Лада х рей кросс размеры: габаритные размеры, вес, двигатель, клиренс, расход топлива

Содержание

габаритные размеры, вес, двигатель, клиренс, расход топлива

Рабочий объем, л	1.6		1.8
Рабочий объем, см3	1596		1774
Диаметр цилиндра	82		0
Количество клапанов	16
Количество цилиндров	4
Максимальная мощность, кВт	78	83	90
Максимальная мощность, л. с.	106	113	122
Номинальный крутящий момент, Н•м	148		170
Об/мин КВТ	4200		6000
Об/мин ЛС	5800		6000
Об/мин НМ	4200		3750
Расположение двигателя	переднее, поперечное
Расположение цилиндров	в ряд
Степень сжатия	11		10. 3
Тип топлива	Бензиновый
Требования к топливу	АИ-95
Ход поршня	75.6		0
Тип наддува	Нет
Экологический класс	EURO5

Габаритные размеры Лада х рей Кросс: кузов, колеса, диски

После выхода Лада X-Рей Кросс водители по всей России стали интересоваться новинкой. Отчасти такое любопытство связано с желанием пересесть на кроссовер повышенной проходимости. Кроме клиренса еще важными моментами отмечаются габариты и размеры кузова, а также его отдельных элементов. Рассмотрим LADA XRAY Cross подробнее: кузов, салон, диски и багажник.

Размер кузова

Габаритные размеры Лада X-Рей Кросс можно с уверенностью назвать достойными. Тут при желании сзади смогут разместиться с комфортом не только дети, но и взрослые. Стоит отдать должное «АвтоВАЗу», которому еще удается держаться на «плаву» выпуская конкурентоспособную продукцию.

Основные параметры кузова LADA XRAY Cross:

количество дверей: 5 штук;
длина: 4171 мм;
ширина, включая зеркала: 1983 мм;
высота с антенной: 1645 мм;
база классическая: 2592 мм.

Ширина без зеркал 1810 мм. Хотя учитывать правильнее с ними, ведь часто показатель ширины важен при маневрах между другими автомобилями. Размер салона отыгрывает второстепенную роль, которая критична только семейным водителям. Холостякам нет необходимости делить салон с большим количеством людей.

Высота подросла по сравнению с обычным XRAY на +75 мм. Внушительный показатель с учетом сохранения цены доступной большинству россиян. Вообще везде по сравнению с обычным кроссовером отмечаются увеличения в кузове: ширина +46 мм, а длина +6 мм.

Габариты и размеры Лада X-Рей Кросс конкурируют с большинством аналогичных кроссоверов. Касательно калии спереди у автомобиля 1503 мм, сзади – 1546 мм. Тут же невозможно не оценить выдающийся клиренс – 215 мм. Кроссовер с таким дорожным просветом легко даст фору многим:

Renault Duster: 210 мм;
Lada 4×4: 205 мм;
Nissan X-trail: 210 мм.

Именно клиренс на LADA XRAY Cross ставит точку в решении о покупке автомобиля. Приставка «Cross» оправдывается дорожным просветом в 215 мм.

Интерьер, двигатель и колеса

Размер багажника в стандартном положении кресел 361 л. Немного больше вас порадует максимальный его объем: 1514 л. Грузовые перевозки вполне можно выполнять на данном кроссовере. При этом потребуется сложить все сиденья, включая место пассажира воле водителя. Если ограничится только вторым рядом сидений, тогда придется довольствоваться 1207 л.

Учитывая направленность Лада X-Рей Кросс в сторону увеличения проходимости, багажник выглядит вполне приличным. Большинству жителей города 361 л хватит для поездок в магазин и на работу. Другое дело сельским жителям стремящихся приобрести транспорт для перевозки овощей – LADA XRAY Cross немного другой вид транспорта.

Размер дисков: 215/50 R17 (91, H). С учетом широких арок колеса на R17 смотрятся едино с кроссовером. Большинству водителей нет необходимости даже пробовать вместить большего диаметра колеса, которые могут показаться уже перебором. Это тот случай, когда с завода выпускают ваш автомобиль без изъянов в экстерьере, где каждый элемент уже продуман.

От передних колес к краю кузова 835 мм. Задние покажут 744 мм. С таким расположением колес кроссовер хорошо себя чувствует на трассе. Рискованных кренов на поворотах водитель не почувствует.

Размер колес для клиренса 215 мм подобран идеально. Такое сочетание допускает нагружать автомобиль до отметки в 1650 кг. При этом сохранится относительно неплохой дорожный просвет для преодоления основных ям на вполне новом асфальте. Бак объемом на 50 л.

Понравилась статья?

объем багажника. Размеры и сколько литров.

Перед покупкой автомобиля одним из самых насущных вопросов, от ответа на который зависит выбор большинства автомобилистов, является вместимость багажника. И это предсказуемо, поскольку задачей автотранспорта является перемещение не только пассажиров, но и грузов. В наших же условиях личный автотранспорт является рабочей лошадкой и помощником по хозяйству в большей мере, чем средством проведения досуга. Поэтому большой багажник является крайне желательной, а еще чаще – необходимой характеристикой машины.
Частота запросов вроде «Багажник для Лада Хray», «Х рей багажник фото» или «Лада Х Рей фото салона и багажника» постоянно растет, и связано это с тем, что новые автомобили семейства Лада пока еще мало известны нашим автолюбителям. Решиться на покупку этих тольятинских новинок трудно, даже если позволяют средства, но нет представления о фактических размерах багажника Х Рей, и, как следствие – о хозяйственной ценности автомобиля, пусть даже трижды красивого, качественного и современного.

Сегодня мы прольем свет на то, что так заботит покупателей, а именно на размер багажника Лада Х Рей.

Багажник на Х Рей: характеристики и описание

Поскольку новый автомобиль очень отличается от привычных моделей Жигулей семейства Лада, то и багажник у него абсолютно новый. Габариты Лада Х Рей следующие:

1,77 м. по ширине;
1,57 м. по высоте;
4,16 м. в длину.

При этом линейные размеры багажника х рей таковы:

Ширина – 0,9 м. Это минимальный размер, поскольку в самом широком месте (у пола багажника) ширина будет составлять примерно 0,99 м.;
Высота – 0,8 м. Со снятой крышкой фальшпола к высоте добавляется еще 10 см. При закрытой багажной полке показатель высоты ограничивается размером 0,4 м. ;
Длина – 0,79 м. При откинутой вперед спинке заднего дивана длина увеличивается до 1,5 м., хотя это уже геометрическая характеристика не багажника, а автомобиля в целом. К сожалению, спинка не откидывается до образования ровной поверхности, так полезной при габаритной загрузке. Для того, чтобы использовать эту возможность полностью, придется снимать заднее сиденье, иначе спинка не откинется на 180о.

Ниже вы можете увидеть, как выглядит Лада Хray багажник на фото.

Если же измерять объем багажника лада х рей в литрах, что актуально в случае транспортировки мелкого или мягкого груза, то показатель вместимости останавливается на 361 литре. Сложив спинку заднего дивана, удается увеличить грузовую вместимость автомобиля до 1207 л., а при сложенном переднем кресле – объем багажника х рей увеличивается до 1514 л.
Как и в случае с любым другим автомобилем, у Xray размеры багажника не являются абсолютной величиной, и всегда хочется больше, если возникает нужда.

Однако есть и абсолютные характеристики, и не сказать что привычные для продукции отечественного автопрома. Например:
• Разрезная спинка заднего дивана позволяет варьировать грузовместимость в случае перевозки длинномерных грузов: лыж, удилищ, профиля, досок и т.д. Просто откинув фрагмент спинки заднего сиденья, остальную ее часть можно не трогать, и использовать по назначению – для перевозки пассажиров;
• Идеально ровный пол багажника. Фальшпол (верхняя поверхность пола) снабжена петлями, за которые можно застропить груз во избежание его перемещения при движении;
• Двойной пол. Приподняв верхнюю крышку пола, мы видим внизу еще одно полезное пространство, которое можно загрузить, к примеру, постоянным грузом (аптечкой, ящиком с инструментами, автомобильными аксессуарами), или деликатным грузом, требующим отдельного грузового места;
• Скрытые колесные крылья, не отбирающие полезной площади и не образующие неудобных углов;
Убедиться во всем этом вы можете, просто набрав запрос «Лада Х Рей багажник фото».

Lada Xray багажник: много или мало?

Итак, мы не знаем, можно ли для Lada xray объем багажника в 361 литр считать достаточным, большим или маленьким. Это число не является предельным показателем для автомобилей, поэтому придется провести сравнение с другой техникой того же класса. Например, Х Рей объем багажника всего на 9 литров меньше, чем у Hyundai Solaris и на 28 литров меньше, чем KIА Rio. При этом он обладает значительно большей вместимостью, чем багажники Renault Sandero и Ford Fiesta. В этом отношении для Лада Х рей багажник такой емкости выглядит вполне приемлемым и даже хорошим решением, и уже по этому функционалу автомобиль может составить конкуренцию иностранным аналогам. Возможно, приведенное сравнение не совсем корректно, но такие высокие хэтчбеки в данном ценовом диапазоне, доступные отечественному потребителю – редкое явление, и остается сравнивать с самыми знакомыми нашему обывателю иномарками.

Вообще, современные легковые автомобили оснащаются багажниками, объемом от 300 до 500 литров, если не принимать во внимание чисто спортивные модели или полугрузовые машины с универсальным кузовом, которые редко продаются и ограничено выпускаются.

Поэтому можно заключить, что для автомобиля Лада Xray объем багажника в 361 л. можно считать средним для всех легковых авто, независимо от класса. Существенное увеличение размера Х рей багажника может привести либо к увеличению габаритов автомобиля, либо к уменьшению полезного пространства салона, что в первую очередь ощутят на себе пассажиры.

Если все же мало?

Несмотря на все сказанное, такой багажник кому-то может показаться недостаточно вместительным, тем более, что существуют ситуации, когда нужно по-максимуму использовать грузоподъемность, в то время как задача по перевозке пассажиров не актуальна. Для таких случаев стоит демонтировать заднее сиденье, благо сделать это достаточно просто.

Также проблему можно решить, купить красивый и аэродинамичный автобокс, который станет прекрасным эстетическим дополнением внешнего вида автомобиля. Если такой вариант не подходит – можно обзавестись легкими рейлингами или универсальным багажником на крышу.
В остальных случаях придется понимать, что автомобиль имеет ограничение по грузоподъемности, и слишком большой груз иногда лучше тянуть, чем везти на себе.

Для этих целей приобретается или берется напрокат автоприцеп.

Кроме того, существуют предметы, которые не поместятся в багажник со свободным салоном даже самого большого легкового автомобиля, хотя перевозить их все-таки можно: например, доска для серфинга или лодка.
Вообще, выбирать среди всех моделей Лада Х Рей по объему багажника в литрах самую подходящую комплектацию бесполезно, т.к. все они имеют одну и ту же вместимость. И если автомобиль вам понравился всем остальным, то лучше попробовать увеличить его грузовые характеристики одним из указанных способов.

Шины и диски для Lada XRAY Cross, размер колёс на Лада ХРАУ Сросс

Подбор шин и дисков по автомобилю Лада ХРАУ Сросс

Другие модели Lada

Lada 110, Lada 111, Lada 1111 Oka, Lada 112, Lada 1200, Lada 1200DL, Lada 1300, Lada 1300SL, Lada 1500, Lada 2104, Lada 2105, Lada 2107, Lada 2108, Lada 2109, Lada 21099, Lada 4X4, Lada 4×4 Bronto, Lada 4×4 Urban, Lada 4×4 Urban, Lada Classics, Lada Fora, Lada Granta, Lada Granta Cross, Lada Granta Sport, Lada Kalina Cross, Lada Kalina Sport, Lada Largus Cross, Lada Nadezhda, Lada Niva, Lada Niva II, Lada Niva II, Lada Nova, Lada Priora, Lada Riva, Lada Samara, Lada Taiga, Lada Vesta, Lada Vesta Cross, Lada Vesta Sport, Lada Vesta SW, Lada Vesta SW Cross, Lada XRay, Lada XRAY Cross, Lada Калина, Lada Калина Кросс, Lada Ларгус, Lada Ларгус Кросс,

Параметры дисков на Лада ХРАУ Сросс

PCD 4×100 диаметром от 17 до 17, шириной от 7 до 7 и профилем от ET43 до ET43как у Smart Forfour

Параметры шин

Размерность шин от R17 до R17, шириной от 215 до 215 и профилем от 50 до 50.
Минимальный размер резины: 215/50 R17, максимальный: 215/50 R17

Подбор шин и дисков для автомобиля Lada XRAY Cross

Автоматический подбор шин и дисков для автомобиля Lada XRAY Cross позволяет избежать различные неприятности, вызванные несовместимостью или несоответствием этих запасных частей рекомендациям производителя. Дело в том, что покрышки и колесные диски оказывают значительное влияние на большинство основных эксплуатационных характеристик транспортного средства . Кроме того, шины и колесные диски в современном автомобиле являются одним из элементов активной безопасности. Именно поэтому выбор между ними следует делать максимально ответственно, что предполагает наличие целого ряда знаний об этих изделиях.

К сожалению, такими техническими нюансами владеет лишь небольшая часть автовладельцев. Независимо от этого автоматическая система подбора окажется крайне полезной, т. е. позволяет свести к минимуму вероятность принятия неправильного решения при выборе тех или иных шин и колесных дисков. А он весьма широк, что обусловлено разнообразием представленного в интернет-магазине «Мосавтошина» ассортимента таких изделий.

комплектации и цены от официального дилера

Колёсная база

2592

Размер колёс

215/50/R17

Ширина задней колеи

1546

Ширина передней колеи

1503

Объем багажника мин/макс, л

361/1207

Объём топливного бака, л

Полная масса, кг

1650

Снаряженная масса, кг

1295

Количество передач

Коробка передач

механика

вариатор

Тип привода

передний

Подвеска и тормоза

Задние тормоза

дисковые

Передние тормоза

дисковые вентилируемые

Тип задней подвески

полунезависимая, пружинная

полунезависимая, торсионная

Тип передней подвески

независимая, пружинная

Эксплуатационные показатели

Максимальная скорость, км/ч

180

162

Марка топлива

АИ-92

Разгон до 100 км/ч, с

10. 9

12.8

Расход топлива, л город

Расход топлива, л город/смешанный

Расход топлива, л город/трасса/смешанный

9. 7/6.3/7.5

Расход топлива, л смешанный

7.3

Диаметр цилиндра и ход поршня, мм

82 × 84

78 × 83. 5

Количество цилиндров

Максимальная мощность, л.с./кВт при об/мин

122 / 90 при 6050

113 / 83 при 5500

Максимальный крутящий момент, Н*м при об/мин

170 при 3700

152 при 4000

Объем двигателя, см³

1774

1598

Расположение двигателя

переднее, поперечное

Расположение цилиндров

рядное

Степень сжатия

10. 5

10.7

Тип двигателя

Тип наддува

нет

Название рейтинга

Оценка безопасности

Аккумуляторная батарея

Запас хода на электричестве, км

Кроссы и крест — Авторевю

О том, что XRAY Cross стал лучше обычного Иксрея, мы уже рассказали — но насколько? Может ли он теперь превзойти Весту SW Cross? А третьим в этой компании будет не Кретокаптюродастер, а старушка Niva. Та, которая Chevrolet. Вы еще не забыли, что двадцать лет назад свою жизнь она начинала как ВАЗ-2123? Это последняя серийная полноприводная машина, разработанная в Тольятти. Что АвтоВАЗ мог тогда — и к чему пришел теперь?

К Ладе XRAY статистика благосклоннее экспертов Авторевю: если в наших тестах XRAY редко заслуживал добрых слов, то в рейтинге продаж у него звание самого популярного хэтчбека на российском рынке. Кто вы, покупатели Иксрея? Неужели все, что вам нужно от автомобиля, — это 18 сантиметров клиренса и компактные размеры? Вы что, совсем не ездите, а только бесконечно паркуете его на тротуарах в тесных дворах? Тогда нам нужно распускать экспертную группу, ведь, кроме ниссановского мотора 1.6 и неплохой плавности хода, ничего пристойного в этом автомобиле мы не обнаружили. А уж когда такой двигатель убрали из линейки…

Пояс из неокрашенного пластика и крупные колеса, расставленные пошире, исправили врожденную непропорциональность Иксрея — Cross выглядит гармоничнее

Внутри АвтоВАЗа, кстати, наш скепсис разделяли: XRAY, созданный на платформе B0, явно требовал не рестайлинга, а реинжиниринга. Поэтому версия Cross — это не столько дизайнерский продукт, сколько образец тольяттинской инженерной самодеятельности. В Renault сказали: «Нам не надо», — а АвтоВАЗ ответил: «У нас уже есть!»

Самое заметное отличие интерьера — опционная отделка с оранжевыми вставками, которой у нашей машины не было. Лучшее, что здесь есть, — удобная и понятная мультимедийная система от Renault

Рядом с обычными Калинами да Грантами XRAY Cross кажется лифтованным внедорожником: фары на уровне лобового стекла, огромные колеса, широкая колея… Но интерьер, как и раньше, не поддерживает мажорное настроение — в эту черную пещеру можно за дополнительную плату накидать оранжевой отделки, однако уютнее она все равно не станет. Зато появилась регулировка руля по вылету, а сиденья теперь гибридные: прежний каркас подушки с новой набивкой плюс спинки от заграничного кроссовера Renault Kadjar. Жаль, что поясничный подпор фиксированный, но сидеть стало удобнее. А еще спинку пассажирского кресла можно откинуть вперед, чтобы расширить не самые впечатляющие возможности Иксрея по перевозке длинномеров.

Однако главное — если управлять обычным Иксреем не хочется, то с Кроссом уже можно ужиться!

Теперь я уверен, что вазовский мотор 1.8 (а другого у версии Cross пока и нет) излечился от детских болезней. Ну почти. Провалы и рывки остались в прошлом — уже второй тест кряду мы хвалим хорошую тягу практически с холостых оборотов и приятную середину. Но что за хрей с настройкой педали газа? Нажал — пауза — поехал. Отпустил — и все еще едешь. Эти чудовищные экозадержки в городе раздражают невероятно!

Полная версия доступна только подписчикамПодпишитесь прямо сейчас

я уже подписан

Размеры шин и дисков для ВАЗ X-Ray

Марка автомобиля: Бренд Acura Alfa Romeo Aston Martin Audi Bentley BMW Brilliance Buick Byd Cadillac Changan Chery Cheryexeed Chevrolet Chrysler Citroen Daewoo Daihatsu Datsun Dodge Dongfeng Ds Dw FAW Ferrari Fiat Ford Foton Gac Geely Genesis GMC Great Wall Hafei Haima Haval Hawtai Honda Hummer Hyundai Infiniti Iran khodro Isuzu Iveco Jac Jaguar Jeep Kia Lamborghini Lancia Land Rover Lexus Lifan Lincoln Lotus Maserati Maybach Mazda Mercedes Mercury MG Mini Mitsubishi Nissan Opel Peugeot Pontiac Porsche Ravon Renault Rolls Royce Rolls-royce Rover Saab Saturn Scion Seat Skoda Smart SsangYong Subaru Suzuki Tesla Toyota Volkswagen Volvo Vortex (tagaz) ZAZ Zotye АЗЛК ВАЗ ГАЗ ОКА ТаГАЗ УАЗ

Модель: Модель 110 2104 2105 2106 2107 2108 2109 21099 2113 2114 2115 4X4 4×4 Bronto 4×4 Urban Classics Granta Kalina Kalina NFR Niva Niva Legend Niva Travel Priora Samara Vesta Vesta Sport X-Ray Ларгус

Модификация: Модификация1. 6 16V1.8 16V

Год: Год201620172018201920202021

Кузов: КузовHatcbackCross

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Что сохраняется в файле cookie?

Динамическая структурная биология на основе FRET: проблемы, перспективы и призыв к практикам открытой науки

Понимание того, как биомолекулы соединяют структурную динамику с функцией, лежит в основе нескольких дисциплин и остается выдающейся целью биологии. Связывание конформационных состояний и их переходов с биохимической функцией требует способности точно определять структуру и динамику биологической системы, которая часто изменяется при связывании лиганда или под влиянием химических и физических свойств окружающей среды.Наиболее хорошо зарекомендовавшие себя инструменты структурной биологии предоставили с высоким разрешением «снимки» состояний в кристаллизованной или замороженной форме (например, рентгеновская кристаллография и криоэлектронная микроскопия одиночных частиц, криоЭМ) или усредненное по ансамблю всех конформаций. (например, ядерный магнитный резонанс, ЯМР; малоугловое рассеяние рентгеновских лучей, МУРР; малоугловое рассеяние нейтронов, МУРН; двойной электронно-электронный резонанс, DEER; сшивающая масс-спектрометрия, XL-MS; ансамбль-FRET). В последние годы дальнейшие разработки позволили этим традиционным структурным инструментам обнаруживать конформационную динамику и промежуточные продукты реакции.Например, методы ЯМР (Anthis and Clore, 2015; Clore and Iwahara, 2009; Palmer, 2004; Ravera et al., 2014; Sekhar and Kay, 2019) и методы электронного парамагнитного резонанса (Jeschke, 2018; Jeschke, 2012; Krstić et al., 2011) были продвинуты для изучения конформационной динамики и захвата временных промежуточных соединений. Кристаллографические исследования с временным разрешением использовались для определения функционально значимых структурных смещений, связанных с биологической функцией (Kupitz et al., 2014; Moffat, 2001; Schlichting et al., 1990; Шлихтинг и Чу, 2000; Schotte et al., 2003). Достижения в микрожидкостных устройствах для смешивания и распыления позволили использовать криоЭМ с временным разрешением (Feng et al., 2017; Kaledhonkar et al., 2018) и масс-спектрометрию с поперечными связями (XL-MS или CL-MS) (Braitbard et al., 2019 ; Brodie et al., 2019; Chen et al., 2020; Iacobucci et al., 2019; Murakami et al., 2013; Славин, Калисман, 2018). Прогресс в вычислительных методах также предоставил новые инструменты для изучения биомолекулярной структуры и динамики. Каждое из этих достижений подчеркивает возросшее понимание того, что необходимо напрямую и непрерывно отслеживать динамические свойства отдельных биомолекул, чтобы понять их функцию и регуляцию.

В этом контексте FRET (называемый резонансным переносом энергии флуоресценции или резонансным переносом энергии Фёрстера [Braslavsky et al., 2008]) исследования на ансамблевом и одномолекулярном уровнях стали важными инструментами для измерения структурной динамики по крайней мере на протяжении 12 порядков величины во времени и картирование конформационных и функциональных неоднородностей биомолекул в условиях окружающей среды. FRET изучает затухание флуоресценции на уровне ансамбля (Grinvald et al., 1972; Haas et al., 1975; Хаас и Стейнберг, 1984; Hochstrasser et al., 1992) (FRET с временным разрешением) позволили уже в начале 1970-х годов изучать структурные неоднородности во временных масштабах, превышающих время жизни флуоресценции (несколько нс). Этот подход используется до сих пор (Becker, 2019; Orevi et al., 2014; Peulen et al., 2017) и перенесен в исследования одиночных молекул. Возможность измерения FRET в отдельных молекулах (Deniz et al., 1999; Ha et al., 1996; Lerner et al., 2018a) сделала этот метод еще более привлекательным.Одномолекулярный FRET (smFRET) широко используется для изучения конформационной динамики и биомолекулярных взаимодействий в стационарных условиях (Dupuis et al., 2014; Larsen et al., 2019; Lerner et al., 2018a; Lipman et al. ., 2003; Margittai et al., 2003; Mazal and Haran, 2019; Michalet et al., 2006; Orevi et al., 2014; Ray et al., 2019; Sasmal et al., 2016; Schuler et al., 2005; Schuler et al., 2002; Steiner et al., 2008; Zhuang et al., 2000). Примечательно, что во многих механистических исследованиях достаточно использовать FRET для различения различных конформаций и определения кинетических скоростей, так что абсолютные эффективности FRET и, следовательно, расстояния не нужно определять.Однако возможность точного измерения расстояний и кинетики с помощью smFRET привела к его появлению в качестве важного инструмента в эту новую эру «динамической структурной биологии » для картирования биомолекулярных неоднородностей и измерения структурной динамики в широком диапазоне временных масштабов (Lerner et al., 2018a; Mazal, Haran, 2019; Sanabria et al., 2020; Schuler, Hofmann, 2013; Weiss, 1999).

Одномолекулярный FRET (smFRET) имеет много преимуществ в качестве метода структурной биологии, в том числе:

чувствительность к макромолекулярным расстояниям (2.5–10 нм),
способность разрешать структурные и динамические неоднородности,
высококачественные измерения с низким потреблением образца интересующих молекул (низкие концентрации и низкие объемы), поскольку образец анализируется по одной молекуле за раз,
определение структурных переходов в равновесии, следовательно, без необходимости синхронизации,
возможность обнаружения (очень) редких событий.Действительно, в биологии наиболее интересными для изучения молекулы часто являются редкие, функционально активные молекулы среди моря неактивных молекул,
высокая чувствительность и специфичность для меченых молекул. Поскольку только меченая молекула вносит уникальный вклад в детектируемый сигнал, эти индикаторы также могут применяться в качестве FRET-репортеров в тесноте (Dupuis et al., 2014; Soranno et al., 2014; Zosel et al., 2020b) (отсюда smFRET может использоваться для проверки результатов, определенных изолированно, или обнаружения модуляции конформационных предпочтений и / или структурной динамики посредством так называемых пяти взаимодействий [Guin and Gruebele, 2019]), и
высокая специфичность для остатков / доменов за счет специфической маркировки.Биомолекулы могут быть специально помечены уникальной парой красителей, что позволяет проводить измерения smFRET для всех размеров молекул, включая большие сложные сборки (см. Рисунок 1 [Kilic et al., 2018]), активные биологические машины (например, рибосомы) ( Dunkle et al., 2011) и даже на целых нативных вирионах (Lu et al., 2019; Munro et al., 2014).

Рабочий процесс моделирования динамических структур по измерениям FRET.

( A ) Интеграционное моделирование требует структурной и динамической информации. Предварительная информация из традиционных подходов (рентген, ЯМР, криоЭМ) вместе с вычислительными инструментами определяет пространство возможных решений для структурного моделирования с помощью FRET. Комбинация структурной (расстояния между красителями) и динамической информации (кинетическая связь и обменные курсы) позволяет идентифицировать непротиворечивую модель. ( B ) Изучение структуры и динамики хроматиновых волокон.Комбинированное TIRF и конфокальное FRET исследование структуры и динамики хроматиновых волокон с использованием трех позиций маркировки FRET (DA1-3) для двух пар красителей с различными расстояниями Ферстера. Расстояния Фёрстера (определены в разделе Расстояния между красителями, уравнение 6). Предварительная структурная информация, полученная с помощью криоэлектронной микроскопии (вверху слева) (Song et al., 2014) и рентгеновской кристаллографии (вверху, справа PDB ID: 1ZBB Schalch et al., 2005), объединена со структурной и динамической информацией. полученные в результате экспериментов FRET на иммобилизованных молекулах, измеренных с помощью микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF), и на свободно диффундирующих молекулах с помощью конфокальной микроскопии (Kilic et al., 2018). На основе объединенной информации получена согласованная модель конформаций хроматиновых волокон со смещенными регистрами, которые связаны медленными (> 100 мс) и быстрыми процессами декомпакции (150 мкс), которые протекают не напрямую, а скорее через открытое волокно. конформация. Рисунок 1B был воспроизведен с рисунков 1, 3 и 6 в Kilic et al., 2018, Nature Communications с разрешения, опубликованном под Международной общественной лицензией Creative Commons Attribution 4.0 (CC BY 4.0; https: // creativecommons.org / licenses / by / 4.0 /).

© 2018, Kilic et al. Панель B была воспроизведена с рисунков 1, 3 и 6 в Kilic et al., 2018 с разрешения, опубликованного в соответствии с Международной общественной лицензией Creative Commons Attribution 4.0.

Несколько методов были использованы для определения структурных ансамблей, таких как ЯМР, одночастичная криоЭМ или XL-MS, а недавно также smFRET в интегративном / гибридном (I / H) подходе с компьютерным моделированием для преодоления разреженности экспериментальных данных. относительно атомистического описания (Берман и др., 2019; де Соуза и Пикотти, 2020; Димура и др., 2020; Gauto et al., 2019; Кукос и Бонвин, 2020; На и Пэк, 2020; Тан и Гонг, 2020; Webb et al., 2018). Структурные модели I / H, полученные из экспериментов smFRET с использованием расстояний между красителями в качестве ограничений, были описаны для гибких свернутых белков (Brunger et al., 2011; Hellenkamp et al., 2017; Margittai et al., 2003; McCann et al., 2012). ), конформационные ансамбли неупорядоченных / неструктурированных и развернутых белков (Borgia et al., 2018; Holmstrom et al., 2018; Schuler et al., 2020), нуклеиновые кислоты и комплексы белок-нуклеиновая кислота (Craggs et al., 2019; Craggs, Kapanidis, 2012; Kalinin et al., 2012; Lerner et al., 2018b; Muschielok et al., 2008). ; Возняк и др., 2008).

Еще одним уникальным аспектом исследований smFRET является то, что структурная, кинетическая и спектроскопическая информация о больших и сложных системах может быть записана одновременно в одном измерении. Это облегчает объединение динамической и структурной информации в интегративный подход к (рис. 1A) (Hellenkamp et al., 2017; Килич и др., 2018; Ли и др., 2020b; Санабрия и др., 2020; Вассерман и др., 2016; Янез Ороско и др., 2018):

определяют количество возможных структур, согласующихся с данными,
потенциально снижает неоднозначность между различными структурными моделями, совместимыми с экспериментальными данными, а
раскрывают структурно разрешенные динамические пути обмена.

В качестве примера на рисунке 1B показан результат мультимодального исследования smFRET конформационного ландшафта 12-мерного массива хроматина (~ 2.5 MDa) (Kilic et al., 2018) с динамикой, происходящей во временных масштабах от наносекунд до часов. SmFRET эксперименты могут обнаруживать гибкие конформации хроматина (рис. 1B, средняя панель), показывая их динамическую структурную неоднородность (рис. 1B, нижняя панель), в отличие от хорошо упорядоченных статических структур хроматиновых волокон (рис. 1B, верхняя панель). Эти гибкие, частично открытые и открытые конформации, которые довольно распространены в растворе (популяция> 70%; рис. 1В, нижняя панель), не были разрешены ранее, хотя они необходимы для правильной организации и функции генов.Они представляют собой центральный узел взаимопревращений для отдельных регистров стэкинга хроматина и их трудно обнаружить с помощью других структурных методов. Такой подход к визуализации биомолекул в действии в условиях окружающей среды подчеркивает важность их динамической природы, разрешая переходы между различными конформационными состояниями, что во многих случаях способствует их функции (Aviram et al., 2018; Henzler-Wildman et al., 2007; Iljina et al., 2020; Lerner et al., 2018b; Sanabria et al., 2020; Tassis et al., 2020).

Измерения

SmFRET обычно выполняются с использованием двух подходов: с использованием иммобилизованных на поверхности молекул с использованием флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRFM) и обнаружения на основе камеры или со свободно диффундирующими молекулами в растворе с использованием конфокальной микроскопии и точечных детекторов. Экспериментальные системы доступны в продаже, но, как правило, их изготавливают самостоятельно. Образцы готовятся, а данные собираются с использованием специальных лабораторных протоколов, где данные хранятся в различных форматах файлов и анализируются с использованием набора все более мощного программного обеспечения.Для полевых исследований в целом и для структурных исследований в частности важно продемонстрировать, что smFRET как метод воспроизводим и надежен независимо от того, где и как измеряется образец. С этой целью под руководством Торстена Хугеля двадцать лабораторий объединились для измерения smFRET на нескольких конструкциях дцДНК (Hellenkamp et al., 2018a). Изучая шесть различных образцов с разными красителями и различными расстояниями между красителями, средняя эффективность FRET, полученная участвующими лабораториями, показала удивительно высокую степень согласия (ΔE между 0.02 и 0,05 в зависимости от деталей образца). Количественная оценка и воспроизводимость измерений smFRET на основе интенсивности и обсуждение анализа данных стали важной вехой. Эти стандарты дцДНК FRET теперь доступны для ежедневной калибровки и особенно полезны для новых групп, присоединяющихся к сообществу.

Вдохновленный идеями, полученными в ходе вышеупомянутой попытки FRET (Hellenkamp et al., 2018a), были начаты новые многолабораторные слепые исследования.Следующее сравнительное исследование FRET, проведенное Thorben Cordes, исследует надежность и надежность экспериментов smFRET на белках, претерпевающих индуцированные лигандом конформационные изменения (Gebhardt et al., В стадии подготовки). В этом исследовании используются два различных модельных белка для оценки воспроизводимости и точности smFRET на основе белков для измерения расстояния между красителями. Белковые системы ставят новые задачи, включая статистическую маркировку красителей, специфические для сайта свойства красителей, стабильность белков, транспортировку, хранение и конформационную динамику.Следовательно, в исследовании также оценивается способность smFRET обнаруживать и количественно оценивать динамику в различных временных масштабах от микросекунд до секунд. Еще одна задача FRET, инициированная Соней Шмид, — это программа kinSoftChallenge (http://www.kinsoftchallenge.com, Götz et al., В стадии подготовки), которая оценивает существующие инструменты для извлечения кинетической информации из временных траекторий одиночных молекул. Эта задача направлена на: (1) продемонстрировать способность кинетического анализа на основе smFRET точно выводить динамическую информацию и (2) предоставить сообществу средства оценки различных доступных программных инструментов.

Одним из важных результатов различных исследований FRET в нескольких лабораториях было то, что, хотя согласие было хорошим, его можно было улучшить еще больше. В частности, анализ данных и, в частности, исправления могут повлиять на определенную эффективность FRET и результирующие расстояния. Следовательно, открытое обсуждение того, какие подходы работают наиболее надежно, при каких условиях необходимо. Доступ к первичным данным и возможность их обработки с помощью различных подходов к анализу были и останутся наиболее прозрачным способом продвижения вперед в этой области.В настоящее время это сложно, учитывая множество вариантов используемых методов, их документации, форматов файлов и экспериментальных процедур, применяемых в разных лабораториях, для установления оптимальных условий, рабочего процесса и передовых практик даже для существующих, хорошо протестированных методов, поскольку сравнение этих методов затруднительно. требует много времени, а необходимая информация во многих случаях недоступна. С расширением открытых научных практик и представлением опубликованных данных в репозитории необходим консенсус относительно того, какие данные и метаданные следует хранить и в каких возможных форматах, чтобы их могло легко использовать сообщество.

В связи с этими соображениями и множеством возможностей для роста сообщества smFRET, несколько лабораторий, обладающих опытом в FRET, без претензии на исчерпывающий или исключительный характер, собрались, чтобы поддержать эти усилия и предложить шаги по организации сообщества вокруг последовательной и открытой науки. практики. Это действие переводится в общие методологические рекомендации или предложения, которые мы вводим после типичного рабочего процесса эксперимента smFRET, включая подготовку и определение характеристик образцов, описание установки, сбор и сохранение данных, а также анализ данных.Эти рекомендации о том, как «практиковать» smFRET, являются не попыткой систематизировать сообщество, а скорее первоначальным предложением, которое направлено на поощрение открытого диалога о существующих практиках в нашей области и приводит к более высокой воспроизводимости результатов экспериментов smFRET. Затем мы обсуждаем практику открытой науки, а также первые шаги, которые были предприняты для формирования международного сообщества FRET. В завершение мы выделим несколько областей, в которых smFRET окажет большое влияние в различных областях науки в ближайшем будущем.

Динамическая настройка FRET в биосенсоре зеленого флуоресцентного белка

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Кристаллическая структура Twitch-2B

Мы расшифровали структуру с разрешением 2,5 Å (таблица S1A). Асимметричный блок состоит из двух мономеров (рис. S1A). Они представляют идентичные конформации отдельных доменов [среднеквадратичные отклонения (RMSDs) ниже 0,2 Å] и несколько иную междоменную конформацию (RMSD 0,992 Å), но, по-видимому, не собираются как симметричный гомодимер.Их интерфейс (рис. S1B), покрывающий 630 Å ² ( 11 ), на самом деле значительно меньше, чем интерфейс стабильного димера ( 12 ). Кроме того, данные малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР) показывают, что в растворе Twitch-2B является мономерным (рис. S2). Поэтому мы сфокусируем наше описание здесь на мономере A. Кристаллическая структура показывает расположение донора и акцептора относительно минимального кальций-связывающего домена TnC, а также структуру оптимизированных линкеров (рис.1). Структура кальций-связывающего домена очень похожа на C-концевой глобулярный домен куриного TnC (RMSD 0,84 Å) ( 13 ), на структуру ЯМР, решенную ранее ( 8 ), и на структуру кальмодулина. (RMSD 1,08 Å) ( 14 ). Главные оси двух бочкообразных β-доменов флуоресцентного белка ориентированы почти под перпендикулярным углом друг к другу. Бочки β практически не контактируют друг с другом (рис. 2A) с очень маленькой общей границей раздела (150 Å ²).Интерфейсы минимального кальций-связывающего домена с mCerulean3 и cpVenus ^cd также относительно малы, охватывая только 257 и 351 Å ² соответственно (см. Ниже). Взаимодействия в основном носят гидрофильный характер (рис. 2А).

Рис. 2 Структурные детали Twitch-2B.

( A ) Полярные взаимодействия между остатками минимального домена TnC, mCerulean3 и cpVenus ^cd показаны пунктирными линиями. Остатки показаны в виде палочек.( B ) Полярные взаимодействия, опосредованные остатками (показаны в виде стержней) от линкеров между mCerulean3 и кальций-связывающим доменом (у лосося), а также взаимодействия между cpVenus ^cd и кальций-связывающим доменом (пурпурный) . ( C ) Гидрофобные взаимодействия между остатками (показаны в виде палочек) линкеров между mCerulean3 и кальций-связывающим доменом (у лосося), а также линкером между cpVenus ^cd и кальций-связывающим доменом (пурпурный) с остатками (серым цветом) из ядра минимального домена TnC.( D и E ) Крупный план области вокруг N532 Twitch-2B и мутанта N532F Twitch-2B (Twitch-6).

Линкер между mCerulean3 и кальций-связывающим доменом (V ₂₃₂ ADA) образует спираль 3 ₁₀, которая прочно удерживается на месте водородными связями основной цепи от V232 и S236 в mCerulean3 до E301 и E239 кальция. -связывающий домен (рис. 2Б). Далее линкер между кальций-связывающим доменом и cpVenus ^cd (P ₃₀₅ IYPEL) образует полтора α-спиральных витка (рис.2, B и C), карбонилы основной цепи E309 и L310 образуют водородные связи с боковой цепью R551 (рис. 2B) cpVenus ^cd. Боковая цепь E309 также образует водородную связь с Y152 mCerulean3, плотно связывая три домена вместе. Остатки I306, Y307 и L310 этой короткой спирали участвуют в сети гидрофобных контактов (рис. 2C). Очевидно, что скрининг оптимальных линкеров ( 8 ) привел к последовательностям со спиральными элементами, очень хорошо интегрирующимися в структуру минимального домена TnC, в то время как эти линкеры удерживают на месте донорный и акцепторный домены в основном за счет полярных взаимодействий.

Расчет эффективности FRET на основе структуры

Структура предоставила важную информацию для расчетов FRET. Во-первых, расстояние между центрами масс флуорофоров составляет 3,65 нм (рис. 1B). Затем внутри структуры флуорофоры mCerulean3 и cpVenus ^cd выровнены в конфигурации «голова к голове». Таким образом, мы могли точно определить относительную ориентацию дипольных моментов флуорофоров (рис. 1C; см. Материалы и методы), которые доступны из расчетов теории функционала плотности ( 15 ).Используя эту объединенную информацию, мы рассчитали фактор ориентации κ ², равный 1,98 (уравнение 1; материалы и методы), и расстояние Ферстера, R ₀, 6,9 нм для mCerulean3 / cpVenus ^cd Пара FRET (уравнение 3; материалы и методы). С этими параметрами, используя уравнение Фёрстера, E = R06 / (R06 + r6), теоретическая эффективность FRET, E , Twitch-2B была определена как 0,98. Эффективность FRET, экспериментально определенная с помощью деканшинга донора, равна 0.78 (рис. S3A), что значительно ниже, чем полученное из кристаллической структуры.

Два мономера Twitch-2B в асимметричном блоке (рис. S1A) не только имеют очень похожую конформацию (RMSD основной цепи 0,992 Å), но также образуют очень похожие контакты упаковки кристаллов (рис. S1C). Таким образом, мы делаем вывод, что ориентация доменов в мономере сама по себе не ограничивается кристаллической упаковкой, а в основном внутримономерными взаимодействиями, описанными выше (рис. 2А), и очень вероятно выбрана из пула уже существующих конформаций в растворе.Поскольку междоменные интерфейсы в мономере Twitch-2B относительно малы (рис. 2A), высокая гибкость решения может быть причиной наблюдаемого снижения эффективности FRET. Чтобы исследовать эту гипотезу, мы затем обратили внимание на передовые методы ЯМР.

ЯМР-исследование динамики биосенсора

Чтобы получить представление о возможной динамике, мы использовали парамагнитный ЯМР ( 16 ) с образцом Twitch-2B, где два сайта связывания кальция TnC были загружены диспрозием (Dy).Анизотропная магнитная восприимчивость комплекса TnC-Dy ₂ индуцирует парамагнитный тензор выравнивания, который может быть определен из структуры ( 17 ) (см. Материалы и методы). Мы использовали спектрометры на 900 МГц и 1,1 ГГц, поскольку тензор юстировки квадратично зависит от магнитного поля. Если данный флуоресцентный белок является жестким по отношению к TnC, то тензор выравнивания, который он испытывает, идентичен TnC. Если, однако, флуоресцентный белок является динамическим по отношению к TnC, то это движение уменьшит тензор выравнивания первого ( 16 , 18 ).Это позволяет количественно оценить динамику флуоресцентных белков по отношению к TnC. В то время как диполярные связи усредняются в изотропном растворе из-за случайного изотропного переворачивания, парамагнитно-индуцированные тензоры выравнивания приводят к анизотропному распределению ориентации TnC и, следовательно, связанных зеленых флуоресцентных белков в растворе, что приводит к неполному усреднению диполярного муфты, позволяющие наблюдать остаточные диполярные связи (RDC). Мы определили RDC метильных групп парамагнитно выровненного Twitch-2B ( 19 ) (см. Материалы и методы).Наблюдаемый диапазон RDC достаточен для измерения размера тензора выравнивания ( 20 ), так что отнесение метильных групп не было необходимым.

Мы обнаружили, что диапазон значений RDC и, следовательно, тензор выравнивания, испытываемый флуоресцентными белками, в 10 раз меньше, чем рассчитанные по жесткой рентгеновской структуре (рис. 3; см. Материалы и методы). Таким образом, динамика должна быть причиной несоответствия между расчетной и экспериментальной эффективностями FRET.Кристаллическая структура может быть только частью динамического конформационного ансамбля в растворе.

Рис. 3 Гистограммы парамагнитных данных RDC.

Прогнозирование RDC метильных групп в двух доменах флуоресцентного белка и TnC с использованием рентгеновской структуры (выделено пурпурным цветом). Тензор выравнивания, индуцированный двумя ионами диспрозия, связанными с TnC, является результатом трансляции тензора, полученного из кальмодулина (см. Материалы и методы). Экспериментальные RDC от парамагнитного ЯМР Twitch-2B (зеленый) и Twitch-6 (пурпурный).Дальность действия уменьшается в 10 и 5 раз для Twitch-2B и Twitch-6 соответственно.

Структурный дизайн мутанта с улучшенной эффективностью FRET

Предполагая структурную целостность отдельных доменов, мы предположили, что линкерные области являются стержнем этой динамики. На границах раздела между доменом TnC и донорным и акцепторным доменами преобладают полярные взаимодействия (рис. 2А). Мы предположили, что замена этих взаимодействий гидрофобными контактами сделает линкеры жесткими и увеличит экспериментальную эффективность FRET.С этой целью мы разработали мутацию N532F (рис. 2, D и E) на поверхности cpVenus ^cd, создавая новое взаимодействие с F249 кальций-связывающего домена (рис. 2D). Как и ожидалось, эта мутация вызвала существенное увеличение максимального изменения отношения FRET с 800 до 1100% in vitro (рис. S4). В кристаллической структуре этого мутанта (Twitch-6; таблица S2) боковая цепь F532 действительно связывается в гидрофобный карман, образованный боковыми цепями F249, Asp262 и Y338 (рис. 2E).В остальном структуры Twitch-6 и Twitch-2B очень похожи (RMSD 0,25 Å), что приводит к почти идентичной теоретической эффективности FRET (см. Дополнительные материалы). Благодаря этой конструкции экспериментальная эффективность FRET Twitch-6 увеличилась до 0,90, с 0,78 для Twitch-2B (рис. S3B), а диапазон RDC, измеренных с Twitch-6, удвоился по сравнению с Twitch-2B (рис. 3). . Это указывает на сужение интерфейса между доменом TnC и cpVenus ^cd, и, таким образом, снижение динамики между доменами является причиной увеличения FRET.

Конформационные ансамбли в решении

Определив динамику как причину снижения эффективности FRET Twitch-2B в решении, мы хотели получить представление о конформационном пространстве, возникающем в результате этой динамики. Для этой цели мы выбрали конформационные ансамбли, исследующие динамику остова исключительно на динамических линкерных областях между доменами флуоресцентного белка и доменом TnC (см. Материалы и методы), оценивая более 1 миллиона шестичленных ансамблей против наблюдаемых RDC и эффективности FRET (Таблица 1, рис.4 и Материалы и методы). Среди всех возможных ансамблей мы выбрали тот, который лучше всего воспроизводит как экспериментальную эффективность FRET, так и диапазон RDC (Таблица 1). Этот ансамбль полностью объясняет, как гибкость неупорядоченных остатков линкерных областей приводит к наблюдаемому снижению эффективности FRET и диапазона RDC.

Таблица 1 Результаты выбора ансамбля. Рис. 4 Ансамбли белков Twitch, согласующиеся с измеренными эффективностями RDC и FRET.

Ансамбли для Twitch-2B (слева) и Twitch-6 (справа) содержат по шесть структур каждый, причем самые большие отклоняющиеся структуры показаны зеленым и красным.Состояния, которые не являются этими крайними конформациями, прозрачны.

Влияние на улучшенную конструкцию датчика FRET

Таким образом, мы получили кристаллическую структуру флуоресцентного кальциевого биосенсора Twitch-2B и вместе с динамикой линкеров, определенной с помощью парамагнитного ЯМР, мы количественно оценили эффективность FRET. Поскольку динамика ограничивала эффективность FRET, мы успешно сконструировали ригидифицированный мутант с увеличенным FRET. Таким образом, структурные и динамические характеристики ратиометрических датчиков FRET обеспечили принципы проектирования, которые могут быть применимы к другим системам, в которых эффекты FRET используются для восприятия сигналов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клонирование, экспрессия и очистка Twitch-2B и Twitch-6

Конструкция Twitch-2B была описана ранее ( 8 ). Для настоящего исследования кодирующая последовательность трехдоменного слитого белка была клонирована в модифицированный вектор pET16b, кодирующий слитый белок с N-концевой меткой His ₇ и последовательностью расщепления, узнаваемой вирусом травления табака (TEV). Мутант Twitch-2B N532F (Twitch-6) был создан с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза QuikChange (Agilent).Экспрессионные конструкции pET16bTEV-Twitch-2B и pET16bTEV-Twitch-6 трансформировали в штамм Escherichia coli BL21 (DE3). Экспрессию белка проводили при 303 К индукцией 0,5 мМ изопропил-β-d-1-тиогалактопиранозидом. Клетки собирали через 7 часов после индукции. Меченный селенометионином белок Twitch-2B был сверхэкспрессирован в штамме B834 метионин-ауксотрофа E. coli в минимальной среде с добавлением (+) — l-селенометионина в соответствии с группой по экспрессии белка EMBL (Европейская лаборатория молекулярной биологии) (www.embl.de).

Осадок клеток из 1 литра встряхиваемой культуры ресуспендировали в 60 мл лизирующего буфера [20 мМ трис-HCl (pH 7,9), 300 мМ NaCl, 20 мМ имидазол, 0,5 мМ фенилметилсульфонилфторид с одной таблеткой полного количества ЭДТА- свободных ингибиторов (Roche) на 100 мл лизисного буфера]. Клетки лизировали ультразвуком с последующим центрифугированием при 27000 g и 277 К. Из супернатанта рекомбинантный белок очищали с помощью аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом на 3 мл агарозной смолы Ni-нитрилотриуксусной кислоты (NTA) (Qiagen).Метку слияния His ₇ отщепляли протеазой TEV и удаляли инкубацией с 1 мл Ni-NTA агарозной смолы. Белок диализовали против 20 мМ трис (pH 7,0) и 150 мМ NaCl. После доведения концентрации сульфата аммония в растворе белка до 1 М белок дополнительно очищали хроматографией на гидрофобном взаимодействии на колонке с фенилсефарозой объемом 10 мл (GE Healthcare). Белок элюировали с этой колонки 50-мл градиентом от 1 до 0 М сульфата аммония.Фракции, содержащие белок, объединяли и концентрировали до объема 2,5 мл с помощью концентратора для ультрафильтрации с MWCO (пороговая молекулярная масса) 30 кДа (Vivascience). Наконец, белок очищали эксклюзионной хроматографией на гель-фильтрационной колонке HiLoad 26/60 Superdex 200 мкг. Фракции пика объединяли, диализовали против 20 мМ трис-HCl (pH 7,0), 100 мМ NaCl и 5 мМ CaCl ₂, и концентрацию белка доводили до 20 мг / мл.

Флуоресцентная спектроскопия

Для спектроскопии рекомбинантного Twitch-2B in vitro белок был очищен от E.coli с использованием смолы Ni-NTA, как описано ( 6 ). Спектроскопию выполняли на спектрофотометре Cary Eclipse (Varian). Донорское расщепление Twitch-2B проводили путем переваривания Twitch-2B в связанном с кальцием состоянии в течение ночи при комнатной температуре с химотрипсином (70 Ед / мл; Sigma-Aldrich) при записи FRET. Небольшое оставшееся излучение cpVenus ^cd после расщепления химотрипсина было избирательно фотообесцвечено (5 мин) с помощью матрицы из шести светодиодов Luxeon Lumiled с пиком на длине волны 530 нм, с общей рассеиваемой мощностью 14.7 Вт и 870 люмен. Для защиты mCerulean3 от обесцвечивания использовали LP (длиннопроходный) фильтр с длиной волны 500 нм. Связанный с кальцием Twitch-6 был очень устойчив к расщеплению протеазой. Поэтому EGTA (конечная концентрация, 5 мМ) добавляли во время переваривания химотрипсина, чтобы получить спектр деквенированного mCerulean3.

Кристаллизация, сбор данных и определение структуры

Кристаллы Twitch-2B и Twitch-6 были получены путем диффузионного смешивания паров 1 мкл раствора белка с 1 мкл раствора для лунок [0.2 M Na-формиат (pH 7,0), 5 мМ CaCl ₂ и 18-20% полиэтиленгликоля 3350]. Кристаллы были подвергнуты криозащите, перенеся их в хорошо раствор с добавлением от 16 до 18% глицерина на 1 мин и быстро охладив, погрузив их в жидкий азот.

Сбор данных проводился в PXII, SLS, Швейцария, с использованием детектора PILATUS 6M (Dectris). Собственные данные собирали при 100 К на длине волны 1 Å. Данные по производному селенометионина были измерены при 0,98 Å. Все данные были обработаны с помощью программного обеспечения для детектора рентгеновских лучей (XDS) ( 21 ) и масштабированы с помощью SADABS (Bruker AXS).Определение пространственной группы и статистический анализ выполняли с использованием XPREP (Bruker AXS). Фазирование выполняли с помощью AutoSol ( 22 ).

Первоначальная модель была построена с помощью AutoBuild и дважды уточнена с помощью phenix.refine ( 23 ) с промежуточным созданием модели вручную с помощью Coot ( 24 ). Окончательная модель была получена путем комбинированного ручного отслеживания (Coot) и уточнения с использованием Refmac5 ( 25 ). На графике Рамачандрана 96,69% остатков располагались в предпочтительной области 2.72% в разрешенной области и 0,58% остатков были выбросами. Кристаллическая структура Twitch-6 была решена с помощью PHASER ( 26 ), используя PDB (Protein Data Bank) запись 6GEL в качестве модели поиска. Построение и уточнение модели выполнялись, как описано для Twitch-2B. Для этого мутанта 96,68% остатков попали в предпочтительную область графика Рамачандрана, 2,83% попали в разрешенную область и 0,49% были выбросами.

Расчеты FRET

Фактор ориентации κ ² может быть извлечен из структурной информации следующим образом: κ2 = (cos θT — 3 cos θD cos θA) 2 (1) где θ _T — угол между эмиссионным переходом диполь донора и диполь перехода поглощения акцептора; θ _D и θ _A — углы между этими диполями и вектором r , соединяющим донорный и акцепторный флуорофоры ( 27 ).Ориентация дипольных моментов перехода относительно вектора связи C → O (ω) в градусах ωD = 73 ° ωA = 76 ° была взята из Ansbacher et al. ( 15 ), а угловые параметры были извлечены из кристаллографических координат в угловых единицах θT = 152,95 ° θD = 149,17 ° θA = 26,79 °

Подробные расчеты поясняются в файле данных S1. Интеграл перекрытия, Дж, (λ), был рассчитан из экспериментальных спектров поглощения и излучения изолированных доменов cpVenus и mCerulean3 соответственно (рис.S5) со сценарием Python, включенным в качестве дополнительной информации. J (λ) был определен как 2,052 × 10 ¹⁵ M ⁻¹ см ⁻¹ нм ⁴, следующим образом: J (λ) = ∫0∞FD (λ) εA (λ) λ4dλ = ∫0∞FD (λ) εA (λ) λ4dλ∫0∞FD (λ) dλ (2) где F _D (λ) — нормированная интенсивность флуоресценции донора в диапазоне длин волн от λ до λ + Δλ. ε _A (λ) — коэффициент экстинкции акцептора при λ.

Расстояние Ферстера, R ₀, можно рассчитать на основе ранее полученных экспериментальных параметров R0 = 0.211 (κ2n − 4QDJ (λ)) 1/6 (3) где Q _D (0,87) — квантовый выход донора в отсутствие акцептора ( 4 ) и n , (1,33) показатель преломления водной среды.

Наконец, эффективность передачи энергии, E , может быть рассчитана как отношение скорости передачи к общей скорости распада донора в присутствии акцептора E = R06R06 + r6 (4)

Следуя этой процедуре, эффективность FRET была определена как E = 0.979, из кристаллографической структуры Twitch-2B. Эквивалентный расчет, выполненный со структурой мутанта Twitch-6, дает E = 0,983 (см. Файлы данных S1 и S2).

ЯМР-спектроскопия

Мы экспрессировали белки Twitch-2B и Twitch-6 в минимальной среде Toronto, приготовленной из 100% D ₂ O и пердейтерированной d-глюкозы и дополненной предшественниками аминокислот α-кетомасляной кислотой (метил-13C , 3,3-D2) и α-кетоизовалериановой кислоты (3-метил-13C, 3,4,4,4-D4), таким образом, селективно мечение атомами ¹³ C и ¹ H только метильных групп остатки валина, лейцина и изолейцина, сохраняя при этом остальные атомы C как ¹² C и протоны как ² H ( 19 ).

Сначала изотропные спектры образцов получали в буфере А [20 мМ Mops (pH 7,0), 100 мМ NaCl и 5 мМ CaCl ₂ в 100% D ₂ O]. Затем белки диализовали против буфера B [20 мМ Mops (pH 7,0), 100 мМ NaCl и 10 мМ EDTA] с последующим диализом против буфера C [20 мМ Mops (pH 7,0) и 100 мМ NaCl] и, наконец, заменяли на буфер С, приготовленный на 100% D ₂ O, содержащем три эквивалента диспрозия, перед измерениями ЯМР. Концентрация белка в образцах была примерно 0.5 мМ.

Образцы были протестированы с помощью экспериментов с метил-TROSY ( 19 , 28 ) (рис. S7) при 900 МГц и 1,1 ГГц, а связи J и J + RDC были определены с использованием J -модулированного Эксперимент с метил-TROSY ( 29 ), изображенный на рис. S6 в виде матриц 2048 × 128 комплексных точек данных с 96 переходными процессами на приращение ( t ₁). Общие использованные задержки модуляции J были следующими: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 и 20 мс (рис.S8). ЯМР-эксперименты проводились с использованием 5-мм TCI (криозонда тройного резонанса с инверсным детектированием) на спектрометре 900 МГц и 3-мм криозонда TCI на спектрометре 1,1 ГГц, оба оснащены консолями NEO (Bruker). Интенсивности (максимальная амплитуда) сигналов были извлечены с помощью CARA (компьютерное определение резонанса) ( 30 ) в экспериментах с обработкой NMRPipe ( 31 ) и проанализированы с помощью скриптов Python (рис. S8), следуя Pederson et al. ( 29 ).

Расчет парамагнитного тензора

Мы взяли парамагнитный тензор из комплекса кальмодулин-IQ, связанного с диспрозием, из ( 18 ) и рассчитали суммарный тензор дважды занятого кальций-связывающего домена TnC. Сайт связывания кальция 1 TnC перекрывается с сайтом связывания лантанидов кальмодулина (CaM N60D). Мы повернули матрицу выравнивания с сайта связывания кальция из CaM на второй сайт связывания кальция TnC и добавили его к тензору сайта связывания кальция 1, таким образом получив общий тензор TnC.Затем этот тензор использовался для расчета RDC из парамагнитных белков Twitch ACaM = (1,05 10−31−1,92 10−322,04 10−31−1,92 10−32−1,22 10−316,46 10−322,04 10−316,46 10−321,67 10−32 ) ATwitch = (1,46 10−318,39 10−323,46 10−318,39 10−32−1,06 10−312,26 10−323,46 10−312,26 10−32−3,92 10−32)

Тензоры даны в м ³ M ⁻¹.

Генерация ансамбля

Сначала мы индивидуально смоделировали все возможные двугранные углы основной цепи (ϕ и ψ; выборка с шагом 60 °) линкерных остатков (от Arg ²²⁹ до Gln ²³¹ для mCerulean3 и Met ³¹¹ для Gly ³¹³ для cpVenus), что не привело к стерическому конфликту между одним из модифицированных доменов флуоресцентного белка и доменом TnC.Каждую из двух линкерных областей моделировали независимо. Из всех возможных комбинаций ϕ, ψ (117 649) вращение mCerulean3 привело к 477 возможным конформациям, в то время как cpVenus допустил 84 конформации, обеспечивая в целом 40 086 возможных конформаций.

Во-вторых, мы случайным образом объединили возможные структуры для mCerulean-TnC и TnC-cpVenus в ансамбли из шести членов. Мы произвольно отобрали 1 миллион шестичленных ансамблей из 40 068 возможных ϕ, ψ-комбинаций линкеров между mCerulean и TnC и между TnC и cpVenus, чтобы гарантировать правильное исследование конформационного пространства Twitch.

В-третьих, мы рассчитали диапазон RDC (используя тензор, полученный, как описано выше) и FRET ансамблей и сравнили их с экспериментальными значениями, определив коэффициент качества ансамбля Qens = ∑i = 1i = 6 (RDCi − RDCeRDCe) 2+ (FRETi-FRETeFRETe) 2, где RDC _i — диапазоны распределения, субиндекс e указывает экспериментальное значение, а i указывает значение из члена ансамбля. Такое значение добротности отличается от 0, если совпадения предсказанных откликов RDC и FRET от ансамбля отклоняются от экспериментальных данных, и 0 в случае полного совпадения.Наконец, ансамбли были отсортированы по их Q _ens, и был выбран самый низкий из них.

Измерения SAXS

Данные SAXS были собраны на канале BM29 Европейского центра синхротронного излучения (ESRF) в Гренобле, Франция, с использованием автоматического устройства смены образцов ( 32 ). Белок диализовали либо против буфера A [20 мМ Mops (pH 7,0), 100 мМ NaCl и 5 мМ CaCl ₂] (связанное с кальцием состояние), либо против буфера B [20 мМ Mops (pH 7,0), 100 мМ NaCl и 10 мМ ЭДТА] (без кальция).Перед измерением белок центрифугировали для удаления более крупных частиц. Образцы измеряли при концентрациях 2,5, 10 и 20 мг / мл. Буфер для диализа использовали для коррекции эталонного буфера. Данные собирали при 293 К с использованием длины волны 0,995 Å и расстояния от образца до детектора 2,867 м. Загружали сто микролитров каждой концентрации образца, собирали и объединяли 10 кадров. Образцы постоянно подавались в кювету, чтобы минимизировать эффекты радиационного повреждения.Изображения детектора были объединены и преобразованы в одномерные кривые рассеяния, а вклады буфера в рассеяние были вычтены с использованием программного обеспечения BsxCuBE. Дальнейшая обработка данных выполнялась автоматически с использованием онлайн-конвейера EDNA ( 33 ) для оценки качества образца и эффектов радиационного повреждения. Агрегации белков или радиационного повреждения не наблюдалось.

Данные были дополнительно проанализированы с помощью программного пакета ATSAS ( 34 ). Вкратце, первичная обработка и анализ данных проводились с использованием программ PRIMUS ( 35 ) и GNOM ( 36 ).

Теоретическое рассеяние от кристаллической структуры было рассчитано с использованием программы CRYSOL ( 37 ) (рис. S2), а молекулярные массы рассчитаны с использованием образца бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта.

Благодарности: Мы благодарим персонал компании SLS, X10SA за поддержку при сборе рентгеновских данных и ESRF, BM29 за поддержку при сборе данных SAXS. Мы благодарим M. Paulat, C. Schwiegk и A. Moritz за техническую помощь в производстве белка и K.Оверкамп для масс-спектров электроспрея. С. благодарит T. Gruene и G. Sheldrick за советы по уточнению кристаллической структуры и структурному анализу. К.Г. и П.Т.-М. поблагодарить R. Kuemmerle (Bruker Biospin) за измерения ЯМР на частоте 1,1 ГГц. Финансирование: Эта работа была поддержана Обществом Макса Планка и DFG SFB 870 (O.G.). П.Т.-М. был поддержан докторской стипендией Гумбольдта. Вклад авторов: P.T.-M. выполнен ЯМР. П.Т.-М. и К.Г. разработал парамагнитный метод ЯМР.П.Т.-М. рассчитаны структурные ансамбли. П.Т.-М. и С. выполнены измерения SAXS. К.Г. рассчитал FRET по рентгеновским структурам. Т.Т. и О.Г. определили экспериментальные эффективности FRET. С. кристаллизовал Twitch-2B и Twitch-6 и решил кристаллические структуры. Рукопись написана всеми авторами. С. разработал проект. Конкурирующие интересы: Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов. Доступность данных и материалов: Структуры депонированы с кодом 6GEL для биосенсора Twitch-2B и 6GEZ для мутанта Twitch-2B N532F (Twitch-6).Все данные, необходимые для оценки выводов в статье, представлены в документе и / или дополнительных материалах. Дополнительные данные, относящиеся к этой статье, могут быть запрошены у авторов.

Биомолекул | Бесплатный полнотекстовый | Отдельная молекула FRET: мощный инструмент для изучения внутренне неупорядоченных белков

1. Введение

Внутренне неупорядоченные белки (IDP) и белки, содержащие внутренне неупорядоченные области (IDR), все чаще признаются в качестве критических компонентов клеточных сигнальных путей и регуляторных сетей [1,2 , 3,4,5,6].В отличие от точно сложенных статических структур, которые обычно ассоциируются с красочными изображениями ферментов, воспроизводимых в учебниках и на обложках журналов, ВПЛ не складываются в стабильную структуру. Скорее, пептидная цепь IDP непрерывно колеблется в большом конформационном пространстве (рис. 1). Эта конформационная гибкость, вдохновляющая пространства конфигурации IDP, которые иногда называют плеоморфными ансамблями или «нечеткими» структурами, является ключом к способности IDP служить концентраторами в сетях сигнализации.Широкий диапазон взаимозаменяемых конформаций позволяет IDP взаимодействовать с множеством партнеров для координации множества возможных путей передачи сигналов. Центральная роль IDP в таких клеточных транзакциях отражена в недавних открытиях, что в сотовых сетях разработаны переключатели (т.е. фосфорилирование) для управления диапазоном конфигураций IDP с целью регулирования сигнальных путей [7,8,9,10]. Т.о., выяснение конформационной динамики IDP, вероятно, откроет механизмы, с помощью которых конформационная динамика IDP может модулировать передачу сигналов в клетках.

Быстрая и непредсказуемая конформационная динамика IDPs представляет проблемы для экспериментальных подходов к характеристике их структур. Средний размер IDP, отраженных сопротивлением при движении в жидкости (гидродинамический радиус), можно измерить несколькими методами, такими как аналитическое ультрацентрифугирование (AUC), динамическое рассеяние света (DLS) и гель-фильтрация. Гидродинамический радиус отражает подвижность частицы в растворе, позволяя моделировать оценку пространственной протяженности и, в некоторых случаях, информацию о простых параметрах формы (т.е., круглые против продолговатых). Заимствуя идеи из физики полимеров, гидродинамический радиус может быть связан с физическими определениями пространства состояний IDP, такими как среднеквадратичное расстояние от конца до конца или радиус вращения цепи, хотя важно подчеркнуть, что отношения для преобразования между гидродинамическим радиусом и радиусом вращения в большинстве случаев весьма нетривиальны. Другие биофизические методы, такие как статическое рассеяние света, ядерный магнитный резонанс (ЯМР) и малоугловое рентгеновское или нейтронное рассеяние (SAXS и SANS соответственно), могут обеспечить доступ к этим параметрам и позволить экспериментальное сравнение с эффективным гидродинамическим радиусом.Однако важно отметить, что эти методы предоставляют информацию только о среднем значении ансамбля конфигураций и не дают представления о молекулярной гетерогенности.

Тем не менее, эксперименты ЯМР могут предоставить более подробную информацию о контактах в цепочке и ансамблях флуктуаций, но они отнимают много времени и утомительны [11,12,13]. Напротив, основанные на флуоресценции методы, такие как флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS), наносекундная FCS (nsFCS), nsFCS-FRET и методы контактного гашения, обеспечивают доступ к быстрым временным шкалам (время жизни флуоресценции, которое может быть в наносекундном диапазоне), и могут дать важные информация о локальных флуктуациях, нелокальных контактах и кинетике реконфигурации цепей [14,15,16,17,18,19].В этом мини-обзоре основное внимание будет уделено резонансному переносу энергии флуоресценции (или Фёрстера) одиночных молекул (FRET) (или smFRET) [20,21] и показано, как этот метод может предоставлять информацию в реальном времени о динамических изменениях в ансамбле IDP с чувствительностью к индивидуальным флуктуациям или субпопуляции.

Одномолекулярный FRET имеет несколько уникальных преимуществ перед другими методами, обычно используемыми для изучения IDP. smFRET имеет временное разрешение от 0,1 мс до более 1000 с. Способность следить за отдельной молекулой в течение продолжительного времени дает инструмент, позволяющий выявить переключение ансамбля во временных масштабах, которые длиннее по сравнению с молекулярными флуктуациями.Масштабы длины, исследуемые с помощью smFRET, находятся в диапазоне 2-8 нм, что является более длинным масштабом, чем методы контактного тушения, выявляя конформации, при которых точки на белковой цепи, исследуемые на тушение, могут никогда не вступить в тесный контакт. Наконец, по сравнению с другими методами, такими как SAXS или NMR, которые требуют обширного оборудования, smFRET относительно недороги и просты в реализации. Таким образом, smFRET предоставляет инструмент быстрого скрининга для характеристики эффектов посттрансляционной модификации, вариации последовательности или влияния изменений окружающей среды на глобальный конформационный ансамбль IDP.

Одномолекулярный FRET набирает популярность для изучения ВПЛ, и несколько отличных обзоров предоставили проницательные перспективы [21,22,23]. В этом мини-обзоре мы представляем практическую точку зрения и сосредотачиваемся на соображениях по разработке, выполнению и интерпретации экспериментов по измерению smFRET от IDP. В заключение мы выделим отдельные исследования, которые иллюстрируют использование smFRET для распознавания структурных / функциональных связей IDP.

2. Как применить FRET одиночной молекулы к исследованиям белков с внутренне неупорядоченным строением

FRET — это зависимое от расстояния соединение между двумя флуорофорами с разными спектральными диапазонами поглощения и излучения.Один из флуорофоров, обычно называемый донором, поглощает возбуждающий свет. Изолированные возбужденные доноры излучают свой характерный спектр посредством обычных процессов флуоресценции. Если донор находится достаточно близко к другому флуорофору, называемому акцептором, а не возбужденный донор, излучающий свой собственный спектр, возбуждение донора может передаваться акцептору, что приводит к излучению акцептора. Соотношение интенсивностей излучения акцептора и донора дает информацию о разделении флуорофоров (рис. 2А).Конкретный выбор флуорофоров влияет на шкалу длины, для которой полезен FRET. Таким образом, первоначальные соображения в любом эксперименте FRET заключаются в том, какие флуоресцентные зонды использовать и как прикрепить их к исследуемой молекуле. Флуорофоры для исследований FRET одиночных молекул должны быть яркими (высокий квантовый выход), а также иметь длительное время жизни излучения до фотообесцвечивания. Подходящие флуорофоры подробно рассмотрены в другом месте [24], но обычно включают коммерчески доступные цианин (Cy3, Cy5), серии Alexa и Atto.Эти флуорофоры доступны с несколькими химическими модификациями, которые позволяют прикрепляться к IDP. Поскольку цистеин не является обычным в большинстве белков, реактивные с цистеином флуорофоры часто используются для присоединения флуорофоров к специфическим остаткам цистеина, встречающимся в природе или введенным посредством сайт-специфической мутации в мутант IDP, не содержащий цистеина. Как и в случае любой модификации флуоресценции, важно убедиться, что меченые и немеченые белки ведут себя одинаково во всех доступных функциональных анализах (например,g., связывание лиганда, активность АТФазы и т. д.). Независимо от того, доступны ли функциональные анализы для сравнения меченых и немеченых образцов, рекомендуется провести дополнительные эксперименты для оценки возможного воздействия маркировки. Например, сравнение измерений smFRET для данных сайтов прикрепления метки с использованием разных пар флуорофоров может быть использовано для исследования того, какое влияние конкретные свойства красителей (размер, заряд, гидрофобность и т. Д.) Могут иметь на конфигурации изучаемого белка.Кроме того, согласованность между экспериментами с использованием различных мест прикрепления меток для любой данной пары флуорофоров создает уверенность в том, что мечение принципиально не изменяет молекулярную функцию. IDP, содержащий два цистеина, подвергшихся воздействию смеси реактивных донорных и акцепторных флуорофоров, приведет к случайной маркировке, что обычно не является проблемой для приложений smFRET для IDP. Измеряя эмиссию флуоресценции на уровне одной молекулы, популяции белков, меченных двумя донорами или двумя акцепторами, можно игнорировать, и только смешанную популяцию доноров / акцепторов переносить в анализ.Возможные экологические эффекты на поведение флуорофора из-за специфического контекста каждого цистеина обычно незначительны для большинства приложений, которые ищут конформационное переключение или не полагаются на абсолютную калибровку расстояния между зондами. При необходимости возможно сайт-специфическое мечение каждого флуорофора с использованием нескольких подходов, включая включение неприродных аминокислот или ферментативное мечение коротких целевых аминокислотных последовательностей [25]. Мечение более чем двумя флуорофорами может позволить одновременное измерение более чем одного расстояния вдоль пептидной цепи, хотя это передовые методы [26,27,28,29,30,31].Приборы для измерения сигналов smFRET от меченных красителем IDP возбуждают флуоресценцию с помощью лазерных источников и собирают излучение с помощью объективов микроскопов с высокой числовой апертурой. Фоновая флуоресценция должна быть минимизирована, чтобы можно было обнаруживать тусклые сигналы одиночных молекул. Две различные конфигурации оптического освещения обычно используются для минимизации фоновой флуоресценции, освещения с полным внутренним отражением (TIR) и конфокальной микроскопии [22,23,32,33]. TIR применяется с IDP, иммобилизованными на поверхности проточной ячейки.Обычно молекулы, которые модифицированы биотином, 6-гистидиновыми метками или другими аффинными метками, привязаны непосредственно к своим партнерам по связыванию, которые прикреплены к пассивированной поверхности (авидин / стрептавидин для биотина, антитела для 6-гистидиновых меток и т. Д.). IDP, которые лишены взаимодействия с липидными бислоями, могут быть инкапсулированы внутри липидных пузырьков, которые привязаны к поверхности (Figure 2B) [34]. Для любого подхода с привязкой к поверхности иммобилизация имеет то преимущество, что позволяет наблюдать за одним белком в течение длительного периода времени, но имеет недостаток, заключающийся в потенциально деструктивных взаимодействиях с поверхностью.Поверхностных взаимодействий можно избежать, сфокусировав луч конфокального микроскопа в объеме раствора, но молекулы обнаруживаются только на время в миллисекундном диапазоне, поскольку они свободно диффундируют через фокус лазера. Стратегии, основанные на сопоставлении повторных посещений объема изображений, могут расширить полезную информацию, извлеченную в конфокальных экспериментах [35]. В обеих схемах освещения флуоресцентное излучение улавливается линзой объектива микроскопа, спектрально разделяется дихроичной оптикой, фильтруется для выделения диапазонов длин волн излучения донора и акцептора и передается на детекторы.Сигналы от одиночных молекул невысоки и требуют обнаружения с помощью наиболее чувствительных устройств, включая ПЗС-матрицы с электронным умножением (emCCD) и научные КМОП-камеры (sCMOS; или научные дополнительные металлооксидно-полупроводниковые) камеры, лавинные фотодиоды (APD) или фотоэлектронные умножители (PMT). . Если освещение представляет собой импульсный источник света, измерения времени жизни флуоресценции могут быть получены и преобразованы в эффективности FRET, которые относятся к разделению донор-акцептор. При непрерывном освещении детекторы обеспечивают зависимость интенсивности от времени для донорного и акцепторного каналов (I _D и I _A соответственно), из чего эффективность FRET E может быть рассчитана как E = I _A / ( I _A + I _D), который связан с мгновенным разделением донор-акцептор d как E = 1 / (1 + (d / R ₀) ⁶) (рис. 2A).Параметр R ₀, называемый радиусом Ферстера, определяет масштаб длины соединения FRET и представляет собой значение, при котором эффективность передачи составляет 50%. R ₀ определяется свойствами донорных и акцепторных флуоресцентных красителей и чаще всего находится в диапазоне 4–7 нм. Этот диапазон радиусов Ферстера делает FRET полезным для разделения донор-акцептор между 3 и 8 нм. В некоторых случаях эффективность FRET может быть скорректирована с учетом инструментальных факторов и факторов окружающей среды, чтобы предоставить количественную информацию о расстоянии между донорными и акцепторными флуорофорами и, таким образом, может быть ценным инструментом для структурных исследований биологических молекул [36,37,38,39].Внутренне неупорядоченные белки по определению не существуют в единой четко определенной конформации, которая могла бы привести к единому разделительному расстоянию для присоединенных донорных и акцепторных красителей. Скорее они существуют как ансамбли быстро взаимопревращающихся конформеров. Эти динамические изменения конфигурации происходят быстро по сравнению с экспериментальным интервалом измерения, в результате чего эффективность smFRET усредняется по диапазону расстояний [40]. Хотя этот быстрый конформационный обмен усиливает сильно усредненную интерпретацию относительного фактора ориентации диполей донора-акцептора в FRET (фактор каппа-квадрата, более подробно описанный в [41,42]), нелинейность фундаментальной связи между эффективностью FRET и отделение красителя может привести к значительной неопределенности при оценке этого среднего значения.Модель распределения вероятностей расстояний между донором и акцептором P (r) требуется, чтобы связать измеренную усредненную эффективность FRET с лежащим в основе разделением донор-акцептор, но соответствующая модель не всегда ясна. Усредненная эффективность FRET E> может быть вычислена с учетом распределения вероятностей (P (r)) и зависимости эффективности FRET от расстояния, E (r) = 1 / (1 + (r / R ₀) ⁶) в виде

〈E〉 = ∫ P (r) E (r) dr

Распределение Гаусса для P (r) обычно используется, но иногда включаются и другие распределения вероятностей для учета качества растворителя, самопроизвольного избегания, внутреннего трения или других явлений физики полимеров [40,43,44,45,46,47].Не строго естественное неупорядоченное состояние, разворачивание белков с помощью сильных денатурантов генерирует конформацию расширенного клубка, которая широко изучена с помощью smFRET [14,15,20,41,48]. Денатуранты разворачивают белки за счет уменьшения цепно-цепных взаимодействий и делая взаимодействия цепь-растворитель более благоприятными, упрощая энергетический ландшафт денатурированного состояния по сравнению с тем, что управляет конформационными ансамблями естественно развернутых белков. Из-за более простого энергетического ландшафта в денатурирующих условиях ожидается, что конфигурация белка будет более точно соответствовать предсказаниям простых теорий гомополимеров, чем естественное состояние, с возможными поправками на исключенный объем, внутреннее трение или глобальные поправки на качество растворителя.В большинстве исследований денатурации разворачивания белка используется конфокальный экспериментальный подход диффундирующего белка, потому что схемы поверхностной иммобилизации часто основываются на аффинности свернутых белков, таких как антитела или стрептавидин, а также стабильных липидных пузырьков.

3. Согласуются ли одиночные молекулы FRET и малоугловое рентгеновское рассеяние о размере белков с внутренними нарушениями?

Измерения молекулярного размера белков в высоких концентрациях денатуранта с использованием smFRET и методов рассеяния, таких как SAXS или SANS, хорошо согласуются, но smFRET обычно сообщает о уплотнении денатурированных белков при удалении денатуранта, что часто не наблюдается с помощью подходов SAXS / SANS [49,50 , 51,52].В одном известном эксперименте, пытающемся решить эту проблему, были применены как smFRET, так и SANS к молекуле полиэтиленгликоля с двойной меткой (PEG) [53]. Исследование PEG обнаружило такое же отклонение сигналов smFRET и SANS, наблюдаемое у большинства белков. Авторы охарактеризовали это исследование как отрицательный контроль, поскольку они предположили, что уплотнение ПЭГ при удалении денатурирующего агента не ожидается, хотя установлено, что и мочевина, и хлорид гуанидиния имеют благоприятные взаимодействия с ПЭГ [54] и могут влиять на конфигурацию ПЭГ в водном растворе [ 55].Таким образом, исследование PEG не дает результатов в качестве отрицательного контроля, если конфигурация PEG изменена денатурирующим средством. Несколько исследований белков в денатуранте исключили влияние денатуранта на показатель преломления растворителя, влияние на квантовый выход красителя, влияние вязкости на вращение красителя или спектральный сдвиг меток красителя [53,56]. Исследования малоуглового рентгеновского излучения или рассеяния нейтронов с мечеными и немечеными белками исключили уплотнение из-за наличия модификации красителя для отдельных случаев тестовых белков [57].Источник несоответствия при низкой концентрации денатуранта или естественных условиях для внутреннего беспорядка остается спорным. Разрешение несоответствия было предложено вывести из того факта, что оба метода требуют существенного моделирования, чтобы связать измеренные данные с оценкой характеристического параметра полимера. как радиус вращения [41,48,57,58]. smFRET требует предположения о модели ансамбля молекулярных конформаций (P (r)), тогда как SAXS / SANS требует моделей рассеяния.В частности, ряд групп пришли к различным выводам об источнике несоответствия между методами, применяемыми к денатурированным белкам или IDP, включая лежащую в основе гетерогенность в ансамблях за пределами случайных полимеров [57], недостаточность этих моделей [59,60, 61,62], или тонкое разделение точных величин, усредненных в двух методах измерения [41,48,57,58]. Тем не менее, эта тема остается предметом оживленных дискуссий, поскольку все более сложные подходы к моделированию и анализу данных сокращают наблюдаемые расхождения [63,64,65].Несмотря на систематическую разницу, определенную для размеров IDP в естественном состоянии, когда эти более сложные поправки не используются, как SAXS / SANS, так и smFRET могут быть очень эффективными в качестве инструментов для сообщения об относительных сдвигах в размере естественного состояния из-за биологически значимых изменений, таких как воздействие двухвалентные соли или посттрансляционные модификации белков. Для IDP PAGE4, который играет важную роль в раке простаты, радиус инерции (R _gyr) нефосфорилированного белка был определен равным 36.2 Å по SAXS и 34 Å по smFRET [66]. При фосфорилировании киназой CLK2 R _gyr увеличивался до 49,8 Å с помощью SAXS и до 43 Å с помощью smFRET [66]. Хотя smFRET дал систематически меньшую оценку R _gyr, тенденции в изменении при фосфорилировании такие же и могут быть полезны для качественной оценки воздействия на ансамбль IDP посттрансляционных модификаций. Способность SAXS и smFRET обнаруживать это изменение в PAGE4 иллюстрирует одно из самых мощных приложений smFRET, которое позволяет быстро сообщать об изменениях в поведении IDP при изучении их функций в сетях сигнализации.

5. Будущие направления

Наше понимание «нечеткой логики», с помощью которой ВПЛ регулируют биологические функции, быстро растет. Одним из наиболее интригующих открытий является способность IDP конденсироваться в разделенные по фазе домены внутри клеток и служить временными органеллами, лишенными структурных границ (также называемых безбелковыми безмембранными органеллами или PMLO), такими как ядрышки, обнаруженные в ядре [ 87,88,89,90]. Склонность ВПЛ к агрегации хорошо известна (в некоторых классических случаях способствует формированию патологических структур нитей, характерных для болезни Паркинсона или болезни Альцгеймера), но еще предстоит определить, как эти свойства ВПЛ могут быть использованы для фазового разделения и генерации их. безмембранные структуры органелл [90,91,92,93,94].Наше обсуждение здесь сосредоточено на роли IDP в клеточных сигнальных путях и уникальных возможностях, которые они предоставляют для взаимодействия с множеством партнеров для координации передачи сигнала. Объединение результатов, полученных с помощью различных методов, обеспечивает более полную картину молекулярной функции и перекрестную проверку smFRET с другими методами, включая ЯМР, EPR-DEER (электронный параметрический резонанс — двойной электронно-электронный резонанс), PRE (усиление парамагнитной релаксации) и SAXS позволит глубже понять феномен ВПЛ.Из-за различных диапазонов концентраций этих методов и разнообразия моделирования, необходимого для интерпретации экспериментальных результатов, становится все более очевидным, что моделирование молекулярной динамики (МД) будет иметь важное значение для полного понимания поведения и функции IDP в будущем. IDP представляют собой уникальные проблемы для моделирования МД, поскольку они чрезвычайно чувствительны к деталям используемого силового поля, а также требуют обширной выборки для характеристики ансамбля [95,96]. Недавние результаты показывают, что методы быстро развиваются, чтобы позволить моделирование MD предоставить понимание конформационной динамики IDP, совокупностей и функций ансамбля [41,46,52,57,86,97,98,99].Измерения FRET одной молекулы и ансамбля в сочетании с другими методами, включая методы ЯМР и ЭПР, предоставят ценные эталоны для тестирования и ограничения таких симуляций [41, 100, 101, 102, 103]. Понимание механистических деталей, которые влияют на пластичность IDP, и точная настройка связывания этих ансамблей с целью молекулы (некоторые даже остаются неупорядоченными, когда находятся в связанном состоянии [104]) потребуются, прежде чем систематические подходы к модуляции этих конформаций для инженерных результатов станут практическими.Тем не менее, уже есть некоторые намеки на успех терапевтического воздействия на IDPs в сигнальных путях с помощью небольших молекул для взаимодействия с неупорядоченными областями белков [2,105,106]. В недавнем примере было обнаружено, что малая молекула модифицирует взаимодействие между ДНК и фактором транскрипции TFIID таким образом, что предотвращает инициацию транскрипции РНК-полимеразой [2,106]. Успешное обнаружение smFRET у IDP внутри живых клеток млекопитающих [107,108] указывает на то, что smFRET может вскоре раскрыть детали координации IDP сигнальных путей и механистического воздействия таких терапевтических вмешательств в естественном клеточном контексте.По мере того, как наше понимание молекулярных механизмов, которые позволяют IDP координировать основные клеточные сигнальные пути, прогрессирует, обязательно последует разработка дополнительных вмешательств, чтобы попытаться модулировать эти пути.

Анализ флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET)

Мембранные белки составляют 1 / 4–1 / 3 от общего числа 30000 белков, кодируемых геномом человека.Мембранные белки играют важную роль в различных сложных и уникальных клеточных процессах, включая транспортировку материалов, распознавание клеток, иммунный ответ, передачу и регуляцию сигналов, а также передачу энергии, et.al . Почти 70% известных или исследуемых мишеней для лекарств — это мембранные белки. По-прежнему остается сложной задачей определение структур и выполнение функциональных анализов мембранных белков.

Creative Biostructure создал отличную сервисную платформу для преобразования генов мембранных белков в структуру, созданную группой опытных профессионалов.Наши услуги полного набора мембранных белков, включая экспрессию и очистку, кристаллизацию и определение, а также различные функциональные анализы как in vivo, и in vitro, , продвигают ваши научные исследования в ускоренном и динамичном темпе. Creative Biostructure может спроектировать и предоставить индивидуальный анализ Mempro ™ флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) или анализ FRET для функционального исследования взаимодействий мембранных белков.

Белковые взаимодействия имеют решающее значение для сигнальных сетей мембранных белков.Однако резонансный перенос энергии флуоресценции может иметь место только в том случае, если расстояние донор-акцептор не превышает 10 нм, что делает его очень мощным инструментом для обнаружения и определения взаимодействий с мембранными белками.

Анализ флуоресцентного резонансного переноса энергии ( FRET ), один из наиболее передовых и желаемых методов с широким диапазоном применения, выполняет анализы для прямого определения состояния олигомеризации и степени олигомеризации мембранных белков в их естественной среде.FRET — это зависящее от расстояния взаимодействие между флуоресцентными донорно-акцепторными парами в непосредственной близости, при котором энергия флуоресценции передается от возбужденного донора к подходящей молекуле акцептора без излучения. Эффективность FRET сильно зависит от расстояния донор-акцептор и от спектров перекрытия донорного излучения и возбуждения акцептора.

Рисунок 1. Схематический график фотофизического процесса FRET (Molecules, 2012)

FRET может иметь место только в том случае, если расстояние донор-акцептор не превышает 10 нм, что делает его очень мощным инструментом для обнаружения и определения взаимодействий мембранных белков.Creative Biostructure может предоставить платформу Mempro ™ FRET для выполнения специального структурного и функционального анализа мембранных белков.

• Mempro ™ FRET с индивидуальной парой донор-акцептор

Принимая во внимание большое влияние расстояния Форстера на FRET, Creative Biostructure может помочь вам выбрать оптимальную флуоресцентную пару донор-акцептор в соответствии с вашими особенностями требование исследования мембранного белка.

Таблица 1.Популярные донорно-акцепторные пары FRET и их фотофизические свойства.

Оптимальные условия для FRET:
1. Донорно-акцепторная пара должна находиться на близком расстоянии (обычно 1–10 нм).
2. Перекрытие спектра поглощения акцептора и спектра излучения донора.
3. Ориентация донора и акцептора должна быть примерно параллельна.

• Mempro ™ FRET для индивидуальных целей

FRET может обеспечить не только качественные измерения, но и количественные данные в исследованиях функции мембраны. Creative Biostructure разработала полный набор из методов FRET , таких как 1) Upconversion FRET , 2) Photochromic FRET , 3) Single-Molecule-FRET , и 4) FRET Frustration et. al . Creative Biostructure — ваш компетентный и профессиональный партнер в области научных исследований для выполнения всех видов FRET-приложений мембранных белков, включая ：
1. Структура и конформация мембранных белков,
2.Пространственное распределение мембранных белков,
3. Олигомеризация комплексов мембранных белков,
4. Мембранный белок участвует во взаимодействиях рецептор / лиганд,
5. Взаимодействие между мембранными липидами и мембранными белками.

Рисунок 2. Внутримолекулярный и межмолекулярный FRET (Current Opinion in Structural Biology, 2001)

Рисунок 3. Применение сигломолекулярного FRET (J. Am. Chem. Soc., 2013)

Рисунок 4. Измерение взаимодействия между мембранами белков, липидов и лигандов по FRET (PNAS, 2013)

• Mempro ™ FRET с индивидуальными подходами к визуализации

Компания Creative Biostructure разработала ряд методов для определения FRET.Как правило, мы предлагаем три индивидуальных подхода, которые оказались особенно полезными с практической точки зрения:
1. Фотообесцвечивание донора и акцептора
FRET можно создать путем доступа к скорости отбеливания донора в присутствии акцептора и без него. Основными двумя преимуществами этого подхода являются: относительно простота и простота реализации. Требуются соответствующие комплекты фильтров и мощный источник света, позволяющий отбеливать акцептор.
2. Сенсибилизированная эмиссия
Сенсибилизированная эмиссия — это самый простой метод обнаружения FRET, и наиболее идеальным условием для этого метода является полное разделение каналов донора и акцептора и отсутствие перекрестных помех между ними.
3. Флуоресцентная микроскопия с сохранением времени жизни. Creative Biostructure может определять точное пространственное расположение или распределение мембранных белков с высоким разрешением и специфичностью в живых клетках.

Creative Biostructure также предоставляет ряд услуг по функциональному анализу Mempro ™. Пожалуйста, свяжитесь с нами для получения подробного предложения.

Ссылки:
H. C. Ishikawa-Ankerhold, et al . (2012). Передовые методы флуоресцентной микроскопии — FRAP, FLIP, FLAP, FRET и FLIM. Молекулы , 1 7 (3): 4047-4132.
К. Чыонг и М. Икура. (2001). Использование микроскопии изображений FRET для обнаружения белок-белковых взаимодействий и изменений конформации белков in vivo. Текущее мнение в структурной биологии , 11 : 573-578.
W. Bae, и др. . (2013). Наблюдение в реальном времени за образованием множественных белковых комплексов с помощью одномолекулярного FRET. J. Am. Chem. Soc ., 135 (28): 10254-10257.
C. Matsushita, et al. . (2013). Ориентация трансмембранной спирали влияет на связывание с мембраной внутриклеточного юкстамембранного домена в пептидах рецептора Neu. Proc. Natl. Акад. Sci. США, 110 (5): 1646–1651.

Во-первых, давайте разберемся с терминологией. Когда мы говорим «лады», мы имеем в виду тонкие проволочные полоски, расположенные с очень точными интервалами по всей длине грифа; а не промежутки между тонкими проволочными полосками, в которых на самом деле проходят ваши пальцы, когда вы нажимаете на струны (или натягиваете их).

Лады нарезаются из проволоки для ладов, которая изготавливается в виде длинных рулонов и обычно изготавливается из нейзильбера, сплава, который на самом деле не содержит серебра. Анатомически лады состоят из закругленной «короны» (или «бусинки») поверх более тонкого «хвостовика» с зазубринами с обеих сторон, как видно в поперечном сечении. Отдельные лады обрезаются по ширине грифа гитары и забиваются (аккуратно постукивают, точнее) в пазы, предварительно вырезанные в грифе. Корона проходит на ширину прорези; хвостовик немного короче ширины прорези.Зубцы по обе стороны от хвостовика помогают удерживать лад в прорези, хотя также часто используется клей.

Основной производитель ладовой проволоки, калифорнийская компания Dunlop Manufacturing Inc., производит лады пяти основных размеров. Они перечислены по номеру детали, имени (если применимо), ширине и высоте короны, от наименьшего к наибольшему:

6230: Самая маленькая лада на грифах старых моделей Fender (.078 ″ x 0,043 ″).
6150: Винтажный джамбо. Намного шире, но не такой высокий, как 6230 (0,102 ″ x 0,042 ″).
6105: Современные узкие и высокие; в настоящее время очень популярны (0,090 ″ x 0,055 ″).
6100: Джамбо. Самая большая лада из доступных (0,110 ″ x 0,055 ″).
6130: Средний jumbo (0,106 x 0,036 дюйма).

Какой размер вам нравится, это вопрос ваших предпочтений, хотя он может повлиять на ваш стиль игры. Если вы хотите, чтобы ваши пальцы касались грифа при нажатии на струны, лады не такие высокие, как у 6130, 6150 или 6230.С другой стороны, лада jumbo 6100 может обеспечить более легкую игру с лучшим сустейном, тоном и изгибом, потому что вам не нужно нажимать так сильно, чтобы натянуть струны, но ваши пальцы, вероятно, даже не коснутся грифа, что может занять некоторые привыкают, если вы привыкли к меньшим ладам.

габаритные размеры, вес, двигатель, клиренс, расход топлива

Габаритные размеры Лада х рей Кросс: кузов, колеса, диски

Размер кузова

Интерьер, двигатель и колеса

Понравилась статья?

объем багажника. Размеры и сколько литров.

Багажник на Х Рей: характеристики и описание

Lada Xray багажник: много или мало?

Если все же мало?

Шины и диски для Lada XRAY Cross, размер колёс на Лада ХРАУ Сросс

Подбор шин и дисков по автомобилю Лада ХРАУ Сросс

Другие модели Lada

Параметры дисков на Лада ХРАУ Сросс

Параметры шин

Подбор шин и дисков для автомобиля Lada XRAY Cross

комплектации и цены от официального дилера

Кроссы и крест — Авторевю

Размеры шин и дисков для ВАЗ X-Ray

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Что сохраняется в файле cookie?

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Что сохраняется в файле cookie?

Динамическая структурная биология на основе FRET: проблемы, перспективы и призыв к практикам открытой науки

Рабочий процесс моделирования динамических структур по измерениям FRET.

Динамическая настройка FRET в биосенсоре зеленого флуоресцентного белка

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Кристаллическая структура Twitch-2B

Расчет эффективности FRET на основе структуры

ЯМР-исследование динамики биосенсора

Структурный дизайн мутанта с улучшенной эффективностью FRET

Конформационные ансамбли в решении

Влияние на улучшенную конструкцию датчика FRET

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клонирование, экспрессия и очистка Twitch-2B и Twitch-6

Флуоресцентная спектроскопия

Кристаллизация, сбор данных и определение структуры

Расчеты FRET

ЯМР-спектроскопия

Расчет парамагнитного тензора

Генерация ансамбля

Измерения SAXS

Биомолекул | Бесплатный полнотекстовый | Отдельная молекула FRET: мощный инструмент для изучения внутренне неупорядоченных белков

1. Введение

2. Как применить FRET одиночной молекулы к исследованиям белков с внутренне неупорядоченным строением

3. Согласуются ли одиночные молекулы FRET и малоугловое рентгеновское рассеяние о размере белков с внутренними нарушениями?

5. Будущие направления

Анализ флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET)

Анализ флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET)

Понимание размеров ладов — большие лады против средних джамбо против узких высоких

Добавить комментарий Отменить ответ