромба.

Вакцины Moderna и Johnson & Johnson в настоящее время разрешены только для взрослых в возрасте 18 лет и старше.

Между тем, по сообщению Associated Press, штаты уже начали рассылку вакцины Pfizer педиатрам в ожидании рекомендации среды.

.