Какой двигатель стоит на лада х рей: Какие двигатели устанавливаются на Лада Х-рей? Фото, характеристики

Институт биофизики Университет

Джулия Надь

¹ Институт биофизики, Ульмский университет

Йенс Михаэлис

¹ Институт биофизики, Ульмский университет

¹ Институт биофизики, Ульмский университет

Abstract

Одномолекулярный резонансный перенос энергии Фёрстера (smFRET) можно использовать для получения структурной информации о биомолекулярных комплексах в реальном времени. Таким образом, несколько измерений smFRET используются для локализации неизвестного положения красителя внутри белкового комплекса посредством трилатерации. Для получения количественной информации система нанопозиционирования (NPS) использует вероятностный анализ данных для объединения структурной информации из рентгеновской кристаллографии с данными флуоресценции одиночных молекул для расчета не только наиболее вероятного положения, но и полного трехмерного распределения вероятностей. , названный апостериорным, что указывает на экспериментальную неопределенность.Эта концепция была обобщена для анализа сетей smFRET, содержащих множество молекул красителей. Последняя версия NPS, Fast-NPS, включает новый алгоритм, использующий оценку байесовских параметров на основе выборки методом Монте-Карло цепи Маркова и параллельного темперирования, что позволяет анализировать большие сети smFRET за сравнительно короткое время. Более того, Fast-NPS позволяет рассчитывать апостериор, выбирая одну из пяти различных моделей для каждого красителя, которые учитывают различное пространственное и ориентационное поведение, демонстрируемое молекулами красителя из-за их локального окружения.

Здесь мы представляем подробный протокол для получения данных smFRET и применения Fast-NPS. Мы предоставляем подробные инструкции по получению трех входных параметров Fast-NPS: значений smFRET, а также квантового выхода и анизотропии молекул красителя. Недавно NPS был использован для выяснения архитектуры архейного открытого промоторного комплекса. Эти данные используются для демонстрации влияния пяти различных моделей красителей на апостериорное распределение.

Ключевые слова: Биохимия, Выпуск 120, Система нанопозиционирования, Fast-NPS, флуоресценция одиночных молекул, резонансный перенос энергии Фёрстера одиночных молекул, структурная биология

Введение

Определение структуры биомолекулы является ключевым условием для понимания его функции.Два хорошо зарекомендовавших себя метода определения структуры — криоэлектронная микроскопия и рентгеновская кристаллография1,2. Сегодня оба метода предоставляют структурную информацию с высоким разрешением и разрешением вплоть до ангстрема. Эти два метода широко используются для выяснения структуры больших биомолекул, таких как белковые комплексы. Хотя существующие методы постоянно совершенствовались на протяжении последних десятилетий, сложность биологических структур по-прежнему представляет собой серьезную проблему для структурной биологии, особенно при исследовании больших, динамических и переходных комплексов3.

Чтобы изучить динамику макромолекулярных комплексов и, в частности, взаимосвязь между структурой и функцией, методики изучения отдельных молекул предоставили полезную информацию4. Было разработано несколько новых стратегий, обеспечивающих ортогональный подход к получению структурной и динамической информации. Примерами являются высокоскоростной AFM5, механическое манипулирование6, флуоресцентная микроскопия локализации7, а также одномолекулярный резонансный перенос энергии Ферстера (smFRET) 8,9. С самого начала FRET был назван молекулярной линейкой из-за зависимости расстояния от масштаба биомакромолекул10.

Одним из особенно интересных приложений smFRET является использование информации о расстоянии, полученной из измерений smFRET, для вывода структурной информации11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23. Благодаря высокому временному разрешению smFRET положение мобильных частей белковой структуры может быть локализовано. Однако, чтобы извлечь количественную информацию из данных smFRET, во время измерения необходимо определить важные поправочные параметры о молекулах красителя24. С этими поправочными коэффициентами эффективность FRET E _FRET может быть рассчитана по формуле

,

, где I _A и I _D — интенсивности флуоресценции молекулы донора и акцептора. соответственно (см. Рисунок 2 ).Β-фактор учитывает перекрестные помехи, утечку излучения донора в канал акцептора и рассчитывается по формуле

, где I ‘ _A и I’ _D — интенсивности флуоресценции донора и молекула-акцептор после фотообесцвечивания молекулы-акцептора.

γ-фактор корректирует разницу в относительной эффективности обнаружения в двух каналах, а также разницу в квантовом выходе флуоресценции донорного и акцепторного красителей.Он рассчитывается по каждому индивидуальному временному графику с помощью

. Обратите внимание, что это описание не учитывает прямое возбуждение акцепторной молекулы, которое иногда становится важным и также требует корректировки. Для определения этих поправочных коэффициентов полезно возбуждать как донор, так и акцептор по чередующейся схеме25, чтобы различать фотофизические изменения и структурную динамику.

Для получения не только количественной эффективности smFRET, но и количественной структурной информации, в 2008 году была введена система нанопозиционирования (NPS).Название было выбрано на основе его сходства со спутниковой системой глобального позиционирования (GPS). NPS — это гибридный метод, объединяющий данные smFRET и рентгеновской кристаллографии для локализации неизвестных положений красителя в биомакромолекулярных комплексах. Кристаллическая структура служит опорным кадром, а результаты smFRET используются для получения информации о расстоянии между неизвестным положением флуорофора (антенна , ) и положением, известным из кристаллической структуры (спутник , ).В последовательных экспериментах измеряются расстояния между антенной и несколькими спутниками, и положение антенны определяется с помощью статистически строгой схемы анализа, основанной на оценке байесовских параметров. В результате вычисляется не только наиболее вероятное положение антенны, но и ее полное трехмерное распределение неопределенности, так называемое апостериорное, визуализируемое с помощью достоверных объемов. Кроме того, NPS был расширен, чтобы обеспечить возможность анализа полных сетей smFRET27.

NPS использовался для решения ряда важных вопросов в эукариотической транскрипции, а именно пути восходящей ДНК, нематричной ДНК и возникающей мРНК в комплексе элонгации РНК-полимеразы II12,28, также демонстрируя эффект факторы инициации транскрипции26 и динамическая архитектура открытого промоторного комплекса29.Более того, NPS использовали для выяснения структуры открытого комплекса РНК-полимеразы архей 30 и, в частности, положения фактора инициации транскрипции TFE, который конкурентно связывается с тем же сайтом, что и фактор элонгации транскрипции Spt4 / 531.

С тех пор было опубликовано несколько структурных подходов на основе smFRET15,18,21,23. При сравнении различных структурных методов на основе smFRET становится ясно, что кажущаяся точность метода сильно зависит от конкретного выбора моделей красителя.Следует отметить, что молекулы красителя могут демонстрировать различное пространственное и ориентационное поведение в зависимости от их локального окружения.

С этой целью был введен Fast-NPS32. Fast-NPS использует усовершенствованный алгоритм выборки, значительно сокращающий время вычислений. Кроме того, Fast-NPS позволяет выполнять структурный анализ, и для каждой молекулы красителя пользователь может выбрать из набора из пяти различных моделей красителя, которые будут описаны ниже. Самая консервативная модель, получившая название classic , предполагает, что краситель занимает только одну, но неизвестную позицию.В этом положении флуорофор может свободно вращаться внутри конуса, размер которого определяется его соответствующей (зависящей от времени) анизотропией флуоресценции. Ориентация конуса неизвестна, что приводит к большой погрешности при преобразовании измеренной эффективности smFRET в расстояния. В этом отношении модель консервативна, так как она дает наименьшую точность по сравнению с другими моделями красителей. Только для очень коротких расстояний допущения, сделанные классической моделью, должны приводить к заметно неправильному определению местоположения.Для типичных значений smFRET правильная позиция всегда заключена в сравнительно большой достоверный объем.

Однако, поскольку желательна более высокая точность, важно разработать и испытать альтернативные модели красителей, которые могут помочь повысить точность. Если краситель вращается намного быстрее, чем время его собственной флуоресценции, можно применить так называемую модель iso . Здесь коэффициент ориентации κ ² (необходимый для расчета характеристического изотропного радиуса Ферстера

) установлен равным 2/3.В результате рассчитанные достоверные объемы почти на два порядка меньше, чем в классической модели32. В случае, если флуорофор находится в среде, которая обеспечивает не только быструю переориентацию, но и дополнительное быстрое движение во всем доступном объеме, следует использовать модель meanpos-iso . В этой модели краситель фактически занимает только одно среднее положение, где пространственное усреднение учитывается путем преобразования полиномиального расстояния15. Эта модель применима, например, если (обычно гидрофобный) краситель прикреплен к гидрофильной области, e.г., ДНК. Применение модели meanpos-iso приводит к дальнейшему уменьшению размера достоверных объемов примерно в два раза. Однако краситель, связанный с белком, может обратимо связываться с несколькими гидрофобными участками в своем стерически доступном объеме (AV). Флуорофор, который мгновенно переключается между этими областями, но внутри одной области подвергается свободному вращению и быстрому локализованному движению, лучше всего описывается моделью var-meanpos-iso . Для аналогичной ситуации, в которой краситель не может свободно вращаться, применяется модель var-meanpos .Более подробную информацию об этих моделях можно найти в нашей недавней публикации32.

Эти модели обладают обширным репертуаром, специально предназначенным для учета различных сред, с которыми может столкнуться краситель, и их разумное применение оптимизирует точность его локализации. В Fast-NPS каждая молекула красителя, прикрепленная к определенному положению, может быть отнесена к отдельной модели, так что партнерам FRET разрешено иметь разные модели. Это обеспечивает безграничное моделирование, приближенное к природе. Однако важно проводить строгие статистические тесты, чтобы гарантировать, что результат, полученный с помощью окончательной комбинации моделей, по-прежнему согласуется с экспериментальными данными.Эти тесты включены в программное обеспечение Fast-NPS.

Чтобы применить Fast-NPS к экспериментальным данным, требуется измерение (только) трех входных параметров. Во-первых, необходимо определить изотропные радиусы Фёрстера для каждой пары красителей (

). Следовательно, необходимо измерять квантовый выход (QY) донорного красителя, спектры излучения донорной флуоресценции и спектры поглощения акцептора. Эти измерения можно проводить в большом количестве, используя стандартный спектрометр и стандартный флуоресцентный спектрометр.Для каждой пары затем вычисляется R ₀ с помощью бесплатного программного обеспечения PhotochemCAD и может использоваться в анализе NPS. Более того, (разрешенная во времени) анизотропия флуоресценции молекул красителя должна быть получена с использованием поляризационного (и временного) флуоресцентного спектрометра. Однако наиболее важными входными параметрами для Fast-NPS являются эффективности smFRET, измеренные на установке для флуоресцентной микроскопии одиночных молекул, такой как флуоресцентный микроскоп полного внутреннего отражения (TIRFM).

Здесь мы представляем пошаговый протокол для получения данных smFRET и применения Fast-NPS (, рис. 1, ).

Протокол

1. Предварительные условия и лабораторное оборудование

ПРИМЕЧАНИЕ: Сборка измерительной камеры изображена на Рис. 3 . Сэндвич-конструкция измерительной камеры состоит из трех основных компонентов: предметного стекла из кварцевого стекла (плавленого кварца), герметизирующей пленки и покровного стекла, закрывающего проточную камеру. Измерительная камера устанавливается на специальный держатель образца.Размеры камеры для образцов и металлического держателя соответствуют стандартному предметному стеклу из кварцевого стекла для микроскопии (76 мм x 26 мм).

1. Вырежьте предметные стекла из кварцевого стекла с помощью алмазного сверла (0,75 мм) в положениях, указанных на Рисунок 4 . Конструкция слайдов из кварцевого стекла асимметрична, чтобы различать две стороны каждого слайда. ПРИМЕЧАНИЕ. Кварцевые предметные стекла можно использовать повторно после измерения до появления царапин на поверхности.

2. Для установки камер используйте индивидуальные металлические держатели образцов, как показано на Рисунок 5 .Держатели образцов имеют две резьбы (M4) для соединения впускной и выпускной трубок для проточной камеры. Кроме того, используйте резьбу (M3), чтобы установить камеру для образца на металлический держатель, а также резьбу (M3), чтобы закрепить держатель призмы на нижней половине металлического держателя.

3. Выполните измерения smFRET на флуоресцентном микроскопе полного внутреннего отражения призменного типа (TIRFM) (, рис. 6, ). ПРИМЕЧАНИЕ: TIRFM включает три лазера: зеленый (532 нм, Nd: YAG-лазер) и красный лазер (643 нм, диодный лазер) для возбуждения донорных и акцепторных молекул красителя, а также синий лазер (491 нм. , твердотельный лазер с диодной накачкой) для обесцвечивания фоновых флуоресцентных примесей на камере для образца перед измерением smFRET.Три лазерных луча пространственно объединены и могут быть выбраны с помощью акустооптического перестраиваемого фильтра (AOTF). Флуоресцентный свет собирается объективом с высокой апертурой, разделяется на донорный и акцепторный каналы с помощью дихроичного зеркала и проецируется на две камеры EM-CCD. Камера для образца прикреплена к микрометрическому столику, позволяющему перемещаться в направлениях x и y с помощью двух шаговых двигателей. Третий пьезодвигатель используется вместе с ИК-лазером и позиционно-чувствительным детектором для создания системы автоматической фокусировки, обеспечивающей оптимальную фокусировку на протяжении всего эксперимента.

   1. Используйте переменное лазерное возбуждение (ALEX), когда наблюдается динамика временных траекторий FRET ²⁵ . Такая динамика может быть вызвана либо конформационными изменениями внутри молекул, либо флуктуациями яркости акцептора и мерцанием акцептора. ПРИМЕЧАНИЕ: ALEX позволяет различать эти две возможные причины и предотвращает неправильную интерпретацию динамических траекторий FRET. Однако из соображений простоты протокольная часть ограничивается анализом фильмов, снятых без ALEX.Внимание: лазеры класса 3B используются в установке флуоресценции одиночных молекул. Перед запуском системы убедитесь, что приняты соответствующие меры безопасности при работе с лазером в соответствии с постановлениями местного правительства.

4. Выполните измерение поглощения, используемое для определения квантового выхода на спектрометре UV-VIS (см. Материалы и методы).

5. Выполните измерение спектра излучения донорной флуоресценции, спектра поглощения акцептора и анизотропии флуоресценции на флуоресцентном спектрометре (см. Материалы и методы).

6. Подготовьте камеры для проб в соответствии с опубликованными процедурами 33. В качестве альтернативы можно использовать процедуру, описанную в [34].

7. Пометьте исследуемые образцы парой молекул донорно-акцепторного красителя, подходящей для smFRET, и убедитесь, что на поверхности камеры для образцов имеется фрагмент биотина для иммобилизации. ПРИМЕЧАНИЕ. Чтобы локализовать неизвестное положение красителя антенны с помощью программного обеспечения Fast-NPS, необходимы различные образцы конструкций. Каждая конструкция должна иметь одну метку в неизвестном положении окраски антенны и одну метку в спутниковой позиции, известной из кристаллической структуры.Для получения точных результатов требуются по крайней мере три различных конструкции с красителями, прикрепленными к позиции антенны, и три различных позиции спутника. Измерения между антеннами, а также между спутниками также полезны для повышения точности, однако для этого требуется обмен молекулами красителя, который необходимо правильно ввести в анализ.

2. Установка проточных камер в специальный держатель

1. Протяните силиконовую трубку (внутренний диаметр 0,8 мм, внешний диаметр 2,4 мм) в полые винты с выступом (M4) и обрежьте трубку с обоих концов прямо, оставив выступ 1 см с обеих сторон острым лезвием бритвы.Отрегулируйте выступ трубки примерно на 2 мм с одной стороны винта с выступом.

2. Установите проточную камеру в держатель образца таким образом, чтобы отверстия в предметном стекле из кварцевого стекла совпадали с резьбой держателя образца. Осторожно затяните впускные и выпускные винты, чтобы убедиться, что вход и выход камеры для пробы по-прежнему проницаемы. Осторожно затяните четыре винта держателя акрилового стекла, чтобы зафиксировать положение проточной камеры.

3. Обрезанная силиконовая трубка (0.58 мм ВД, 0,96 мм ВД) на куски длиной 20 см. Вставьте одну из частей во входной и выходной винт измерительной камеры. Закройте впускной и выпускной трубопровод с помощью зажима. ПРИМЕЧАНИЕ. Собранные камеры для проб можно хранить при комнатной температуре до двух недель.

3. Измерение smFRET на микроскопе TIRF

1. Используйте шприц, чтобы промыть камеру для образца 500 мкл PBS. Постоянно предотвращайте попадание пузырьков воздуха в камеру для образцов, создавая каплю на конце впускной трубки перед переходом на другой буферный раствор.

2. Промойте камеру для образцов раствором 100 мкл нейтравидина (0,5 мг / мл в PBS) и инкубируйте 15 мин при комнатной температуре.

3. Промойте раствор нейтравидина 500 мкл PBS.

4. Навинтите металлический держатель призмы на камеру для образца.

5. Установите камеру для образца на микрометрический столик TIRF-микроскопа. Убедитесь, что камера для образцов установлена ​​горизонтально как можно прямо перед объективом, чтобы избежать расфокусировки во время сканирования.

6. Запустите программное обеспечение для управления камерами EM-CCD и программное обеспечение для управления пьезодвигателями сцены.

7. Отрегулируйте фокусировку объектива микроскопа, глядя на отражение ИК-лазера.

8. Поместите призму (PS991, n = 1,52) поверх металлического держателя призмы. Отрегулируйте боковое положение призмы, чтобы лазерные лучи попадали на призму, затем используйте клей и инкубируйте с УФ-светом в течение 5 мин.ПРИМЕЧАНИЕ. Установленную призму можно повторно использовать после очистки.

9. В программном обеспечении управления камерой нажмите «Настройка сбора данных» и определите следующие параметры сбора данных: время интеграции 100 мс, 401 кадр / видеоролик (зеленая камера), 400 кадров / видеоролик (красная камера), коэффициент усиления электронного умножителя 225, предварительный — усиление 5x и скорость считывания 3 МГц при 14 битах.

10. Создайте папку на локальном жестком диске для измерения. Выберите желаемое имя для файлов измерений, e.грамм. , год-месяц-день. В настройках программы зайдите в райдер «Автосохранение», включите «Автосохранение» и выберите формат файла * .sif для получения фильма. Выберите папку на жестком диске. Используйте имя папки как файл.

11. Включите функцию «Автоинкремент» (установите начальное значение на 1). Включите привязку оператора к имени файла. Используйте «ДОН» и «АСС» для донорного и акцепторного каналов соответственно. Выберите «_» в качестве разделителя.

12. В программном обеспечении управления камерой нажмите «Видео», чтобы начать прямое изображение с камеры и обесцветить фоновую флуоресценцию путем сканирования камеры для образца с использованием максимальной интенсивности лазера всех трех лазеров (вместе ≈ 3000 Вт / см ² для 10 с на поле зрения).

13. Выключите синий лазер. Уменьшите интенсивность зеленого лазера примерно до 200 Вт / см ² и примерно до 40 мВт / см ² для красного лазера, если используется переменное лазерное возбуждение (ALEX).

14. Разбавьте биотинилированный флуоресцентный образец до концентрации 50–100 пМ. Загрузите 100 мкл раствора. При связывании образец иммобилизуется на поверхности камеры. ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы не перегружать камеру. Соседние молекулы должны быть отделены друг от друга.

15. При необходимости загрузите в камеру дополнительные 100 мкл пробы, в 2 раза более концентрированной.

16. Закройте впускную и выпускную трубки измерительной камеры зажимами после завершения загрузки.

17. Выключите все лазеры и используйте пьезодвигатели для перемещения проточной камеры на два поля зрения дальше.

18. В программном обеспечении управления камерой щелкните «Take signal», чтобы начать запись видео и одновременно включить лазер.Убедитесь, что к концу пленки обесцвечивается более 80% молекул, регулируя мощность лазера.

19. Повторите шаги 3.17 и 3.18 для всей области предварительно обесцвеченной камеры для образца.

4. Получение карты трансформации («beadmap»)

1. Подготовьте проточную камеру, как описано в разделах 1.1, 1.2 и 2.

2. Используйте флуоресцентные мультиспектральные шарики, покрытые авидином, которые показывают флуоресцентное излучение в донорный и акцепторный каналы.Вихревую смесь в течение 1 мин, затем разбавьте 50 мкл смеси в 50 мкл ddH ₂ O. Снова встряхните в течение 1 мин, обработайте ультразвуком 1-2 мин, затем встряхните еще 10 сек.

3. Выполните шаги, описанные для измерений smFRET (Раздел 3.5–3.10).

4. Загрузите 100 мкл (1 объем камеры) разбавленных 1: 2 флуоресцентных шариков в проточную камеру. Подождите 10 минут, чтобы флуоресцентные шарики связались с поверхностью.

5. Используйте параметры сбора данных в 3.9, но измените длину видеоролика на 26 (зеленая камера) и 25 (красная камера), а коэффициент усиления электронного умножителя на 10.

6. Установите интенсивность зеленого лазера на значение 20 Вт / см ² .

7. Сделайте один видеоролик в поле зрения примерно с 50-100 бусин.

5. Обработка и анализ данных smFRET

1. Используйте специально написанное программное обеспечение SM FRET для анализа диаграммы направленности (см. Материалы и методы) и полученных фильмов. Запустите программу viewPlot1.m.

2. Щелкните «Анализ» | «Анализ партии», снимите флажок «ALEX», если он не использовался.Для лучшей производительности выберите «высокий» порог нахождения пика. Нажимаем «ОК».

3. Выберите «НЕТ», когда вас спросят, анализировалась ли карта уже. Просмотрите папку, содержащую полученный beadmap, и выберите файл * .sif (дважды щелкнув по нему). В следующем диалоговом окне нажмите «ОК». ПРИМЕЧАНИЕ. Если диаграмма направленности уже была проанализирована в ходе предыдущего измерения, выберите здесь «ДА» и выберите сохраненную карту разбивки, перейдя в нужную папку и дважды щелкнув файл карты схемы * .map.Продолжите с шага 5.8.

4. Выберите два одиночных шарика, расположенных в противоположных углах поля зрения. Интенсивность пикселей имеет цветовую кодировку от темно-синего (низкая интенсивность) до темно-красного (высокая интенсивность).

5. Щелкните по центру первой бусинки. Если центр молекулы можно четко определить по цветовой кодировке, выберите «ДА» или нажмите «НЕТ» и выберите другую пару молекул.

6. Поместите перекрестие на пиксель, показывающий максимальную интенсивность, и нажмите «СОХРАНИТЬ».Повторите процесс со вторым каналом.

7. Щелкните по молекуле в противоположном углу и повторите шаги 5.5 и 5.6. ПРИМЕЧАНИЕ. Относительный сдвиг пикселей двух каналов отображается в командном окне, и карта преобразования автоматически сохраняется как файл * .map в папку, содержащую файл beadmap * .sif.

8. Чтобы загрузить донорские и акцепторные фильмы (* .sif) для «пакетного анализа», перейдите в папку, выберите все фильмы, которые должны быть проанализированы, и нажмите «OK».В следующем диалоговом окне нажмите «ОК». ПРИМЕЧАНИЕ. Пакетный анализ завершен, когда последняя полоса, отображаемая в командном окне, начинается с «Завершенный анализ…». Обнаруженные молекулы отображаются в новом окне, в котором также указывается относительный сдвиг донорного и акцепторного каналов, определенный из карты трансформации.

9. Чтобы загрузить пакетные файлы фильмов, щелкните Файл | Загрузить. Снимите отметку с опции «ALEX», если она не использовалась. Установите гладкость на 10 и нажмите «ОК».Выберите папку, содержащую файлы * .ttr, и нажмите «выбрать все» и «ОК» в следующем контекстном меню.

10. Если отображаемая кривая имеет характерные фазы smFRET ( Рисунок 2 ), нажмите кнопку переключения «Не выбрано» и сначала выберите момент времени начала события FRET, перемещая линию с помощью курсора мыши и щелкнув левой кнопкой мыши. Затем выберите момент времени обесцвечивания молекулы-акцептора и, наконец, момент времени обесцвечивания молекулы-донора.

11. В следующем окне эффективность FRET отображается синим цветом. Чтобы выбрать график, нажмите кнопку «Да», в противном случае выберите «Нет». Чтобы повторно получить доступ к временной шкале, нажмите кнопку «Назад».

12. Повторяйте процедуру до последней молекулы фильма.

13. После анализа последней молекулы в фильме сохраните выбранные следы, нажав «Файл | Сохранить». Сохраните выбранные трассы в той же папке, что и файлы * .sif.

14. Повторите шаги 5.10-5,13 за все приобретенные фильмы.

15. Выполнить программу comb_fret_results.m . Выберите папку, содержащую файлы * .res и все файлы * .FRETonly_trace. Сохраните молекулярные файлы FRET и FRET как файлы MW.dat и FRW.dat соответственно. ПРИМЕЧАНИЕ. Файлы * .dat сохраняются как файлы ASCII. Файл FRW.dat содержит шесть столбцов и одну строку для каждого кадра FRET. Шестой столбец содержит скорректированную покадровую эффективность FRET. Файл MW.dat содержит 21 столбец и одну строку для каждой выбранной молекулы FRET.Третий столбец содержит молекулярную эффективность FRET.

6. Отображение данных smFRET в гистограммах

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы извлечь среднюю эффективность smFRET всех записанных данных smFRET, покадровые данные или данные по молекулам наносятся на гистограммы и анализируются с использованием гауссовских аппроксимаций для ( множественные) пики. Далее протокол использует коммерческое программное обеспечение для анализа данных (см. Список материалов). Однако вместо этого можно использовать любое другое доступное программное обеспечение.

1. Откройте программное обеспечение для анализа данных (см. Список материалов). Щелкните File | Import | multiple ASCII. Выберите папку, содержащую файл FRW.dat. Выберите файл и нажмите «ОК». Подтвердите вариант ввода нажатием «ОК» без изменений.

2. Выберите третий столбец C (Y), содержащий исправленные значения эффективности FRET, щелкните столбец правой кнопкой мыши и выберите «График | Статистика | Гистограмма». В окне гистограммы дважды щелкните столбцы, снимите флажок «автоматическое разбиение» и выберите желаемый размер интервала e.грамм. , 0,05. Также выберите начальное и конечное значения, , например, -0,025 и 1,025.

3. Выберите столбцы гистограммы, щелкнув по ним левой кнопкой мыши. Затем щелкните правой кнопкой мыши и выберите «Перейти к рабочему листу корзины». Выберите столбец «Количество», щелкнув его левой кнопкой мыши, а затем щелкните правой кнопкой мыши и выберите «График | Столбец / столбец / круговая диаграмма | Столбец».

4. На столбчатой ​​диаграмме перейдите в диалоговое окно Анализ | Подгонка | Подгонка нелинейной кривой | Открыть. Выберите «Гауссиан» в разделе «Функция», затем перейдите к набору «Параметры».Отмените выбор автоматической инициализации параметров. Зафиксируйте значение смещения (y0) на 0. Нажмите «Подогнать». ПРИМЕЧАНИЕ. Функция подгонки, а также детали подгонки теперь отображаются на столбчатой ​​диаграмме. Значение «xc» дает центр функции соответствия, , то есть — средний КПД FRET, который служит входным параметром для программного обеспечения NPS.

7. Измерение квантового выхода

1. Выполните определение квантового выхода относительным методом, аналогичным процедуре, описанной Würth et al. 35, используя в качестве стандарта родамин 101, растворенный в этаноле (QY = 91,5%).

2. Запишите спектры поглощения на спектрометре UV-VIS, используя объем 80 мкл в абсорбционной кювете с длиной пути 1 см. Поглощение на длине волны, которая будет использоваться для возбуждения флуоресценции, должно быть ≤ 0,05.

3. Запишите спектры излучения на спектрометре с ламповой калибровкой, работающем в режиме счета фотонов. Выполните измерения с поляризаторами Глана-Томпсона в возбуждении (0 °) и эмиссии (54.7 °) (условия магического угла) с использованием спектральной ширины полосы около 5 нм и 2,5 нм для монохроматора возбуждения и излучения соответственно. Измерьте образцы после их переноса во флюоресцентную кювету с длиной пути 3 мм, следя за тем, чтобы скорость счета не превышала 10 ⁶ с ^-1 .

   1. Рассчитайте квантовый выход согласно

, где n и n _Std — показатели преломления растворителя образца и стандарта соответственно.f (λ) и f_Std (λ) — интенсивности флуоресценции образца и стандарта на длине волны λ. A (λ _от ) и A ^std (λ _от ) — это оптическая плотность образца и эталона на длине волны возбуждения, а Φ _std — квантовый выход стандарта.

8. Расчет изотропного радиуса Ферстера

1. Рассчитайте изотропный радиус Ферстера (

   ) из ​​спектра излучения молекулы донора, спектра поглощения молекулы акцептора, квантового выхода донора и показателя преломления среды.Используйте бесплатную программу PhotochemCAD для расчета

   . Однако вместо этого можно использовать любое другое доступное программное обеспечение36.

9. Измерение анизотропии

1. Определите стационарную анизотропию флуоресценции по записям спектров флуоресценции с различными настройками поляризатора возбуждения / излучения (V / V, V / H, H / V, H / H) 36 .

2. Рассчитайте G-фактор, который корректирует артефакты поляризации прибора, для каждой длины волны из отношения

и используйте его для вычисления значения анизотропии для каждой длины волны:

, где I _xy указывает интенсивность для поляризации возбуждения x и поляризации излучения y .

1. Усредните значения по спектральному диапазону излучения для расчета анизотропии стационарной флуоресценции.

10. Установка программного обеспечения Fast-NPS

1. Загрузите UCSF Chimera с http://www.cgl.ucsf.edu/chimera и следуйте инструкциям по установке.

2. Перейдите на сайт «Института биофизики» при Ульмском университете: https://www.uni-ulm.de/en/nawi/institute-of-biophysics/software.html. Загрузите текущую версию Fast-NPS и распакуйте ее в любую папку.Откройте подпапку «Распространяемый компонент» и установите распространяемый пакет Visual C ++, который подходит для системы.

11. Центрирование файла pdb

1. Откройте интересующие файлы pdb в Chimera. Выберите все атомы макромолекулярного комплекса и вычислите координаты центроида (Инструменты | Анализ структуры | Оси / Плоскости / Центроиды | Определить центроид… | Хорошо).

2. Откройте журнал ответов (Избранное | Журнал ответов) и инструмент преобразования (Инструменты | Движение | Трансформировать координаты).Введите координаты центроида, показанного в журнале ответов, в текстовое поле «Сдвиг» окна преобразования координат и измените знак каждой координаты. Нажмите «Применить» и сохраните файл с помощью «Сохранить PDB» (Файл | Сохранить PDB).

12. Настройка приоритетных позиций

ПРИМЕЧАНИЕ. Все значения указаны в ангстремах.

1. Запустите язык технических вычислений и измените текущую папку на локальную папку Fast-NPS. Введите в командном окне: FastNPS.

2. Создайте новый файл вакансии в Менеджере проектов (Проект | Новый).

3. Установите предыдущую позицию (Инструменты | Модель красителя до).

4. В панели «предыдущие основы» определите пространственное разрешение предыдущей позиции, введя ее значение (рекомендуется 2).

5. Исключите внутреннюю часть макромолекулы, установив флажок и нажав кнопку «загрузить PDB». Выберите и загрузите центрированный файл PDB, как описано в Разделе 11.

6. Укажите приблизительный диаметр (рекомендуется 13 Å, см. Обсуждение) красителя, указав его значение.

7. Введите расстояние скелетонизации, , т. Е. расстояние, на которое молекула красителя может проникнуть в макромолекулу (рекомендуется 2 Å).

8. В панели «Максимальный предыдущий размер» введите минимальные и максимальные координаты предыдущей позиции (рекомендуется: x в [-150,150], y в [-150,150] и z в [-150,150]).

9. При определении сателлита активируйте флажок «присоединение через гибкий линкер» на панели «предыдущие основы» и введите в панель «линкер» координаты атома (в центрированном файле pdb), в котором находится молекула красителя. прилагается.Далее укажите длину и диаметр линкера, введя их значения (рекомендуются 13 Å и 4,5 Å, см. Обсуждение). В случае антенны пропустите этот пункт.

10. Нажать кнопку «рассчитать доступный объем».

11. Сохраните предыдущее положение и при необходимости экспортируйте его для целей визуализации с помощью такого программного обеспечения, как Chimera.

13. Определение сетевой геометрии

1. Откройте окно определения измерений (Режим | Редактировать геометрию).

2. Создайте новую молекулу красителя, нажав кнопку «Новый» в панели «Красители».

3. Задайте анизотропию флуоресценции (Раздел 9), введя значение и выбрав модель красителя в раскрывающемся меню «Модель красителя».

4. Нажмите кнопку «Загрузить», выберите соответствующую позицию и установите флажок активировать краситель. Повторите эту процедуру для всех красителей, , то есть для всех антенн, а также для всех спутников.

5. После создания всех красителей определите размеры.Создайте новое измерение, нажав «Создать» на панели «Измерения».

6. Выберите партнеров FRET в раскрывающихся меню «Dye1» и «Dye2» ниже.

7. Введите эффективность smFRET с ошибкой и изотропный радиус Ферстера этой пары красителей.

8. Наконец, отметьте флажок активации измерения. Повторите эту процедуру для всех измерений. ПРИМЕЧАНИЕ. Часто сеть становится все более сложной, так что пользователь может запутаться.Во избежание ошибок проверьте сеть визуально, нажав кнопку «Проверить сеть». На рисунке показаны активированные красители и измерения с помощью линий, соединяющих красители FRET.

14. Расчет

1. Откройте окно расчета (Режим | Расчет).

2. Если каждому красителю в сети назначена определенная модель, выберите «Определено пользователем» и запустите расчет, нажав «Расчет». Чтобы использовать все красители в одной модели, выберите одну из пяти моделей (классическая, iso, meanpos-iso, var-meanpos-iso и var-meanpos) и продолжайте.ПРИМЕЧАНИЕ. В командном окне будет отображаться ход расчета. Fast-NPS сделает это во всплывающем сообщении, когда расчет будет завершен.

15. Визуализация результатов

1. Чтобы экспортировать достоверные объемы красителей, откройте окно просмотра результатов (Модель | Просмотр результатов).

2. Экспортные плотности красителей:

   1. Экспортные красители по отдельности или все одновременно. Чтобы экспортировать отдельный краситель, выберите его в панели «Отображаемые красители» и нажмите «Экспорт плотности».Введите разрешение (рекомендуется 2) и выберите тип файла для экспорта. Справа отображается плотность и некоторые ее математические характеристики.

   2. Чтобы экспортировать все красители одновременно, нажмите «Пакетный экспорт».

3. Откройте полученные файлы плотности в Chimera.

16. Проверка согласованности выбранной комбинации моделей

1. Откройте окно просмотра результатов (Модель | Просмотр результатов).Если на панели «Информация о расчетах» в текстовом поле «Согласованность» отображается значение ниже 90%, текущая модель не отражает в достаточной степени измеренную эффективность smFRET и, таким образом, является несовместимой.

2. В случае несоответствия нажмите кнопку «Детальная согласованность». Найдите измерения со значением ниже 90%. Если в этих измерениях преимущественно задействованы один или несколько красителей, их модели могут вызвать несоответствие. Рассмотрите различные модели красителей для этих красителей и повторно запустите расчет Fast-NPS.

Типичные результаты

Транскрипция — это первый шаг в экспрессии генов у всех организмов. У архей транскрипция осуществляется одной РНК-полимеразой (РНКП). По сравнению с эукариотами, RNAP архей имеет поразительное структурное сходство со своими эукариотическими аналогами, но при этом имеет более простой механизм транскрипции. Таким образом, археи можно использовать в качестве модельной системы для изучения инициации транскрипции эукариот с помощью РНК-полимеразы II (Pol II). Недавно полная архитектура открытого комплекса РНК-полимеразы архей была определена из одномолекулярных FRET и NPS.Данные анализа NPS были использованы для построения модели полного открытого промоторного комплекса архей, которая дает полезные сведения о механизме инициации транскрипции.

Чтобы выяснить эту структуру, была измерена эффективность smFRET между неизвестными молекулами антенного красителя, расположенными внутри открытого промоторного комплекса, и несколькими известными молекулами красителя-сателлита, которые были включены в пять ссылочных сайтов в RNAP, положения которых известны из кристаллографических структур (pdb-ID). : 2WAQ) 37.Антенные красители были прикреплены к любому из различных положений нематричной ДНК, TFB, TBP или TFE. Полная сеть, использованная в этом исследовании, состояла из более чем 60 измеренных расстояний.

Рисунок 7 изображает модель полного комплекса открытого промотора архей, построенного на основе анализа NPS. Он состоит из двухцепочечной промоторной ДНК (светлый и темно-синий), РНК-полимеразы (серый) и факторов инициации транскрипции TBP (фиолетовый), TFB (зеленый) и TFE (желтый).Модель накладывается на результаты анализа NPS, достоверные объемы, которые были рассчитаны с использованием классической модели (A), модели iso (B), модели meanpos-iso (C), модели var-meanpos-iso. (D) и модель var-meanpos (E).

Рисунок 1: Рабочий процесс сбора и обработки параметров, необходимых для расчета Fast-NPS. Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Примерная временная диаграмма интенсивности флуоресценции для события smFRET. Интенсивности флуоресценции донора (зеленый) и молекулы акцептора (красный), показывающие три характерные фазы, а именно: I: smFRET, II: флуоресценция донора после фотообесцвечивания акцептора, III: фоновая флуоресценция после фотообесцвечивания донора. Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Схематическое изображение проточной камеры для экспериментов smFRET. Проточная камера устанавливается на индивидуальный металлический держатель с держателями из акрилового стекла.Сэндвич-конструкция проточной камеры включает предметное стекло из кварцевого стекла (плавленого кварца) с двумя отверстиями для присоединения впускной и выпускной трубок, герметизирующую пленку и покровное стекло, закрывающее проточную камеру. Призма для освещения TIRF устанавливается на нижнюю половину проточной камеры. Полые винты с язычком обеспечивают вход и выход для проточной камеры. Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Подготовка предметного стекла из кварцевого стекла и герметизирующей пленки. Механический чертеж предметного стекла из кварцевого стекла с указанием положения отверстий (в миллиметрах). Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Механический чертеж проточной камеры. Размеры алюминиевого держателя призмы, держателя акрилового стекла и алюминиевой монтажной рамы указаны в миллиметрах. Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рис. 6: Схематическое изображение призменной установки TIRF, используемой для экспериментов smFRET. Сокращения для обозначения оптических компонентов: A — диафрагма; DM — дихроичное зеркало; F, эмиссионный фильтр; L, линза; М, зеркало; О, объективный; П — призма; PSD, позиционно-чувствительный фотодиод; S, образец; PS, этап позиционирования; Т, телескоп. Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7: Результаты моделирования различных допущений модели. Все изображения показывают полимеразу РНК архей (pdb-ID: 2WAQ, вид сверху) вместе с моделью промоторной ДНК (тДНК и нтДНК синим и голубым соответственно), TBP (фиолетовый), TFB (зеленый) и TFE (желтый). ) в археологическом открытом комплексе 30.Надежные объемы накладываются на результаты моделирования NPS ( A ) классической модели, ( B ) iso-модели, ( C ) meanpos-iso модели, ( D ) var-meanpos- iso и ( E ) модель var-meanpos. Все объемы показаны с достоверностью 68%. Классическая сеть и сеть var-meanpos согласуются с данными smFRET. Напротив, сети, в которых для всех красителей выбрана модель iso, meanpos-iso или var-meanpos-iso, не соответствуют измеренным данным.Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Мы представляем установку и экспериментальную процедуру для точного определения эффективности FRET между красителями, прикрепленными через гибкие линкеры к биомакромолекулам, , то есть , нуклеиновым кислотам и / или белкам.

Для обеспечения точных измерений smFRET (Раздел 3) очень важно исключить воздух из проточной камеры в любой момент во время измерения. Кроме того, следите за тем, чтобы не перегружать проточную камеру флуорофорами.Флуорофоры должны быть четко разделены для обеспечения правильного анализа. Поскольку пары smFRET, которые не показывают обесцвечивание донора, должны быть исключены из анализа, убедитесь, что> 80% молекул в поле зрения обесцвечиваются в конце фильма. Чтобы учесть неоднородности в образце, β-фактор и γ-фактор, корректирующие перекрестные помехи и относительную эффективность обнаружения донорного и акцепторного каналов, соответственно, рассчитываются для каждой пары FRET отдельно.

Настройки камеры (время интегрирования, коэффициент усиления электронного умножителя, коэффициент усиления предварительного усилителя и скорость считывания, описанные в разделе 3.9) должны быть установлены на значения, обеспечивающие наилучший компромисс между отношением сигнал / шум, динамическим диапазоном и временным разрешением. Их необходимо перенастроить для разных экспериментов или при использовании другого оборудования. Количество кадров должно быть достаточно большим, чтобы обеспечить обесцвечивание большинства донорных молекул в течение времени наблюдения.

Для измерений на флуоресцентном спектрометре (разделы с 7 по 9) должен быть найден хороший компромисс между интенсивностью сигнала и спектральным разрешением записанных данных.С этой целью щели на пути возбуждения и излучения флуоресцентного спектрометра должны быть адаптированы в зависимости от используемого инструмента и концентрации образца.

Кроме того, мы представляем метод анализа Fast-NPS для получения структурной информации о переходных или динамических макромолекулярных комплексах. NPS был применен для выявления пути нематричной цепи ДНК и положения факторов инициации транскрипции в открытом комплексе архейной РНК-полимеразы. Используя сеть из более чем 60 различных измерений расстояний, мы показали, что Fast-NPS, оснащенный недавно реализованным механизмом отбора проб (Eilert, T., Beckers, M., Drechsler, F., & Michaelis, J. в стадии подготовки), сокращает время, необходимое для анализа этой сложной сети smFRET, примерно на 2 порядка по сравнению с исходным глобальным методом NPS27. Надежность алгоритма основана на сэмплере «Метрополис внутри Гиббса» в сочетании с параллельной схемой темперирования. Fast-NPS показывает точную воспроизводимость сетевых результатов и согласуется с результатами, опубликованными ранее30.

Было опубликовано несколько различных методов, нацеленных на вывод структурной информации из измерений smFRET11,12,13,14,15,16,17,18.Все эти подходы обеспечивают только одну конкретную модель красителя. Таким образом, красители, которые не соответствуют предположениям, сделанным соответствующей моделью, не могут быть использованы или приводят к ложной структурной информации. Fast-NPS, напротив, позволяет подбирать для каждой молекулы красителя отдельную модель. Это помогает учесть различное конформационное поведение как самой молекулы красителя, так и линкера, используемого для ее прикрепления. Локальное молекулярное окружение молекулы красителя, а также ее физические свойства будут определять, какая модель является наиболее подходящей.

Для анализируемой сети smFRET комплекса инициации архей изотропное предположение для всех молекул красителя приводит к резкому уменьшению размера вероятных объемов по сравнению с классической моделью. В сочетании с динамическим усреднением положения для всех молекул красителя медиана всех вероятных размеров объема (при 95%) уменьшается до менее 0,5 нм ³ . Однако эти задние молекулы красителя больше не согласуются с их измерениями smFRET, указывая на то, что сделанные предположения приводят к ложной структурной информации.Напротив, апостериорные уровни, определенные в классической модели, согласуются с определенной эффективностью smFRET.

Поскольку предположение об изотропном и / или динамическом усреднении положения для всех красителей приводит к несоответствиям, Fast-NPS позволяет использовать априорные молекулы красителя, в которых каждому красителю может быть назначена одна из пяти моделей. В каждой модели используется один и тот же доступный объем. Алгоритм расчета АВ красителя делает несколько предположений. Сначала пространственная форма флуорофора аппроксимируется сферой.Таким образом, следует использовать диаметр, учитывающий ширину, высоту и толщину флуорофора (раздел 12). Далее форма линкера аппроксимируется гибким стержнем. Значения, представленные в разделе 12, были вычислены для красителя Alexa 647, присоединенного через линкер 12-C. На сегодняшний день невозможно точно определить априори, какая модель наиболее подходит, учитывая геометрию эксперимента, и поэтому все модели должны быть протестированы. Как правило, выбирают модель, которая дает наименьший возможный апостериорный размер, но при этом согласуется с данными.Чтобы проверить, согласуется ли выбор моделей с данными smFRET, мы вычисляем как апостериорную, так и вероятность. Согласованность означает, что более 90% образцов, собранных в апостериорной области, находятся в пределах 95% доверительного интервала правдоподобия.

Хотя верно, что чем ниже анизотропия, тем меньше неопределенность расстояния, в сети smFRET также необходимо учитывать геометрическое расположение молекул красителя. Таким образом, хотя представление молекул красителя с низкой анизотропией флуоресценции с помощью изомодели является типичным первым выбором, тест на консистенцию предоставляет более прямые средства для выбора правильной модели красителя.Оптимальный выбор моделей красителей может привести к резкому увеличению точности локализации и в то же время сохранить согласованность сети с ее данными FRET.

Таким образом, Fast-NPS позволяет получать структурную и динамическую информацию о крупных макромолекулярных комплексах. В отличие от обычных структурных методов, таких как рентгеновская кристаллография или криоэлектронная микроскопия, это позволяет отслеживать очень гибкие или переходные комплексы, что значительно расширяет наше понимание механизмов сложных биологических процессов.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы благодарят Б. Грюхманна за механические чертежи проточной камеры. Кроме того, мы хотим выразить нашу благодарность Максу Бекерсу и Флориану Дрекслеру за содержательные комментарии и обсуждения, касающиеся NPS и лежащего в основе механизма выборки.

Ссылки

• Ченг Ю. Крио-ЭМ одиночных частиц с кристаллографическим разрешением. Клетка. 2015; 161: 450–457.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Гарман Э. Ф. Разработки в области рентгеноструктурного определения структуры биологических макромолекул. Наука. 2014. 343 (6175): 1102–1108. [PubMed] [Google Scholar]
• Сали А. Итоги первого семинара рабочей группы по гибридным / интеграционным методам wwPDB. Состав. 2015; 23: 1156–1167. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Хопфнер К.П., Михаэлис Дж. Механизмы транслоказ нуклеиновых кислот: уроки структурной биологии и биофизики одиночных молекул.Curr Opin Struct Biol. 2007; 17: 87–95. [PubMed] [Google Scholar]
• Андо Т., Учихаши Т., Кодера Н. Высокоскоростной АСМ и приложения к биомолекулярным системам. Анну Рев Биофиз. 2013; 42: 393–414. [PubMed] [Google Scholar]
• Нойман К.К.С., Надь А. Силовая спектроскопия одиночных молекул: оптический пинцет, магнитный пинцет и атомно-силовая микроскопия. Нат методы. 2008; 5: 491–505. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Йилдиз А. Миозин V ходит из рук в руки: визуализация одного флуорофора с помощью 1.5-нм локализация. Наука. 2003. 300 (5628): 2061–2065. [PubMed] [Google Scholar]
• Джу К., Бальчи Х, Ишицука Ю., Бураначай С., Ха Т. Достижения в методах флуоресценции одиночных молекул для молекулярной биологии. Анну Рев Биохим. 2008. 77 (1): 51–76. [PubMed] [Google Scholar]
• Hohlbein J, Craggs TD, Cordes T. Возбуждение переменного лазера: FRET одной молекулы и не только. Chem Soc Rev.2014; 43 (4): 1156–1171. [PubMed] [Google Scholar]
• Страйер Л., Хаугланд Р.П. Передача энергии: спектроскопическая линейка.Proc Natl Acad Sci U S. A. 1967; 58 (2): 719–726. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Rasnik I, Myong S, Cheng W., Lohman TM, Ha T. Ориентация связывания ДНК и конформация домена мономера Helicase Rep E. coli, связанного с частичным дуплексным соединением : Одномолекулярные исследования флуоресцентно меченых ферментов. J Mol Biol. 2004. 336 (2): 395–408. [PubMed] [Google Scholar]
• Андрека Дж. Одномолекулярное отслеживание мРНК, выходящей из РНК-полимеразы II. Proc Natl Acad Sci U S A.2008. 105 (1): 135–140. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Шредер Г.Ф., Грубмюллер Х. FRETsg: Построение модели биомолекулярной структуры на основе нескольких экспериментов FRET. Comput Phys Commun. 2004. 158 (3): 150–157. [Google Scholar]
• Маргиттай М. Одномолекулярный резонансный перенос энергии флуоресценции обнаруживает динамическое равновесие между закрытой и открытой конформациями синтаксина 1. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2003; 100 (26): 15516–15521. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Калинин С.Набор инструментов и эталонное исследование для высокоточного структурного моделирования с ограничениями FRET. Нат методы. 2012. 9 (12): 1218–1227. [PubMed] [Google Scholar]
• Choi J. N6-метиладенозин в мРНК нарушает отбор тРНК и динамику удлинения трансляции. Nat Struct Mol Biol. 2015; 23 (август 2015): 110–115. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Свенссон Б. Трилатерация зондов, связанных с функциональными рианодиновыми рецепторами, на основе FRET. Biophys J. 2014; 107 (9): 2037–2048. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Стивенсон Дж. Д., Кеньон Дж. К., Симмонс М. Ф., Lever AML.Характеристика трехмерной структуры РНК с помощью одиночной молекулы FRET. Методы. 2016. С. 1–11.
• Ли Н.К. Точные измерения FRET в одиночных диффундирующих биомолекулах с использованием переменного лазерного возбуждения. Биофиз Дж. 2005; 88 (4): 2939–2953. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• McCann JJ, Choi UB, Zheng L, Weninger K, Bowen ME. Оптимизация методов восстановления абсолютной эффективности FRET от иммобилизованных одиночных молекул. Биофиз Дж. 2010; 99 (3): 961–970. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Brunger AT, Strop P, Vrljic M, Chu S, Weninger KR.Трехмерное молекулярное моделирование с помощью FRET одной молекулы. J Struct Biol. 2011; 173: 497–505. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Schuler B. Одномолекулярный FRET структуры и динамики белка — праймер. J нанобоитехнология. 2013; 11 (Приложение 1): 1–17. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Choi UB. Одномолекулярная модель слитого комплекса синаптотагмин 1-SNARE, полученная из FRET. Nat Struct Mol Biol. 2010. 17 (3): 318–324. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Dale RE, Eisinger J, Blumberg WE.Ориентационная свобода молекулярных зондов. Фактор ориентации при внутримолекулярном переносе энергии. Биофиз Дж. 1979; 26 (2): 161–193. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Kapanidis AN. Переменное лазерное возбуждение одиночных молекул. Acc Chem Res. 2005. 38 (7): 523–533. [PubMed] [Google Scholar]
• Muschielok A. Система нанопозиционирования для анализа структуры макромолекул. Нат методы. 2008. 5 (11): 965–971. [PubMed] [Google Scholar]
• Muschielok A, Michaelis J.Применение системы нанопозиционирования для анализа сетей резонансной передачи энергии флуоресценции. J. Phys Chem B. 2011; 115 (41): 11927–11937. [PubMed] [Google Scholar]
• Andrecka J. Система нано-позиционирования выявляет ход восходящей и неэлементной ДНК внутри комплекса элонгации РНК-полимеразы II. Nucleic Acids Res. 2009. 37 (17): 5803–5809. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Трейтлейн Б. Динамическая архитектура комплекса открытого промотора с минимальной РНК-полимеразой II.Mol Cell. 2012. 46 (2): 136–146. [PubMed] [Google Scholar]
• Надь Дж. Полная архитектура открытого комплекса РНК-полимеразы архей из одной молекулы. FRET и NPS. Nat Commun. 2015; 6: 6161. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Grohmann D, et al. Фактор инициации TFE и фактор элонгации Spt4 / 5 конкурируют за зажим RNAP во время инициации и удлинения транскрипции. Mol Cell. 2011. 43 (2): 263–274. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Beckers M, Drechsler F, Eilert T, Nagy J, Michaelis J.Количественная структурная информация из FRET одной молекулы. Фарадей Обсуди. 2015; 184: 117–129. [PubMed] [Google Scholar]
• Беннинк М.Л. Разворачивание отдельных нуклеосом путем растягивания отдельных волокон хроматина с помощью оптического пинцета. Nat Struct Biol. 2001. 8 (7): 606–610. [PubMed] [Google Scholar]
• Chandradoss SD. Пассивация поверхности для исследования одномолекулярных белков. J Vis Exp. 2014. с. e50549. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
• Würth C, Grabolle M, Pauli J, Spieles M, Resch-Genger U.Относительное и абсолютное определение квантовых выходов флуоресценции прозрачных образцов. Nat Protoc. 2013. 8 (8): 1535–1550. [PubMed] [Google Scholar]
• Lakowicz JR. Принципы флуоресцентной спектроскопии. Бостон, Массачусетс: Springer США; 2006. [Google Scholar]
• Корхин Ю. Эволюция сложных РНК-полимераз: Полная структура РНК-полимеразы архей. PLoS Biol. 2009; 7 (5) [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

Роль диффузии ориентации и разделения флуорофора в наблюдаемых сдвигах эффективности FRET

Abstract

Резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET) — это широко используемый метод одиночных молекул для измерения наноразмерных расстояний от изменений безызлучательного переноса энергии между донорными и акцепторными флуорофорами.Для макромолекул и комплексов эта наблюдаемая эффективность переноса используется для вывода изменений в молекулярной конформации в различных экспериментальных условиях. Однако иногда наблюдаются сдвиги в эффективности FRET даже при наличии убедительных экспериментальных доказательств того, что конформационное состояние молекулы не изменилось. Мы исследуем пути, по которым такие расхождения могут возникнуть из-за кинетических эффектов. Мы показываем, что значительные сдвиги могут возникнуть из-за взаимодействия между кинетикой возбуждения, ориентационной диффузией флуорофоров, разделительной диффузией флуорофоров и неизлучающим тушением.

Образец цитирования: Wallace B, Atzberger PJ (2017) Фёрстеровский резонансный перенос энергии: роль диффузии ориентации и разделения флуорофора в наблюдаемых сдвигах эффективности FRET. PLoS ONE 12 (5): e0177122. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122

Редактор: Sabato D’Auria, Consiglio Nazionale delle Ricerche, ИТАЛИЯ

Поступила: 15.11.2016; Принят в печать: 21 апреля 2017 г .; Опубликован: 19 мая 2017 г.

Авторские права: © 2017 Wallace, Atzberger.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все данные, использованные в исследовании, представлены непосредственно в документе.

Финансирование: Эта работа была поддержана карьерным грантом Национального научного фонда 0956210, Национальным научным фондом: Отделение математических наук 1616353 (www.nsf.gov) и CM4 DESC0009254 Министерства энергетики США (http://science.energy.gov/ascr/).

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

1 Введение

Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET) — широко используемый метод измерения одиночных молекул для измерения расстояний внутри и между молекулами [1, 2]. FRET основан на безызлучательной передаче энергии между возбужденной молекулой донора и молекулой акцептора.Ферстер разработал теорию безызлучательного переноса, основанную на диполь-дипольных взаимодействиях [1, 3]. Для расстояния разноса R теория Ферстера предсказывает масштабирование эффективности передачи энергии как ∼ ( R / R ₀ ) ⁻⁶ . На практике обычно R ₀ ∼ 1 нм [1–3]. Экспериментальная реализация с использованием FRET в качестве «спектроскопической линейки» для измерения расстояний внутри отдельных молекул была введена в экспериментах Страйера и Хогланда в 1960-х годах [2, 4, 5].С этого времени FRET продолжала развиваться и стала универсальным инструментом, широко используемым в биологических науках и биотехнологиях [6–10].

В биологических науках FRET используется для сообщения о межбелковых взаимодействиях [11, 12]. На уровне одной молекулы FRET использовался для измерения расстояний между метками при характеристике структур и динамики макромолекул, включая РНК, ДНК, белки и их молекулярные комплексы [6, 13-15]. Измерения FRET, зависящие от времени, были разработаны для характеристики кинетики реакции ферментов [6, 16–18], взаимодействий лиганд-рецептор [7, 19–21], конформационной динамики белков [13, 22, 23] и движения молекул моторные белки [24, 25].

Многие типы молекул могут быть использованы для образования пары акцептор-донор в FRET. Некоторые молекулы обладают фотофизикой, которая приводит к тушению без излучения при взаимодействии с окружающими химическими частицами или внутримолекулярными химическими группами [26–30]. Это дает возможность использовать зонды FRET для сообщения о локальной концентрации химических веществ, таких как ионы металлов [26, 31] в воде или ионы Ca ⁺ , высвобождаемые во время нейрональной активности [15]. В развивающейся биотехнологии FRET также используется для разработки новых типов высокоточных сенсоров для обнаружения одиночных молекул и высокопроизводительных анализов для скрининга [7, 8, 20].

В однопарном FRET (spFRET) одна пара акцепторных и донорных молекул используется для измерения внутримолекулярных расстояний [4]. Чтобы охарактеризовать различные молекулярные конформационные состояния или гетерогенные состояния субпопуляций, ратиометрический анализ используется для оценки эффективности переноса E [18, 32]. При повторных измерениях это обычно отображается в виде гистограммы значений эффективности E . В различных экспериментальных условиях, таких как введение денатуранта, сдвиги в наблюдаемой гистограмме эффективности интерпретируются как изменения в конформационном состоянии молекулы [6, 14, 23, 33].В недавних экспериментах Lipman et al. [34, 35], было замечено, что в некоторых ситуациях такие сдвиги FRET могут происходить, даже когда нет явных изменений в конформационном состоянии. Это открытие подтверждается экспериментами, в которых рентгеновское рассеяние молекул указывает на отсутствие конформационных изменений или вовлеченная молекулярная структура по своей природе жесткая, такая как полипролиновая цепь [34, 35]. Прецедент такого изменения эффективности обусловлен свойствами среды. Эксперименты, подобные тем, что были выполнены Жангом, Фу, Лаковичем и другими [36, 37], демонстрируют, что присутствие посторонних частиц (в частности, серебра в их исследованиях) может влиять на донорно-акцепторное взаимодействие.Более того, результаты Макарова и Плакско [38] предполагают, что для гибкого полимера не только конформационное состояние, но и сквозная кинетика могут влиять на наблюдаемую эффективность FRET.

Это представляет собой важный вопрос характеристики того, как могут происходить сдвиги в эффективности FRET при очевидном отсутствии каких-либо изменений в конформационном состоянии. Мы исследуем с помощью теории и стохастического моделирования роль, которую играет кинетика возбуждения, ориентационная диффузия флуорофоров, разделительная диффузия флуорофоров и неизлучающее тушение.Наши результаты нацелены на количественную оценку величины этих эффектов и помочь определить режимы, в которых эти факторы могут повлиять на экспериментальные измерения.

2 Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET)

2.1 Эффективность передачи

КПД FRET — это доля энергии, которая без излучения передается от донора к молекуле акцептора. Первоначально предполагается, что энергия может быть испущена только как донорный фотон или без излучения передана акцептору, чтобы в конечном итоге испускаться как акцепторный фотон.В этом случае эффективность переноса связана со скоростями испускания фотонов донора и акцептора κ _A и κ _D как (1) Мы проиллюстрируем процесс донорно-акцепторного переноса на рис. 1.

Рис. 1. Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET).

Молекула-донор возбуждается до более высокого энергетического состояния адсорбированным фотоном. Донор возвращается в свое основное состояние, испуская фотон или передавая энергию молекуле акцептора.Возбужденное состояние акцепторной молекулы релаксирует за счет испускания фотонов. Показаны два широко используемых донорно-акцепторных красителя Cy 3 и Cy 5.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122.g001

Для некоторых систем может быть важно учитывать также дополнительные фотохимические состояния, как в [39, 40], или передачу энергии от столкновений с другими молекулами. в растворе, что приводит к безизлучающему тушению [28–30]. Мы рассмотрим некоторые из этих эффектов в следующих разделах.

Теория Ферстера предсказывает, что скорость безызлучательного переноса κ _T зависит от расстояния разделения донор-акцептор R как (2) Это основано на диполь-дипольных взаимодействиях и разделительных расстояниях, меньших длины волны излучающего фотона [1–3]. τ _D = 1/ κ _D обозначает среднее время жизни возбужденного состояния донора в отсутствие акцептора.Характерное расстояние Ферстера R ₀ зависит от фотофизики молекул донора и акцептора через (3) N _A — это число Авогодроса, κ ² — фактор, связанный с относительной ориентацией диполь-диполей донор-акцептор [5, 41], Φ _D — квантовый выход флуоресценция донора при отсутствии акцептора, J — интеграл перекрытия, связанный со спектром адсорбции донора и акцептора, n — показатель преломления.Более подробно см. [1–3, 5, 10, 42].

Когда вся переданная энергия немедленно испускается как акцепторный фотон, мы имеем κ _A = κ _T . Тогда зависимость эффективности FRET от расстояния может быть выражена как (4) Теория Фёрстера имеет важную полезность, заключающуюся в том, что расстояние между донорами и акцепторами R может быть определено из наблюдений E . Для получения R ₀ требуется только принципиальное знание некоторых свойств фотофизики донорных и акцепторных молекул.Это позволяет использовать FRET как эффективную линейку наноразмеров для молекулярных систем [4, 23, 24, 27, 43].

2.2 Однопарный FRET для молекул, диффундирующих в свободном растворе

Чтобы получить измерения отдельных молекул для свободно диффундирующих молекул, донор обычно возбуждается, ожидая, пока отдельная молекула диффундирует в фокус лазерного луча [6, 18, 23, 24]. Когда молекула находится в области, достаточно близкой к фокальной точке лазера (в пределах фокального объема), донор возбуждается с высокой вероятностью, и происходит последовательность эмиссии донорных и акцепторных фотонов, см. Рис. 2.За время нахождения молекулы в фокальном объеме можно подсчитать количество обнаруженных донорных и акцепторных фотонов n _D , n _A . Это позволяет сделать пропорционально-метрическую оценку эффективности переноса как [18, 32] (5) Эти экспериментальные данные по эффективности FRET затем обычно объединяются для формирования гистограммы наблюдаемых эффективностей передачи энергии E . Мы отмечаем, что на практике существует ряд важных соображений для таких экспериментов, таких как разработка критериев того, когда такая последовательность излучений должна считаться значительным событием FRET или когда есть короткие длительности в фокусном объеме или дробовой шум. .

Рис. 2. Одномолекулярное событие FRET.

Событие FRET начинается, когда молекула, помеченная парой донора и акцептора, диффундирует в объем достаточно большой лазерной интенсивности вблизи фокальной точки (слева). Подсчет зарегистрированного излучения фотонов для акцептора n _A и донора n _D регистрируется до тех пор, пока молекула не диффундирует из фокального объема (вверху справа). Во время возбуждения донора либо испускается фотон, либо энергия безызлучательно передается акцептору и испускается со скоростью, зависящей от конформации молекулы (внизу справа).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122.g002

Гистограмма эффективности дает характеристику относительных пропорций различных конформационных состояний или субпопуляций молекул, встречающихся во время измерения. Для случая гомогенных молекул в одном и том же конформационном состоянии ожидается, что гистограмма эффективности покажет узкий пик вокруг характеристической эффективности FRET, соответствующей донарно-акцепторному разделению конформации.Тогда естественно рассматривать изменения в конформационном состоянии молекулы, ища сдвиги в местоположении пика на гистограмме FRET. Это широко используется в экспериментальной практике для характеристики биомолекулярных систем [6, 13, 14, 22].

Однако в недавних экспериментах Lipman et al. [34, 35], было обнаружено, что при некоторых обстоятельствах может происходить значительный сдвиг в гистограмме эффективности FRET, в то время как нет явного изменения в конформационном состоянии. Мы используем теорию и стохастическое моделирование, чтобы исследовать роль кинетики.Сначала мы исследуем роль вращательной и поступательной диффузии флуорофоров на шкале времени кинетики возбуждения донорных и акцепторных молекул. Затем мы рассмотрим роль дополнительных эффектов, таких как тушение без излучения.

3 Важность донорно-акцепторной кинетики

3.1 Донорно-акцепторное возбуждение и релаксация

Мы рассматриваем роль кинетики донорного и акцепторного возбуждения, переноса энергии и релаксации. Мы моделируем событие возбуждения донора как происходящее со скоростью κ _D = 1/ τ _D . τ _D — среднее время жизни возбуждения донора в отсутствие акцептора. Молекула-донор в возбужденном состоянии либо релаксирует, испуская фотон со скоростью κ _D , либо передавая энергию молекуле-акцептору со скоростью κ _T в соответствии с уравнением (2) . Подчеркнем, что на практике тариф κ _T зависит от ряда факторов.Это включает расстояние R между донором и акцептором. Это также зависит от относительной ориентации донора и акцептора, которая фиксируется членом κ ² в уравнении (3).

Мы исследуем, как такая зависимость передачи энергии от конфигурации донора и акцептора конкурирует с другими кинетиками возбуждения и релаксации. Для этого мы разрабатываем стохастическую модель кинетики возбуждения-релаксации и проводим моделирование вращательной и поступательной диффузии акцепторных и донорных молекул.Мы исследуем влияние этих эффектов на эффективную κ _T и наблюдаемую эффективность передачи FRET E .

3.2 Донорно-акцепторная ориентационная диффузия

Взаимная ориентация дипольных моментов молекул донора и акцептора может существенно влиять на эффективность передачи энергии [5, 41, 42, 44, 45]. Это видно из фактора κ ² , который вносит вклад в уравнение (3). Фактор κ определяется формулой [5, 41, 42] (6) Символы и обозначают единичные векторы, представляющие ориентацию дипольных моментов акцепторных и донорных молекул.Указывает единичный вектор разделения, указывающий от донора к акцептору.

Вклады от эффектов ориентации часто аппроксимируются усреднением в предположении, что ориентация быстро распространяется изотропно в масштабе времени, намного превышающем время возбуждения донора. Часто используется усредненный фактор ориентации 〈 κ ² 〉 = 2/3, [41, 42]. Однако во многих ситуациях ориентационная диффузия может быть сопоставима с временной шкалой возбуждений или, исходя из стерики молекулярного уровня, она может не быть изотропной выборкой всех ориентаций [12, 41, 44, 46].Кроме того, даже для быстрой диффузии экспериментальные измерения часто включают небольшую выборку значений κ ² , которые могут находиться в диапазоне от 0 до 4. Это выборка из распределения с нерегулярными и асимметричными характеристиками, см. Рис. 3.

Рис. 3. Распределение фактора ориентации κ ² .

Показаны случайные ориентации акцептора-донора для κ ² , которые распределены между 0 и 4. Распределение показывает хорошо известный касп при κ ² = 1 (см. Вставку).Большая часть распределения находится между κ ² = 0 и κ ² = 1 со значительным смещением в сторону κ ² = 0. Гистограмма была построена из 10 ⁷ случайных ориентаций красителя. пары.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122.g003

Мы исследуем роль диффузии ориентации и ее роль в наблюдаемой эффективности FRET, приводящей к возможным сдвигам. Поскольку важен только относительный угол между донором и акцептором, мы можем моделировать вращательную диффузию броуновским движением по поверхности сферы [47].Это может быть выражено в сферических координатах случайным процессом (7) D _R обозначает коэффициент диффузии на поверхности, а ρ — радиус сферы. Уравнения следует интерпретировать в смысле исчисления Ито [48, 49]. Символы и обозначают независимые броуновские движения. Для сферы радиусом ρ конфигурация, связанная со сферическими координатами (Θ _t , Φ _t ), должна интерпретироваться в картосовых координатах как X _t = ρ sin (Θ _t ) cos (Φ _t ), Y _t = ρ sin (Θ _t ) sin (Φ _t ) , и Z _t = ρ cos (Θ _t ).

Мы выполняем моделирование путем численного вычисления временных шагов, приближающих стохастический процесс в уравнении (7). Это достигается путем проецирования броуновского движения на поверхность сферы. В частности, мы используем пошаговую процедуру по времени (8) (9) Генерируется на каждом шаге как трехмерная гауссова случайная величина с независимыми компонентами, имеющими нулевое среднее значение и единицу дисперсии. Мы отмечаем, что этот подход позволяет избежать осложнений, связанных со сферическими координатами, поскольку избегает необходимости переключать карты координат, когда конфигурации приближаются к вырождениям вблизи полюсов сферы [50].

Мы характеризуем временной масштаб вращательной диффузии как τ _R = 4 π ² ρ ² / D _R . Мы используем для красителя длину ρ = 1 нм и окружность сферы 2 πρ . Окружность сферы служит опорной шкалой длины для шкалы времени диффузии τ _R . Мы проводим стохастическое моделирование с использованием этих параметров с шагом по времени не более Δ t = τ _R /500.

Мы рассматриваем случай, когда акцептор и донор могут свободно вращаться, но удерживаются на фиксированном расстоянии R . Возьмем R = R ₀ , так что для идеального усреднения по всем конфигурациям ориентации эффективность передачи составляет E = 0,5. Рассмотрим динамику вращения относительно времени жизни возбуждения донора, характеризуемую величиной τ _D / τ _R .

Мы рассматриваем как быструю вращательную диффузию, где большинство конфигураций хорошо отбираются за время жизни донора τ _D / τ _R ≫ 1, так и медленную вращательную диффузию, где только очень ограниченное подмножество конфигураций отбираются за время жизни донора τ _D / τ _R ≪ 1. Для медленной вращательной диффузии мы обнаруживаем, что ограниченная выборка в течение времени жизни донора может привести к значительным сдвигам наблюдаемого FRET перенести E в сторону более низкой эффективности, см. рис. 4.

Рис. 4. Вращательная диффузия и сдвиги в эффективности передачи FRET E .

Сверху вниз красители с уменьшающейся вращательной диффузией, имеющие характерные времена диффузии τ _R / τ _D = 19,5, 97,5, 195,0, 975. Средние значения эффективности в каждом случае соответственно равны E = 0,486, E = 0,456, E = 0,438 и E = 0,403. Сдвиг средней эффективности от самой медленной к самой быстрой рассмотренной диффузии составляет около 20%.Примечательной особенностью уменьшения коэффициента диффузии является то, что распределение наблюдаемых значений эффективности расширяется. Контрольный КПД E ₀ = 0,5 обозначен красной линией.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122.g004

Все конфигурации ориентации одинаково вероятны, и коэффициент κ ² линейно влияет на эффективность переноса в уравнении (3). Как следствие, проявленный сдвиг является результатом чисто кинетических эффектов.В частности, для наиболее быстрой вращательной диффузии донор и акцептор имеют больше возможностей занять ориентацию, благоприятную для передачи энергии. Другими словами, когда диффузия велика, донор и акцептор успевают диффундировать, чтобы встретить конфигурации, которые находятся в «золотом пятне», имеющем наибольшие шансы инициировать передачу энергии. Когда вращательная диффузия намного медленнее, чем время жизни донора, ориентация донора и акцептора остается близкой к начальной начальной конфигурации, которая в первую очередь определяет скорость передачи энергии.Это проявляется в сдвиге значений κ ² в сторону меньших значений, соответствующих менее эффективному переносу, когда вращательная диффузия медленная относительно срока службы донора, см. Рис. 5.

Рис. 5. Фактор ориентации во время переноса.

Показаны факторы κ ² , которые имели место при моделировании во время передачи энергии от донора к акцептору. Сравним случай медленной вращательной диффузии τ _D / τ _R = 0.001 и быстрая вращательная диффузия τ _D / τ _R = 0,05. Для медленной вращательной диффузии κ ² факторы демонстрируют значительный сдвиг в сторону меньших значений. Это следствие того, что быстрая вращательная диффузия дает больше возможностей быть в благоприятных ориентациях для передачи энергии.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122.g005

Изменение эффективности переноса в результате кинетики вращения может быть значительным.Для относительно быстрой вращательной диффузии в масштабе времени τ _R / τ _D = 19,5, мы находим, что передача энергии составляет E = 0,486. Это близко к тому моменту, когда ориентация полностью усредняется, чтобы получить передачу энергии E = 0,5. Для шкалы времени медленной вращательной диффузии τ _R / τ _D = 975 мы имеем эффективность переноса E = 0.403. В этом случае кинетика вращения привела к сдвигу в средней эффективности переноса на 17%.

Наши результаты указывают на то, что эффективность переноса FRET E может демонстрировать значительный сдвиг без каких-либо изменений в конформационном состоянии измеряемой молекулы. Эти изменения возникают исключительно из-за разной скорости вращательной диффузии. На практике это может происходить из-за изменений вязкости окружающего растворителя или из-за переходных событий связывания с молекулами, присутствующими в растворителе, которые временно ограничивают вращение донора и акцептора.Мы показываем сдвиги, которые могут происходить из-за этих эффектов в широком диапазоне коэффициентов диффузии на рис. 6.

Рис. 6. Вращательная диффузия и сдвиги в эффективности передачи FRET E .

По мере того, как вращательная диффузия уменьшается, средняя эффективность переноса значительно меняется. На вставке мы показываем процентное смещение, измеренное как % смещение = | E _obs — E ₀ | / E ₀ где мы берем эталонный КПД E ₀ = 0.5. Первые несколько точек данных имеют значение τ _D / τ _R = 0,001, 0,003 и 0,005.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122.g006

3.3 Донорно-акцепторная диффузия на расстоянии

Мы рассматриваем роль относительной поступательной диффузии донорных и акцепторных молекул. Нас особенно интересует случай, когда измеряемое конформационное состояние молекулы включает выборку по ансамблю различных конфигураций.В этом случае донор и акцептор могут претерпевать значительную трансляционную диффузию за время жизни донора [51, 52]. Например, для неупорядоченного белка или полимера, подвергнутого различным условиям сольватации, FRET может использоваться для определения радиуса инерции [35, 53–55]. Когда ансамбль конфигураций остается неизменным, мы исследуем роль кинетики, связанной с диффузией расстояния разделения.

Мы моделируем диффузию разделительного расстояния R случайным процессом. (10) γ обозначает эффективное сопротивление, Φ потенциал свободной энергии для расстояния разнесения R , D _S эффективный коэффициент диффузии при разделении и W _t броуновское движение.Уравнение следует интерпретировать в смысле исчисления Ито [48]. Мы моделируем разделение донорной и акцепторной меток, прикрепленных к полимеру, за счет потенциала свободной энергии. (11) Мы параметризуем модель, используя коэффициент диффузии D _S и принимаем сопротивление γ = k _B T / D _S , где k _B — коэффициент Больцмана. постоянная и T — температура.Чтобы смоделировать, что происходит, когда расстояние разделения приближается к нулю, мы избегаем отрицательных длин с помощью отражающего граничного условия в нуле [49]. Мы характеризуем эту диффузионную динамику шкалой времени τ _S = ℓ ² / D _S , где ℓ — это та же длина, что и в уравнении (11). Параметры, используемые по умолчанию в нашем моделировании, приведены в Таблице 1.

В состоянии равновесия этот процесс диффузии имеет разделительное распределение (12) где — статистическая сумма [56].Для моделирования этого процесса мы генерируем временные шаги, используя метод Эйлера-Мараюмы [57]. (13) η ⁿ генерируется на каждом временном шаге как независимая стандартная гауссова случайная величина с нулевым средним и единицей дисперсии. Длительность временного шага обозначается Δ t . На практике мы используем временной шаг с Δ t = τ _S /10 ⁴ . Чтобы дать некоторое представление о флуктуациях разделения и в качестве подтверждения наших методов моделирования, мы показываем численные результаты для равновесного распределения на рис. 7.

Рис. 7. Равновесное распределение расстояний между донорами и акцепторами.

Результаты моделирования шагов акцепторно-донорных меток диффузии полимера (гистограмма) сравниваются с предсказанным распределением расстояний разделения из уравнения (12) (красная кривая). Результаты получены из 1,8 × 10 ⁶ выборочных шагов моделирования, соответствующих среднему значению μ = R ₀ и дисперсии.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122.g007

Мы рассматриваем роль кинетики разделения донора и акцептора в течение времени жизни возбуждения донора. Мы рассматриваем эффективность переноса для различных скоростей разделения диффузии D _S относительно времени жизни донора τ _D . Его можно охарактеризовать следующим образом: τ _D / τ _S , где τ _S = ℓ ² / D _S .

Мы обнаружили, что уменьшение коэффициента диффузии разделения приводит к значительному сдвигу в эффективности переноса FRET, см. Рис. 8. Мы также обнаружили, что по мере уменьшения коэффициента диффузии разделения распределение наблюдаемых эффективностей значительно расширяется. Для самого быстрого трансляционного коэффициента диффузии у нас есть средняя эффективность передачи E = 0,723 по сравнению с рассматриваемым самым медленным поступательным коэффициентом E = 0,508. Это дает относительный сдвиг в эффективности передачи FRET на 30%.

Рис. 8. Коэффициент диффузии разделения и эффективность переноса FRET.

Коэффициент диффузии отрыва соответствует τ _D / τ _S = 0,69, 0,07 и 0,007. Они имеют среднюю эффективность передачи соответственно E = 0,723, E = 0,553 и E = 0,508. Это соответствует относительному сдвигу на 30% в эффективности переноса. По мере уменьшения коэффициента диффузии разделения распределение эффективностей переноса значительно расширяется.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122.g008

Набор конфигураций одинаков как для самой быстрой, так и для самой медленной диффузии, поэтому изменение эффективности переноса происходит исключительно из-за кинетических эффектов. В течение времени жизни донора диффузия влияет на то, насколько вероятно, что донор и акцептор встретят конфигурации, благоприятные для передачи энергии. В случае медленной диффузии скорость передачи энергии в первую очередь определяется исходной конфигурацией донора и акцептора.

В случае быстрой диффузии относительно времени жизни донора, донор и акцептор имеют больше возможностей встретить благоприятные конфигурации для передачи энергии. Эта разница в том, как часто встречаются такие «зоны наилучшего восприятия» для передачи энергии в течение срока службы донора, подтверждается наблюдаемыми разделительными расстояниями, которые возникают во время передачи энергии, см. Рис. 9.

Рис. 9. Расстояние разделения во время передачи энергии.

Показаны расстояния разделения, которые имели место при моделировании во время передачи энергии.Сравним случай медленной диффузии на расстояние τ _D / τ _S = 0,007 и быстрой диффузии на расстояние τ _D / τ _S = 0,69 . В случае быстрой диффузии мы видим, что передача энергии происходит гораздо чаще при меньших разделительных расстояниях.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122.g009

Для самого быстрого коэффициента диффузии мы видим, что значительно меньшие разделительные расстояния возникают во время передачи энергии и, таким образом, дают в среднем большую эффективность FRET.В случае самого медленного коэффициента диффузии мы видим, что распределение разделительных расстояний шире и более точно соответствует равновесному распределению разделительных расстояний, поскольку скорость передачи энергии в значительной степени определяется исходной конфигурацией донора и акцептора. Мы показываем сдвиги в передаче энергии для широкого диапазона коэффициентов диффузии разделения на рис. 10.

Рис. 10. Распространение расстояний и сдвиги в эффективности передачи FRET.

По мере того, как расстояние диффузии уменьшается, средняя эффективность переноса значительно меняется.На вставке мы показываем сдвиг как относительный процент, равный % shift = | E _obs — E ₀ | / E ₀ с эталонной эффективностью E ₀ = 0,5.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122.g010

3.4 Роль тушения без выбросов

Мы также рассматриваем случай, когда донор может снять возбуждение через неизлучающий путь [29]. Одним из возможных механизмов является динамическое тушение, когда донор высвобождается, вступая в контакт с химическими частицами, диффундирующими в окружающем растворе [26–28].У некоторых доноров есть фотофизика, на которую существенно влияет присутствие ионов. Это используется в некоторых экспериментах в качестве репортера концентрации ионов [15, 26, 31].

Мы принимаем во внимание эти эффекты, развивая некоторую теорию того, как дополнительный неизлучающий путь может изменить наблюдаемую эффективность FRET. Неизлучающий путь гашения можно смоделировать в нашей кинетике, убивая некоторую часть событий девозбуждения донора, которые привели бы к передаче энергии акцептору и, в конечном итоге, испусканию акцепторных фотонов.Для эффективности передачи FRET это соответствует увеличению уравнения (5) до (14) Величина 1 — α дает долю девозбуждений доноров, которые приводят к тому или иному типу тушителя без излучения. Дает соответствующую смещенную эффективность FRET при включении пути тушения.

Случай α = 1 соответствует ситуации, когда не излучающие тушения отсутствуют. В этом случае у нас есть. В случае α = 0, все наблюдаемые девозбуждения приводят к не излучающим событиям тушения вместо девозбуждения донора посредством событий передачи FRET и испускания акцепторных фотонов.В этом случае мы имеем, см. Рис. 11.

Рис. 11. Тушение без излучения и сдвиги в эффективности передачи FRET.

Наблюдаемая эффективность переноса FRET показана при включении дополнительного неизлучающего пути в донорно-акцепторную кинетику. Для различных скоростей α неизлучающих событий гашения результаты показывают, как повышается эталонная эффективность переноса E в случае отсутствия гашения.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122.g011

Эффективность FRET удобно выразить как (15) куда . Это обеспечивает эталон f , соответствующий отношению эмиссии донора к эмиссии акцептора, когда нет неизлучающего тушения. Эталонная доля f связана с эталонной эффективностью передачи FRET E следующим образом: f = E ⁻¹ -1. Сдвиг в процентах наблюдаемой эффективности FRET, возникающий в результате гашения, определяется выражением (16) Мы видим, что процентное изменение FRET, которое происходит из-за гашения, зависит от эталонной эффективности передачи FRET E .Фактически, возникающий сдвиг становится все более чувствительным по мере уменьшения E , см. Рис. 12.

Рис. 12. Тушение без излучения и сдвиги в эффективности передачи FRET.

Относительное процентное изменение эффективности переноса показано, когда тушение без излучения происходит как часть донорно-акцепторной кинетики.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122.g012

4 Обсуждение

Мы показали несколько различных способов, с помощью которых эффективность FRET может быть изменена как следствие кинетических эффектов, в то время как лежащее в основе молекулярное конформационное состояние фактически осталось прежним.Мы рассматриваем, как такие кинетические механизмы соотносятся с некоторыми недавними экспериментами, изучающими причины сдвигов в эффективности FRET [19, 34, 35, 58].

FRET часто используется для измерения конформационных изменений или фолдинга белков, поскольку денатурирующие условия меняются [22, 35, 53]. В недавней работе Липмана, Плакско и др. [35] радиус вращения полимеров полиэтиленгликоля (ПЭГ) рассматривается в условиях сольватации, которые дают случайные спирали. В отличие от белков, не ожидается, что ансамбль конфигураций полимера PEG существенно изменится при изменении денатуранта.Это подтверждается экспериментами по измерениям рассеяния рентгеновских лучей, которые действительно показывают, что радиус вращения ПЭГ остается неизменным при изменении денатуранта [35, 58]. Это обеспечивает полезный контроль для исследования FRET, поскольку условия денатуранта меняются.

Интересным открытием является то, что измерения FRET в одних и тех же условиях показывают значительный сдвиг в измеренной эффективности передачи. Для полимера PEG размером 3 кДа в денатуранте GuHcl в диапазоне концентраций от 0 до 6 М молярный сдвиг наблюдался в эффективности переноса примерно на 20%, как указано в E ₀ = 0.5. Для того же полимера в денатуранте , мочевина в диапазоне концентраций от 0 до 8M наблюдается сдвиг в эффективности ~ 24% по сравнению с E ₀ = 0,5. Подобные сдвиги были обнаружены для экспериментов, проведенных с использованием ПЭГ 5 кДа [35].

Наши результаты показывают, что значительные сдвиги могут происходить в наблюдаемой эффективности FRET, даже когда нет никаких основных изменений в конформационном ансамбле. Мы показали, как эффективность переноса может изменяться исключительно из-за кинетических эффектов, возникающих из-за изменения скорости диффузии ориентации акцептор-донор, диффузии расстояния между донором и акцептором, а также из-за неизлучающего тушения.Для диффузии расстояния разделения донор-акцептор мы обнаружили, что такие кинетические эффекты могут вызывать сдвиги в эффективности до 48%. Это произошло, когда шкала времени диффузии на расстоянии приблизилась к шкале времени жизни донора, см. Рис. 10.

Один из способов объяснить экспериментально наблюдаемые сдвиги — рассмотреть, как денатурирующий агент увеличивает вязкость растворителя [35, 59]. Ожидается, что изменения вязкости растворителя будут тесно связаны с изменениями скорости диффузии, как предполагает соотношение Стокса-Эйнштейна [49].Такой механизм теоретически исследован в работах [58, 60]. Мы обсуждаем здесь, как результаты нашего моделирования соотносятся с изменениями вязкости растворителя.

Предполагаемое изменение объемной вязкости растворителя при изменении концентрации денатуранта мочевины при 8M составляет 1,66, а для GuHcl 6M — 1,61 согласно экспериментам [59]. Чтобы связать вязкость с коэффициентом диффузии, можно использовать соотношение Стокса-Эйнштейна D = k _B T / γ .Сопротивление определяется как γ = 6 πμa , где μ — вязкость растворителя, а a — эталонная шкала длины, характеризующая размер диффундирующей молекулы. Это говорит о том, что увеличение вязкости растворителя в 1,61 раза снижает коэффициент диффузии в 0,6 раза.

В наших расчетах, взяв в качестве базового случая τ _D / τ _S = 0,1, такое изменение вязкости приводит к сдвигу эффективности переноса на ∼12%.Этот вклад, обусловленный исключительно диффузионной кинетикой разделения донора и акцептора, составляет примерно половину сдвига ∼24%, наблюдаемого для 8M мочевины , и ∼20%, наблюдаемого для 6M GuHcl в [35]. Это согласуется с выводами [58], предполагающими, что другие механизмы также могут играть роль в наблюдаемом изменении эффективности переноса.

При интерпретации этих эффектов существует ряд потенциальных тонкостей. С одной стороны, донорные и акцепторные молекулы сравнимы по размеру с молекулами, денатурирующими вязкость, и изменения коэффициента диффузии, возможно, могут быть более значительными из-за более сложных взаимодействий, чем предполагалось при использовании простой объемной теории вязкости и диффузии [61–63].Другое соображение — это роль неизлучающего тушения, вызванного столкновительным контактом молекул денатуранта с донором [29]. В сочетании с кинетическими изменениями диффузии даже небольшое количество возбуждений, приводящее к тушению <5%, привело бы к общему комбинированному сдвигу на ~ 20% в наблюдаемой эффективности переноса, см. Рис. 12.

5 Заключение

Мы показали, что кинетика может играть значительную роль в изменении наблюдаемой эффективности переноса FRET, даже если нет основного изменения в конформационном состоянии измеряемой молекулы.Мы обнаружили, что изменение ориентации диффузии может в самых крайних случаях изменить эффективность переноса до 20%. Для рассматриваемой диффузии расстояние разделения донор-акцептор мы обнаружили в самых крайних случаях сдвиги до 48%. Наши данные о расстоянии донор-акцептор согласуются с исследованиями Макарова и Плакско [38]. Отметим, что наши результаты, касающиеся ориентационной диффузии, учитывают дополнительные эффекты, которых нет в [38], и могут предложить некоторое объяснение сдвигов FRET, которые наблюдаются в жестких полипролиновых цепях [34, 35].Мы обнаружили, что диффузионная кинетика как ориентации, так и разделения демонстрирует отчетливую подпись на гистограмме наблюдаемой эффективности переноса в виде уширения пиков. Мы также обнаружили, что неизлучающие тушения, которые происходят даже на умеренном уровне, могут привести к значительным сдвигам в наблюдаемой эффективности переноса. Обсуждаемые нами механизмы имеют потенциально важные последствия при интерпретации измерений FRET, особенно в отношении выводов из изменений расстояния FRET и того, как это связано с изменениями конформационного состояния молекул.При анализе измерений FRET мы надеемся, что наши результаты предоставят несколько полезных ориентиров, которые помогут определить значимость наблюдаемых сдвигов и роль кинетических эффектов.

Благодарности

Авторы P.J.A и B.W благодарят за поддержку исследовательский грант NSF CAREER — 0956210, NSF DMS — 1616353 и DOE ASCR CM4 DESC0009254. Авторы также хотели бы поблагодарить А. Саймона, Э. Липмана и К. Плакско за полезные обсуждения и предложения. Признавая вышеперечисленное, авторы берут на себя полную ответственность за содержание и комментарии в рукописи.

Вклад авторов

1. Концептуализация: PJA BW.
2. Расследование: PJA BW.
3. Методология: PJA BW.
4. Написание — первоначальный эскиз: PJA BW.
5. Написание — просмотр и редактирование: PJA BW.

Ссылки

1. 1. Forster TH. Механизмы передачи энергии электронного возбуждения. Дополнение к радиационным исследованиям. 1960; 2: 326–339.
2. 2. Clegg RM. История FRET: от зачатия до родов. В: CD G, JR L, редакторы. Обзоры в Флуоресценции. т. 3. Springer; 2006. с. 1–45.
3. 3. Форстер Т. 10-я лекция в память о Спайерсе. Механизмы передачи электронного возбуждения. Обсудите Faraday Soc. 1959; 27 (0): 7–17.
4. 4. Страйер Л., Хаугланд Р.П. Передача энергии: спектроскопическая линейка. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки.1967. 58 (2): 719–726. pmid: 5233469
5. 5. ван дер Меер Б.В. Теория Форстера. В: Мединц I, Хильдебрандт Н., редакторы. FRET — резонансный перенос энергии Форстера: от теории к приложениям. 1-е изд. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA .; 2014. с. 23–62.
6. 6. Вайс С. Флуоресцентная спектроскопия одиночных биомолекул. Наука. 1999. 283 (5408): 1676–1683. pmid: 10073925
7. 7. Сонг Й., Мадахар В., Ляо Дж. Развитие FRET-анализа в платформу для количественной и высокопроизводительной технологии скрининга белок-белковых взаимодействий.Анналы биомедицинской инженерии. 2011. 39 (4): 1224–1234. pmid: 21174150
8. 8. Plaxco KW, Soh HT. Биосенсоры на основе переключателей: новый подход к молекулярному обнаружению in vivo в реальном времени. Тенденции в биотехнологии. 2011; 29 (1): 1–5. pmid: 21106266
9. 9. Хаас Э., Качальски-Кацир Э., Стейнберг И.З. Броуновское движение концов олигопептидных цепей в растворе, оцениваемое по передаче энергии между концами цепи. Биополимеры. 1978. 17 (1): 11–31.
10. 10.Рахман ММ. Введение в перенос энергии резонанса флуоресценции (FRET). Научный журнал физики. 2012 ;.
11. 11. Назаров П.В., Кохорст РБМ, Вос В.Л., Апанасович В.В., Хемминга М.А. Исследование FRET мембранных белков: подгонка на основе моделирования для анализа внедрения и ассоциации мембранных белков. Биофизический журнал. 2006. 91 (2): 454–466. pmid: 16632512
12. 12. Поршень DW, Kremers GJ. Флуоресцентный белок FRET: хорошее, плохое и уродливое.Направления биохимических наук. 2007. 32 (9): 407–414. pmid: 17764955
13. 13. Агафонов Р.В., Неграшов И.В., Ткачев Ю.В., Блейкли С.Е., Титус М.А., Томас Д.Д. и др. Структурная динамика спирали реле миозина по данным EPR и FRET с временным разрешением. Труды Национальной академии наук. 2009. 106 (51): 21625–21630.
14. 14. Эдидин М. Флуоресцентный резонансный перенос энергии: методы измерения молекулярной конформации и молекулярной близости. В: Текущие протоколы в иммунологии.John Wiley & Sons, Inc.; 2001. с. -. Доступно по адресу: http://dx.doi.org/10.1002/0471142735.im1810s52.
15. 15. Ueda Y, Kwok S, Hayashi Y. Применение зондов FRET в анализе нейрональной пластичности. Границы в нейронных цепях. 2013; 7: 163–. pmid: 24133415
16. 16. Ха Т, Тинг А.Ю., Лян Дж., Колдуэлл В.Б., Дениз А.А., Chemla DS и др. Одномолекулярная флуоресцентная спектроскопия конформационной динамики и механизма расщепления ферментов. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки.1998. 96 (3): 893–898.
17. 17. Шреста Д., Дженей А., Надь П., Вереб Г., Сёллёси Дж. Понимание FRET как исследовательского инструмента для исследований сотовой связи. Международный журнал молекулярных наук. 2015. 16 (4): 6718–6756. pmid: 25815593
18. 18. Дениз А.А., Дахан М., Грюнвелл Дж.Р., Ха Т, Фаулхабер А.Е., Chemla DS и др. Однопарный резонансный перенос энергии флуоресценции на свободно диффундирующих молекулах: наблюдение зависимости Фёрстера от расстояния и субпопуляций. Труды Национальной академии наук.1999. 96 (7): 3670–3675.
19. 19. Вайс С. Измерение конформационной динамики биомолекул с помощью флуоресцентной спектроскопии одиночных молекул. Nat Struct Mol Biol. 2000. 7 (9): 724–729.
20. 20. Вентилятор C, Plaxco KW, Heeger AJ. Биосенсоры на основе донорно-акцепторных расстояний, модулируемых связыванием. Тенденции в биотехнологии. 2005. 23 (4): 186–192. pmid: 15780710
21. 21. Ни Q, Чжан Дж. Динамическая визуализация сотовой сигнализации. В: Эндо И., Нагамуне Т., редакторы.Нано / микробиотехнология. Берлин, Гейдельберг: Springer Berlin Heidelberg; 2010. с. 79–97. Доступно по адресу: http://dx.doi.org/10.1007/10_2008_48.
22. 22. Шулер Б., Липман Э.А., Итон Вашингтон. Исследование поверхности свободной энергии для сворачивания белков с помощью флуоресцентной спектроскопии одиночных молекул. Природа. 2002; 419 (6908): 743–747. pmid: 12384704
23. 23. Hofmann H, Hillger F, Pfeil SH, Hoffmann A, Streich D, Haenni D, et al. Одномолекулярная спектроскопия сворачивания белка в шаперониновой клетке.Труды Национальной академии наук. 2010. 107 (26): 11793–11798.
24. 24. Wickersham CE, Cash KJ, Pfeil SH, Bruck I, Kaplan DL, Plaxco KW и др. Отслеживание молекулярного двигателя с помощью оптического кодировщика в наномасштабе. Nano Lett. 2010. 10 (3): 1022–1027. pmid: 20121107
25. 25. Мори Т., Вале Р. Д., Томишиге М. Как кинезин ждет между шагами. Природа. 2007. 450 (7170): 750–754. pmid: 18004302
26. 26. Лю Б., Цзэн Ф., Ву Г., Ву С. Наночастицы как каркас для основанного на FRET ратиометрического обнаружения ионов ртути в воде с квантовыми точками в качестве доноров.Аналитик. 2012. 137 (16): 3717–3724. pmid: 22737682
27. 27. Ли Х., Рен Х, Инь Л., Баласубраманиан С., Кленерман Д. Измерение динамики одиночных молекул нуклеиновых кислот в растворе с помощью двухцветной фильтрованной ратиометрической флуоресцентной корреляционной спектроскопии. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 2004. 101 (40): 14425–14430. pmid: 15452356
28. 28. Marras SAE, Kramer FR, Tyagi S. Эффективность резонансного переноса энергии флуоресценции и контактно-опосредованного тушения в олигонуклеотидных зондах.Исследования нуклеиновых кислот. 2002; 30 (21): e122 – e122. pmid: 12409481
29. 29. Чанг Х.С., Луи Дж. М., Итон, Вашингтон. Различие между динамикой белка и фотофизикой красителя в экспериментах с одномолекулярным FRET. Биофизический журнал. 2009. 98 (4): 696–706.
30. 30. Стейнберг И.З., Качальски Э. Теоретический анализ роли диффузии в химических реакциях, тушении флуоресценции и безызлучательной передаче энергии. Журнал химической физики. 1968. 48 (6): 2404–2410.
31. 31. Дин KM, Qin Y, Palmer AE. Визуализация ионов металлов в клетках: обзор аналитических методов, подходов и зондов. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) — Исследование молекулярных клеток. 2012; 1823 (9): 1406–1415.
32. 32. Ha T, Enderle T, Ogletree DF, Chemla DS, Selvin PR, Weiss S. Исследование взаимодействия между двумя отдельными молекулами: передача резонансной энергии флуоресценции между одним донором и одним акцептором. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки.1996. 93 (13): 6264–6268. pmid: 86
33. 33. Нат А., Саммалкорпи М., ДеВитт Д., Трекслер А., Эльбаум-Гарфинкль С., О’Херн С. и др. Конформационные ансамбли альфа-синуклеина и тау-белка: сочетание одномолекулярного FRET и моделирования. Биофизический журнал. 2012; 103 (9): 1940–1949. pmid: 23199922
34. 34. Schuler B, Lipman EA, Steinbach PJ, Kumke M, Eaton WA. Полипролин и «спектроскопическая линейка» заново с флуоресценцией одиночных молекул. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки.2005. 102 (8): 2754–2759. pmid: 15699337
35. 35. Уоткинс Х.М., Саймон А.Дж., Сосник Т.Р., Липман Э.А., Хьелм Р.П., Плакско К.В. Отрицательный контроль с произвольной катушкой воспроизводит несоответствие между измерениями рассеяния и FRET размеров денатурированного белка. Труды Национальной академии наук. 2015; 112 (21): 6631–6636.
36. 36. Lakowicz JR, Kuśba J, Shen Y, Malicka J, D’Auria S, Gryczynski Z, et al. Влияние металлических частиц серебра на резонансную передачу энергии между флуорофорами, связанными с ДНК.Журнал флуоресценции. 2003. 13 (1): 69–77.
37. 37. Чжан Дж., Фу Й., Лакович Дж. Р. Улучшенная передача энергии резонанса Фёрстера (FRET) на отдельной металлической частице. Журнал физической химии C. 2007; 111 (1): 50–56.
38. 38. Макаров Д.Е., Plaxco KW. Измерение расстояний в развернутых биополимерах с использованием резонансной передачи энергии флуоресценции: влияние динамики полимерных цепей на наблюдаемую эффективность резонансной передачи энергии флуоресценции. Журнал химической физики.2009; 131 (8).
39. 39. Камли Б.А., Браун FLH, Липман Е.А. Перенос Фёрстера за предел слабого возбуждения. Журнал химической физики. 2009; 131 (10).
40. 40. Муньос-Лоса А., Крутчет С., Крюгер Б. П., Харцелл Л. Р., Меннуччи Б. Беспокойство по поводу FRET: отказ идеального дипольного приближения. Биофизический журнал. 2009. 96 (12): 4779–4788.
41. 41. ван дер Меер Б.В. Теория Форстера. В: Мединц I, Хильдебрандт Н., редакторы. Оптимизация коэффициента ориентации по каппа-квадрату для более точных измерений FRET в FRET — резонансная передача энергии Форстера: от теории к приложениям.1-е изд. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA .; 2014. с. 63–104.
42. 42. Эндрюс Д.Л., Демидов А.А. Глава 14: Теоретические основы и разработка приложений. В кн .: Передача энергии резонанса. В то время как 2009. с. 461–499.
43. 43. Саху Х. Ферстер резонансный перенос энергии — Спектроскопический нанополимер: принцип и приложения. Журнал фотохимии и фотобиологии C: обзоры фотохимии. 2011; 12 (1): 20–30.
44. 44. Валчевска-Шевц К., Корри Б.Учет диффузии и ориентации красителя при связывании измерений FRET с расстояниями: три простых вычислительных метода. Phys Chem Chem Phys. 2014. 16 (24): 12317–12326. pmid: 24824374
45. 45. Икбал А., Арслан С., Окумус Б., Уилсон Т.Дж., Жиро Г., Норман Д.Г. и др. Зависимость от ориентации в переносе флуоресцентной энергии между Cy3 и Cy5, концевыми присоединенными к двухцепочечным нуклеиновым кислотам. Труды Национальной академии наук. 2008. 105 (32): 11176–11181.
46. 46.Клозе Д., Клар Дж. П., Громанн Д., Кей К.В.М, Вернер Ф., Штайнхофф Х.Дж. Моделирование и реальность: сравнение прогнозов расстояния In Silico с измерениями DEER и FRET. PLoS ONE. 2012; 7 (6): e39492–. pmid: 22761805
47. 47. Brillinger DR. Частица, случайно перемещающаяся по сфере. Журнал теоретической вероятности. 1997. 10 (2): 429–443.
48. 48. Оксендал Б. Стохастические дифференциальные уравнения: Введение. Springer; 2000.
49. 49. Гардинер CW.Справочник по стохастическим методам. Серия по синергетике. Springer; 1985.
50. 50. Сигурдссон Дж. К., Атцбергер П. Дж. Гидродинамическое связывание включений частиц, встроенных в изогнутые двухслойные липидные мембраны. Мягкая материя. 2016; 12 (32): 6685–6707. pmid: 27373277
51. 51. Гурунатан К., Левитус М. Флуктуационная спектроскопия FRET диффундирующих биополимеров: вклад конформационной динамики и поступательной диффузии. J. Phys Chem B. 2010; 114 (2): 980–986. pmid: 20030305
52. 52.Бадали Д., Градинару СС. Влияние броуновского движения флуоресцентных зондов на измерение наноразмерных расстояний с помощью резонансной передачи энергии Фёрстера. Журнал химической физики. 2011; 134 (22): 225102. pmid: 21682537
53. 53. Торговец KA, Best RB, Louis JM, Gopich IV, Eaton WA. Характеристика развернутых состояний белков с помощью FRET-спектроскопии одиночных молекул и молекулярного моделирования. Труды Национальной академии наук. 2007. 104 (5): 1528–1533.
54. 54.Хаас Э. Ансамблевые методы FRET в исследованиях белков с внутренними нарушениями. В кн .: Уверский Н.В., Дункер К.А., ред. Анализ внутренне нарушенных белков: том 1, методы и экспериментальные инструменты. Тотова, Нью-Джерси: Humana Press; 2012. с. 467–498. Доступно по ссылке: http://dx.doi.org/10.1007/978-1-61779-927-3_28.
55. 55. Шулер Б., Мюллер-Шпет С., Соранно А., Неттелс Д. Применение конфокального одномолекулярного FRET к внутренне неупорядоченным белкам. В кн .: Уверский Н.В., Дункер К.А., ред.Анализ внутренне нарушенных белков: том 2, методы и экспериментальные инструменты. Нью-Йорк, Нью-Йорк: Springer Нью-Йорк; 2012. с. 21–45. Доступно по ссылке: http://dx.doi.org/10.1007/978-1-4614-3704-8_2.
56. 56. Reichl LE. Современный курс статистической физики. Jon Wiley and Sons Inc .; 1997.
57. 57. Э. КП, Платен Э. Численное решение стохастических дифференциальных уравнений. Springer-Verlag; 1992.
58. 58. Ю Т.Ю., Мейсбергер С., Хиншоу Дж., Поллак Л., Харан Дж., Сосник Т.Р. и др.Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей и FRET-спектроскопия одиночных молекул дают сильно различающиеся представления о низкоденатурантном развернутом состоянии. Журнал молекулярной биологии. 2012. 418 (3-4): 226–236. pmid: 22306460
59. 59. Кавахара К., Танфорд С. Вязкость и плотность водных растворов мочевины и гидрохлорида гуанидина. Журнал биологической химии. 1966. 241 (13): 3228–3232. pmid: 56
60. 60. Мурацугу А., Ватанабе Дж., Киношита С. Влияние диффузии на резонансный перенос энергии Фёрстера в маловязком растворе.Журнал химической физики. 2014; 140 (21): 214508. pmid: 24
7
61. 61. Ли З. Критический размер частиц, при котором соотношение Стокса-Эйнштейна нарушается. Phys Rev E. 2009; 80 (6): 061204–.
62. 62. Шарма М., Яшонат С. Нарушение связи Стокса – Эйнштейна: роль взаимодействий в размерной зависимости самодиффузии. J. Phys Chem B. 2006; 110 (34): 17207–17211. pmid: 16
    9
63. 63. Бернштейн Дж., Фрикс Дж. Анализ диффузии отдельных частиц с временным связыванием с использованием фильтрации частиц.Журнал теоретической биологии. 2016; 401: 109–121. pmid: 27107737

Структурная динамика спирали реле миозина по данным ЭПР и FRET с временным разрешением

Реферат

Мы использовали два дополнительных метода спектроскопии с временным разрешением, диполярный электронно-электронный резонанс и флуоресцентный резонансный перенос энергии, чтобы определить конформационные изменения в единственном структурном элементе моторного домена миозина, релейной спирали, до и после инсульта восстановления.Два мутанта с двойным Cys метили оптическими зондами или спиновыми метками и определяли межзондовые расстояния. Оба метода разрешили два различных структурных состояния миозина, соответствующие прямым и изогнутым конформациям релейной спирали. Изогнутое состояние было занято только после добавления нуклеотидов, что указывает на то, что релейная спираль, как и вся миозиновая головка, изгибается в ходе восстановления. Однако насыщение миозина нуклеотидом, приводящее к единственному биохимическому состоянию, не приводило к единому структурному состоянию.Как прямые, так и изогнутые структурные состояния релейной спирали были заняты, когда либо аналоги АТФ (ADP.BeF _x ), либо аналоги ADP.P _i (ADP.AlF ₄ ) были связаны в активном центре. Большая популяция была обнаружена в изогнутом структурном состоянии, когда был связан постгидролизный аналог ADP.AlF ₄ . Мы пришли к выводу, что изгиб эстафетной спирали в ходе восстановления не требует гидролиза АТФ, но ему способствует. Более узкое распределение расстояний между зондами показывает упорядочение релейной спирали, несмотря на ее изгиб, во время такта восстановления, обеспечивая дальнейшее понимание динамики этого структурного перехода, преобразующего энергию.

Миозин — это молекулярный мотор, который генерирует силу на актин при сокращении мышц, перемещении клеток и внутриклеточном движении. Миозин работает циклически, дважды за цикл меняя свою структуру, производя силовой удар и восстановительный удар. Эти структурные изменения модулируются связыванием и гидролизом АТФ. Рентгеновские кристаллические структуры миозина в различных биохимических состояниях, захваченные аналогами нуклеотидов, которые, как считается, имитируют структурные промежуточные соединения миозина, предоставляют информацию о молекулярной организации и чувствительности к связыванию нуклеотидов, но молекулярные механизмы структурных переходов в растворе остаются неизвестными.Более того, взаимосвязь между связанным нуклеотидом и кристаллической структурой миозина не совсем согласована. Например, две различные кристаллические структуры были получены для миозина в комплексе с нуклеотидным аналогом ADP.BeF _x (1, 2). Неясно, отражают ли эти различия внутреннее свойство миозина, или они просто возникают из-за различий в условиях кристаллизации. Как недавно было сделано в обзоре (3), для дополнительного понимания необходимы сайт-ориентированное мечение и спектроскопия с использованием кристаллографических данных в качестве отправной точки.

На основании кристаллических структур миозина (4–6) и спектроскопии (7) было предложено, что домен, связывающий легкую цепь, вращается относительно каталитического домена, заставляя миозиновую головку выпрямляться при силовом ударе и изгибаться. ход восстановления (рис. 1 A ). Эти же кристаллические структуры предполагают, что этот переход между прямой (M *) и изогнутой (M **) структурами отражает удивительно похожий переход в релейной спирали (рис.1 B ), α-спирали длиной 4,7 нм, которая связывает сайт связывания нуклеотидов с доменом легкой цепи через домен-конвертер (4, 5).Цель настоящего исследования — проверить эту гипотезу непосредственно в растворе во время восстановительного инсульта.

Предлагаемая координация домена легкой цепи и релейной спирали. ( A ) Миозин S1 связан с актином (коричневый) в состояниях до восстановления (M *, S1 зеленый) и после восстановления (M **, S1 красный) (3). ( B ) Миозиновый моторный домен, наложение кристаллических структур 1FMV (M *, релейная спираль, зеленый) и 1VOM (M **, релейная спираль, красный), демонстрирующие предполагаемый изгиб релейной спирали.Оранжевый указывает на спроектированные участки маркировки, показывая прогнозируемое сокращение расстояния между 639 и 498 (голубые стрелки) и между 515 и 498 (пурпурные стрелки) во время такта восстановления.

Мы сконструировали два мутанта миозина с двойным Cys Dictyostelium discoideum, с одним сайтом мечения, расположенным на С-конце релейной спирали (K498C), а другим внутри стабильных спиралей в нижнем 50K-домене (D515C или A639C) (рис. 1 ). B ). Эти цистеины были помечены либо нитроксидной спиновой меткой, либо донорно-акцепторной парой.Затем мы измерили межзондовые расстояния с помощью ЭПР с временным разрешением (диполярный электронно-электронный резонанс (DEER)) и FRET с временным разрешением (TR-FRET) для определения структурных состояний релейной спирали в различных биохимических состояниях миозина.

Сайт-направленная спектроскопия ранее использовалась для обнаружения нуклеотид-зависимых структурных переходов в миозине. Флуоресценция мутантов миозина с одним Trp (9, 10) и ЭПР спиновых меток, прикрепленных к сайтам с одним Cys (11, 12), показали нуклеотид-зависимые изменения в локальном окружении меченых сайтов, и предыдущие исследования FRET (8, 13) ) предоставили информацию о структуре всей миозиновой головки, но ни одно из этих исследований не разрешило структурные состояния отдельного структурного элемента внутри миозина.В настоящем исследовании мы использовали ЭПР с временным разрешением и TR-FRET для получения структурного разрешения, необходимого для обнаружения движения, беспорядка и конформационной гетерогенности в пределах одного субдомена миозина, информации, необходимой для выяснения механизма междоменного взаимодействия и принципов энергии. трансдукция в миозине.

Результаты

Изгиб спирали реле, определяемый DEER.

DEER — это метод импульсного спинового эхо ЭПР, который обнаруживает зависящие от расстояния дипольные взаимодействия между парой электронных спинов (14).Из-за зависимости дипольного взаимодействия r ⁻³ и детектирования с временным разрешением этот метод сообщает распределение спин-спиновых расстояний в образце с высоким разрешением в диапазоне от 2 до 6 нм (15). Спин-меченный миозин был захвачен в различных биохимических состояниях: M (апо), M.ADP, M.ATP (M.ADP.BeF _x ) и M.ADP.P _i (M.ADP.AlF _{). 4} или M.ADP.V _и ), а распределения межзондовых расстояний измеряли с помощью DEER (рис.2). Данные, полученные для M.ADP.AlF ₄ и M.ADP.V _и (улавливание биохимического состояния, аналогичного M.ADP.P _и ), были практически идентичны, поэтому в данном исследовании приводится только первый аналог. . Для обоих миозиновых мутантов связывание нуклеотидов вызывает более быстрый распад и колебания амплитуды спинового эха, что прямо указывает на уменьшение расстояния между зондами. По сравнению с состоянием апомиозина, ADP оказывал наименьшее влияние на данные DEER, ADP.AlF ₄ имел наибольшее влияние и эффект ADP.BeF _x (аналог АТФ) был промежуточным (рис. 2).

Изгиб спирали реле разрешен ОЛЕНЬЕМ. ( Left ) Данные DEER с поправкой на фон, полученные из указанных биохимических состояний, нормированные на постоянную глубину модуляции и смещенные по вертикали для ясности. ( Справа ) Распределения расстояний, извлеченные из данных DEER (M и M.ADP: одногауссово распределение, M.ADP.BeF _X , M.ADP.AlF ₄ : двухгауссово распределение). Параметры распределений приведены в таблице 1.

Сигналы спинового эха были смоделированы и подогнаны к экспериментальным данным с использованием гауссовых распределений расстояний (уравнение 1 ). В состоянии апо или с привязанным ADP одного гауссовского распределения расстояний было достаточно для получения качественной подгонки. Добавление второго гауссовского распределения расстояний не улучшило подгонку (рис. S1), указывая на единственную конформацию релейной спирали (рис. 2). Расстояние между зондами было наибольшим в состоянии апо, и наблюдалось небольшое, но последовательное уменьшение расстояния при связывании АДФ.Когда миозин образовывал комплекс с ADP.BeF _x или ADP.AlF ₄ , удовлетворительные совпадения были получены только с двухгауссовым распределением расстояний, отражающим два структурных состояния миозина с более длинными и более короткими расстояниями между зондами (рис. S1). . Все длинные и короткие расстояния, извлеченные из индивидуальных совпадений сигналов спинового эха, были подобны между комплексами M.ADP, M.ADP.AlF ₄ и M.ADP.Be.F _x . Следовательно, сигналы, соответствующие этим биохимическим состояниям, были подобраны глобально, предполагая, что присутствовали одни и те же два состояния, M * и M ** (характеризующиеся одинаковыми средними межзондовыми расстояниями R * и R **) (рис.2 и таблица 1). Качество этих подгонок, судя по значениям χ ² , было сопоставимо с качеством индивидуальных подгонок без ограничений, что указывает на наличие только двух различных структурных состояний (рис. 3 A и C ).

Распределение расстояний, R (FWHM) и мольные доли, наблюдаемые в каждом биохимическом состоянии, обнаруженном с помощью DEER (рис. 2)

Подгонка сигналов DEER в различных биохимических состояниях миозина (мутант 639: 498).( A ) Каждый сигнал настраивался независимо. ( B ) Все сигналы были согласованы глобально с использованием одного набора параметров: R *, R **, FWHM *, FWHM **. ( C ) Все сигналы были согласованы глобально с использованием одного набора параметров, за исключением того, что FWHM * для M.ADP было разрешено отличаться от такового для M.ADP.BeF _x и M.ADP.AlF ₄ . Мы пришли к выводу, что два структурных состояния M * и M ** имеют одинаковые средние расстояния R * и R ** во всех трех биохимических состояниях, но ширина FWHM * распределения M * меньше в биохимических состояниях нуклеотидных аналогов.Параметры, полученные на основе этих наилучших совпадений, сведены в Таблицу 1.

Спираль реле становится более упорядоченной во время восстановительного хода.

Нуклеотидные аналоги АТФ и АДФ.P _и явно вызывают не только более высокие скорости распада, но и более выраженные колебания затухания спинового эха (особенно для 639: 498, рис. 2 Нижний , что указывает на более узкое распределение расстояний между зондами) по сравнению с состояниями, связанными с апо или ADP (рис. 2 , справа ).3, было невозможно удовлетворительно подогнать данные, предполагая, что ширина распределений не изменялась во время структурного перехода миозина (сравните Рис. 3 A и B ). Если ширину распределения M * можно было изменять, качество общих подгонок было эквивалентно качеству подгонок без ограничений (сравните Рис. 3 A и C ). Мы обнаружили, что структурная гибкость (характеризуемая шириной распределения расстояний) в состоянии M * была меньше в состоянии M.Комплексы ADP.BeF _x и ADP.AlF ₄ по сравнению с комплексом M.ADP. Ширина распределения расстояний была еще меньше в структурном состоянии M ** (Рис. 2 Справа и Таблица 1).

Изгиб спирали реле, определяемый TR-FRET.

FRET определяет расстояние r между донорными и акцепторными зондами, связанное за счет безызлучательной передачи энергии. В результате этой передачи энергии скорость затухания флуоресценции донора увеличивается пропорционально r ⁻⁶ .В эксперименте TR-FRET донор возбуждается наносекундным лазерным импульсом, его флуоресценция детектируется с субнаносекундным разрешением, а время жизни флуоресценции τ используется для расчета расстояния r . Основным преимуществом TR-FRET по сравнению с обычным FRET (где измеряется только интенсивность стационарной флуоресценции) является способность разрешать множественные конформации белка с различными межзондовыми расстояниями, что приводит к различным временам жизни (16). Сигналы флуоресценции только донора [5 — ({2 — [(иодацетил) амино] этил} амино) нафталин-1-сульфоновая кислота (IAEDANS)] (рис.S2) и донорно-акцепторные [IAEDANS-4 — ((4- (диметиламино) фенил) азо) бензойная кислота (DABCYL)] — меченые мутанты миозина были приобретены в различных биохимических состояниях: апо, M.ADP, M.ADP.BeF _x (M.ATP) и M.ADP.AlF ₄ (M.ADP.P) (Рис.4 слева ). В отличие от DEER, TR-FRET был нечувствителен к связыванию ADP (рис. 4), вероятно, из-за меньшего разрешения по расстоянию FRET, а также большего размера и большей гибкости прикрепленных оптических зондов. Однако привязка ADP.BeF _x и ADP.AlF ₄ в миозин существенно уменьшил время жизни донора, что указывает на увеличение эффективности FRET и сокращение среднего расстояния между зондами (рис. 4), как наблюдалось с помощью DEER (рис. 2). Сигналы донорной флуоресценции для всех четырех биохимических состояний были согласованы глобально (при условии наличия тех же двух структурных состояний: M * и M **) в соответствии с уравнениями. 2 — 6 (рис.4). На основании сравнения невязок и значений χ ² для одно- и двухгауссовой аппроксимации (рис.S3) мы пришли к выводу, что одно структурное состояние заселяется в биохимических состояниях апо и M.ADP, а два структурных состояния заселяются связанными ADP.BeF _x и ADP.AlF ₄ . Мольные доли популяций миозина, межзондовые расстояния и распределения расстояний, извлеченные из подгонки, показаны на рис. 4 и в таблице 2.

Изгиб спирали реле разрешен TR-FRET. ( Left ) Флуоресцентные сигналы донорно-акцепторных мутантов миозина в указанных биохимических состояниях.( Справа ) Распределения расстояний, полученные путем подбора сигналов флуоресценции. Параметры распределений приведены в таблице 2.

Распределение расстояний, R (FWHM) и мольные доли, наблюдаемые в каждом биохимическом состоянии, обнаруженное TR-FRET (рис. 4)

Обсуждение

Целью данного исследования было определение структуры релейной спирали при динамическом миозин-нуклеотидном взаимодействии в растворе. Релейная спираль, важный элемент области миозина, генерирующей силу, соединяет сайт связывания нуклеотидов и конвертерный домен.Кристаллические структуры миозина демонстрируют две различные конформации релейной спирали, зависящие от связанного аналога нуклеотида. Широко распространено мнение, что переход между этими конформациями миозина, инициированный взаимодействием миозин-АТФ, является инсультом восстановления. В этом исследовании мы задаем следующие вопросы: сколько структурных состояний принимает релейная спираль в растворе? Есть ли прямая корреляция между состоянием нуклеотид-связывающего кармана и состоянием релейной спирали? Насколько жестка спираль реле? Что инициирует инсульт восстановления миозина, связывание АТФ или гидролиз АТФ? Мы использовали два дополнительных метода спектроскопических зондов, DEER и FRET, оба из которых используют импульсное возбуждение и детектирование с временным разрешением для получения структурного разрешения.Для обоих методов были использованы две пары сайтов мечения для триангуляции положений зонда в различных биохимических состояниях миозина и однозначного определения структурных состояний миозина.

Relay Helix принимает два структурных состояния в миозин-нуклеотидных комплексах.

Данные по DEER и TR-FRET очень хорошо согласуются (Таблица 3). Оба метода показывают наличие двух структурных состояний миозина (M * и M **) в одном биохимическом (миозин-нуклеотидный аналог) состоянии. Эти структурные состояния заселялись по-разному, в зависимости от связанного аналога нуклеотида (ADP.AlF ₄ , ADP.BeF _x ). Апо миозин проявлял одно отчетливое структурное состояние, М. Биохимическое состояние миозин-АДФ проявляло одно структурное состояние, М *. Расстояние между зондами в состоянии M * было всего на ≈0,15 нм короче, чем в состоянии M, что указывает на незначительное изменение структуры релейной спирали после связывания ADP. Только DEER четко определяет структурные изменения между состояниями M и M *, вероятно, из-за его превосходного разрешения по расстоянию и меньшего размера спиновой метки по сравнению с зондами FRET.Разница в межзондовых расстояниях между структурными состояниями M * и M ** гораздо более выражена (≈0,5 нм), что отражает существенное изменение конформации релейной спирали. Мы пришли к выводу, что существует только два различных структурных состояния силогенерирующей области миозина в биохимических состояниях M.ATP и M.ADP.Pi, M * и M **. Это наблюдение разрешает споры, возникшие в результате наблюдения двух разных кристаллических структур одного и того же миозина в комплексе с одним и тем же аналогом нуклеотида (ADP.BeF _x ) (1, 2). Наши результаты показывают, что оба структурных состояния заняты в растворе, поэтому структура, захваченная кристаллизацией, вероятно, зависит от конкретных экспериментальных условий, используемых для получения белка и роста кристаллов.

Межзондовые расстояния (нм) в состояниях миозина до восстановления (M *) и после восстановления после инсульта (M **), определяемые различными методами

Генерирующая силу область миозина более упорядочена в структурном состоянии после восстановления.

Анализ распределения межзондовых расстояний в структурных состояниях M * и M ** показывает меньшую ширину в состоянии M ** удара после восстановления, что указывает на больший порядок в генерирующей силу области миозина. В соответствии с этими экспериментальными результатами, моделирование молекулярной динамики миозина (MD) показало уменьшение колебаний основной цепи в релейной спирали при переходе от M * к M ** (рис. 5). Напротив, MD не продемонстрировал значительного влияния этого перехода на колебания остова на других сайтах в нижнем 50К-домене, включая сайты мечения D515 и A639.N-концевая часть релейной спирали является продолжением петли переключателя II, важного структурного элемента нуклеотид-связывающего сайта миозина; переключатель II разомкнут в M * и замкнут в M **. Экспериментально наблюдаемое более узкое распределение расстояний в структурном состоянии M ** (рис. 2 и таблица 1), подтвержденное уменьшением среднеквадратичных колебаний основной цепи в моделировании MD, отражает закрытие переключателя II и более сильное связывание нуклеотидов.

Моделируемые колебания позвоночника в структурных состояниях до восстановления (зеленый) и после восстановления (красный).Существенные различия видны только в релейной спирали (остатки 465–499).

Связывание АТФ инициирует ход восстановления.

Наши результаты показывают, что ретрансляционная спираль реагирует на изменения состояния нуклеотидного связывающего кармана и идентифицирует ретрансляционную спираль как междоменный линкер, который передает изменения от активного сайта к конвертирующему домену миозина. Поразительно, но мы обнаружили, что с аналогом АТФ (ADP.BeF _x ), связанным в активном сайте, спираль реле миозина может принимать как до восстановления, так и после восстановления структурные состояния.В отличие от классической модели функции миозина, в которой гидролиз АТФ связан с инсультом восстановления и служит его движущей силой, наши наблюдения показывают, что связывание АТФ играет решающую роль в инсульте восстановления. Ход восстановления предшествует гидролизу и происходит при связывании АТФ в активном центре. Следовательно, гидролиз необходим не для подпитки цикла восстановления, а для облегчения выпуска продукта и продолжения цикла. Эта гипотеза была ранее предложена на основе МД-моделирования (17, 18) и кристаллических структур, которые предполагали, что переключатель II в нуклеотидном кармане должен быть закрыт, чтобы миозин находился в каталитически активной форме (5, 19).Эксперименты по релаксации с одиночными мутантами Trp и аналогами нуклеотидов (20) показали изменения собственной флуоресценции миозина после быстрого скачка температуры или давления. Это было связано с наличием равновесия между открытой (до восстановления) и закрытой (после восстановления) конформациями и использовалось для расчета констант равновесия между состояниями. Наши измерения расстояния обеспечивают необходимые размерные детали для разрешения двух сосуществующих структурных состояний и непосредственного определения положения релейной спирали в каждом из состояний.

DEER и TR-FRET дополняют друг друга.

Хотя оба метода используют импульсное возбуждение и детектирование с временным разрешением и одни и те же участки мечения, каждый из них имеет определенные преимущества. По сравнению с относительно простым экспоненциальным затуханием донорной флуоресценции в экспериментах FRET, сложная форма сигналов модулированной интенсивности эха в DEER имеет более отчетливые спектральные особенности, которые можно использовать для оценки качества подбора, обеспечивая более высокое структурное разрешение. Еще одно преимущество DEER заключается в маркировке: меньший размер зонда и возможность использовать один и тот же зонд в обоих местах (по сравнению с парами донор-акцептор в FRET) упрощают подготовку образца и приводят к более надежной интерпретации данных.В частности, только DEER обнаружил незначительные (≈0,1 нм) изменения в структуре при связывании ADP, показал значительное уменьшение ширины распределения в состояниях M.ADP.BeF _x и M.ADP.AlF ₄ , и однозначно разрешили два структурных состояния в комплексах миозин-нуклеотидный аналог. Однако эксперименты TR-FRET могут проводиться при физиологических температурах и иметь на несколько порядков более высокую чувствительность, давая информацию о распределении расстояний в одном 50-нсекундном сигнале, обнаруженном с субнаносекундным разрешением.Таким образом, FRET может обеспечить это структурное разрешение в реальном времени во время биохимического переходного процесса. Кроме того, измерения FRET можно использовать для установления верхнего предела скорости перехода между разрешенными конформациями, которая приблизительно обратно пропорциональна среднему наблюдаемому времени жизни флуоресценции. Например, две конформации, разрешенные в таблице 2, должны обмениваться медленнее, чем ≈10 ⁸ с ^-1 .

Выводы

Мы разработали конструкции миозина для измерения индуцированной нуклеотидами динамики спирали реле миозина, важного структурного элемента в области генерирования силы, соединяющей сайт связывания нуклеотида и плечо рычага.Комбинируя мутагенез белков, сайт-направленное мечение, импульсную ЭПР-спектроскопию с высоким разрешением (DEER) и высокочувствительную флуоресцентную спектроскопию (TR-FRET), мы (—) обнаружили структурные изменения (изгиб и упорядочение) в спирали реле миозина в ответ на связывание аналога нуклеотида, ( ii ) разрешил два структурных состояния (прямое и изогнутое) релейной спирали в едином биохимическом состоянии миозина со связанным аналогом нуклеотида, и ( iii ) обнаружил изменения порядка и межзондовых расстояний во время взаимодействие миозина с АТФ.Мы заключаем, что ( i ) изгиб (структурное состояние) релейной спирали только слабо связан с идентичностью связанного нуклеотида (биохимическое состояние), и ( II ) изогнутое состояние релейной спирали частично заселено. сразу после связывания АТФ с миозином, не требуя гидролиза АТФ. Более широкое распределение межзондовых расстояний в состояниях предвосстановительного удара указывает на гибкость N-концевой части релейной спирали, когда петля switch II в сайте связывания нуклеотидов открыта.Эти результаты предоставляют прямую информацию о структурной динамике релейной спирали в миозине в растворе, обеспечивая понимание взаимодействия между активным сайтом миозина и областью, генерирующей силу.

Материалы и методы

Приготовление и маркировка белков.

Мутанты миозина D. discoideum были сконструированы и очищены, как описано (21). Для DEER белок был помечен спиновой меткой 4-малеимидо-2,2,6,6-тетраметил-1-пиперидинилокси (MSL) путем инкубации 100 мкМ миозина с 600 мкМ MSL в течение 12 ч на льду, в результате чего мечение> 90% Cys, как измерено масс-спектрометрией и спектральной интенсивностью.Для FRET белок был помечен в два этапа. Сначала 50 мкМ миозина инкубировали с 45 мкМ донора (IAEDANS) в течение 12 часов. Затем этот белок разбавляли до 25 мкМ и инкубировали со 100 мкМ акцептором (DABCYL). После каждого этапа мечения непрореагировавшую метку удаляли с помощью спин-колонок для исключения размера (Pierce). Степень маркировки FRET, определяемая по поглощению красителя, обычно составляла 30-40% донора и 60-70% акцептора, причем метились практически все цистеины. Буфер для маркировки содержал 20 мМ Mops, 50 мМ KCl, 3 мМ MgCl ₂ и 1 мМ EDTA, pH 7.5. Комплексы миозина с аналогами нуклеотидов получали, как описано (12). Если не указано иное, все эксперименты проводили при 20 ° C в буфере, содержащем 20 мМ N — (2-гидроксиэтил) пиперазин- N ‘ -3-пропансульфоновая кислота (EPPS), 6 мМ MgCl ₂ и 1 мМ EGTA, pH 8,0.

Анализ АТФазы.

измеряли в физиологическом буфере (Т = 25 ° C в 10 мМ Трис, 3 мМ MgCl ₂ и 5 мМ АТФ, pH 7,5) в присутствии и в отсутствие актина по высвобождению неорганического фосфата ( 22).Зависимость активности миозин-АТФазы от концентрации актина была аппроксимирована уравнением Михаэлиса-Ментен для определения V _max (активность насыщающего актина) и K _m (концентрация актина при V = 0,5 V). _макс ) (подробности в таблице S1).

Распределение межзондовых расстояний.

Чтобы отразить гибкость в структуре белка, сигналы DEER и FRET моделировались с использованием набора распределений расстояний, а не набора дискретных расстояний.Предполагалось, что форма каждого распределения является гауссовой: где σ — стандартное отклонение, а FWHM — полная ширина на половине высоты.

ОЛЕНЬ.

Сигналы DEER с временным разрешением были получены с помощью спектрометра Elexsys E580 (Bruker Biospin), оснащенного диэлектрическим резонатором (MD-5; Bruker Biospin), с использованием четырехимпульсной последовательности DEER (23) с π / два импульса длительностью 16 нс. и импульс ELDOR длительностью 40–48 нс. Частота накачки была сосредоточена на центральном резонансе спиновой метки нитроксида, а наблюдаемая частота была установлена ​​на низкополевом резонансе на расстоянии 67 МГц.Температура во время сбора данных была установлена ​​на 65 ° К. Образцы миозина (50–75 мкМ) были мгновенно заморожены в жидком азоте перед помещением в спектрометр. Буфер содержал 20 мМ EPPS, 6 мМ MgCl ₂ , 1 мМ EGTA и 10% глицерина (pH 8,0). Сигналы спинового эха анализировались с помощью программного пакета DeerAnalysis (24), который подгоняет моделированные сигналы DEER к данным, предполагая одно или два гауссовых распределения межзондовых расстояний (уравнение 1 ).

TR-FRET.

Флуоресценция AEDANS-миозина возбуждалась с помощью третьей гармоники микрочипового YAG-лазера с пассивной модуляцией добротности (NanoUV-355; JDS Uniphase), работающего с частотой следования импульсов 10 кГц и выбора с помощью длинного прохода 420 нм. стеклянный фильтр.Чтобы избежать эффектов анизотропии, флуоресценцию пропускали через поляризатор, ориентированный под магическим углом. Сигналы флуоресценции регистрировались после каждого лазерного выстрела с помощью модуля фотоумножителя Hamamatsu H5773-20 (время нарастания 0,78 нс) и регистрировались с помощью дигитайзера переходных процессов (Acqiris DC252) с разрешением дискретизации 0,125 нс. Функция отклика прибора (IRF) была получена с помощью рассеянного света при тех же настройках прибора, что и при измерении флуоресценции, за исключением того, что не было фильтра излучения и поляризация излучения была вертикальной.

Анализ данных TR-FRET.

Наблюдаемый сигнал флуоресценции только для донора F _Dobs ( t ) от меченого миозина был подогнан с помощью моделирования F _Dsim ( t ), состоящего из многоэкспоненциального распада F _D ( t ), свернутый с IRF: где τ _Di — времена жизни только донорной флуоресценции. Мы обнаружили, что две экспоненциальные составляющие ( n = 2 в уравнении. 2 ) было достаточно; т.е. добавление третьего компонента к подгонке не уменьшило остаток или χ ² . Для каждого биохимического состояния был проанализирован сигнал флуоресценции меченного донором-акцептором миозина перед сверткой, F _DA ( t ), предполагая, что единственное изменение в F _D ( t ) было повышенная скорость распада, вызванная переносом энергии k _T = ∫ k _Di [ρ ( r ) / R _{0 i} ] ⁻⁶ dr , где ρ ( r ) — распределение донорно-акцепторных расстояний (ур. 1 ), k _Di = 1 / τ _Di и R _{0 i} — расстояние Ферстера, определяемое (уравнение S1 , рис. S4). Наблюдаемый сигнал донорно-акцепторной флуоресценции до свертки, F _{D + A} ( t ), был принят как сумма трех членов: где X * и X ** ( X * + X ** = 1) — мольные доли миозина в состоянии до восстановления (прямая ретрансляционная спираль) и после восстановления (изогнутая ретрансляционная спираль), а X _D — мольная доля меченного только донором миозина ( X ^{D + X} DA = 1).

Наблюдаемые сигналы флуоресценции в присутствии и в отсутствие акцептора были согласованы глобально (одновременно) смоделированными выражениями в уравнениях. 3 и 6 . Интенсивности A _i , времена жизни τ _i , расстояния R * и R **, ширина FWHM * и FWHM **, а также доля X _D меченного только донором миозина связаны и изменяются одновременно. X ** (доля структурного состояния M **) варьировалась независимо для каждого сигнала в глобальной подгонке.

Подробнее см. SI Text .

Благодарности

Благодарим Юнис Сонг и Октавиана Корнеа за техническую помощь. Использованный инструмент флуоресценции с временным разрешением был вдохновлен многочисленными проницательными обсуждениями с Грегори Д. Гиллиспи из Fluorescence Innovations, Inc. Эта работа была поддержана грантами AR32961 (для DDT) и AR53562 (для YEN) Национального института здравоохранения Медицинский фонд Миннесоты (в YEN). Моделирование MD было выполнено с использованием вычислительных ресурсов института суперкомпьютеров Университета Миннесоты.

Сноски

• ¹ Кому может быть адресована корреспонденция. Электронная почта: ddt {at} umn.edu или yn {at} ddt.biochem.umn.edu

• Вклад авторов: R.V.A., D.D.T. и Y.E.N. спланированное исследование; R.V.A., Y.V.T. и Y.E.N. проведенное исследование; I.V.N., S.E.B. и M.A.T. внесены новые реагенты / аналитические инструменты; Р.В.А. и Ю. проанализированные данные; и R.V.A., D.D.T. и Y.E.N. написал газету.

• Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

• Эта статья представляет собой прямое представление PNAS.

• Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/cgi/content/full/07106/DCSupplemental.

Структурная кинетика миозина с помощью переходного FRET с временным разрешением на JSTOR