Порядок применения коэффициента бонус-малус | Порядок расчёта КБМ
Порядок применения коэффициента бонус-малус
Приобретая полис ОСАГО, автовладельцы должны разобраться в процессе вычисления его стоимости. Коэффициент бонус-малус значительно влияет на окончательную сумму страховки. Соблюдение правил безопасной езды, сведение к нулю риска аварийных ситуаций на дороге сэкономят деньги водителя при оформлении полиса. КБМ – своеобразное поощрение водителей за уверенное и безаварийное вождение.
Полис на автомобиль Определение и применение бонус-малус исходит из доступной и открытой базы данных АИС РСА, в которой хранится вся информация за предыдущие периоды. Если на каком-то этапе при переоформлении полиса страхователь заметил, что применение КБМ было завышенным, он имеет право написать заявление страховщику с просьбой пересчитать тариф и сделать возврат части платежа.
Для расчёта КБМ пользуются таблицей:
Согласно нововведениям, вступившим в силу с 1 апреля 2019 г., КБМ будет устанавливаться на 1 год и пересчитываться 01 апреля ежегодно. Его значение станет фиксированным в течение срока и будет применяться ко всем заключенным договорам обязательного страхования в этом промежутке времени.
Порядок расчета коэффициента зависит от количества водителей, указанных в договоре страхования, и устанавливается по самому «аварийному» водителю.
Проверить свой КБМ можно онлайн на сайте РСА. В ответ на запрос вы получите таблицу с данными о последней страховке, информацию о количестве страховых случаев и новый КБМ.
Применение коэффициента бонус-малус стимулирует водителей быть внимательными, соблюдать правила дорожного движения. Некоторые страховые компании используют практику поощрения клиентов, применяя заработанную скидку за безаварийную езду по ОСАГО при определении тарифа по КАСКО. Таким образом, водитель получает двойное вознаграждение и еще большую материальную заинтересованность.
Калькулятор автострахования 2020Как самостоятельно восстановить КБМ по ОСАГО — Mafin Media
Ко всем статьямИногда при расчете нового полиса ОСАГО может возникнуть ошибка:
применяется неверный коэффициент «бонус-малус» (КБМ).
Скидка за безаварийную езду при этом
пропадет, даже если у вас не было аварий. Чтобы этого не случилось, узнайте, как
предотвратить просчет и восстановить свой КБМ,
в гайде Mafin Media.
Что такое КБМ
Цена полиса ОСАГО зависит от двух основных факторов: базовой ставки страхового тарифа и коэффициентов, таких как КТ, КБМ, КО, КВС, КМ и КС. Каждый из них влияет на риск наступления страхового случая.
КБМ, или «бонус-малус» (в переводе с латинского «хороший-плохой»), поощряет безаварийную езду. При получении водительских прав КБМ равен 1, однако со временем он может увеличиваться и уменьшаться. Это зависит от того, производились ли выплаты по ОСАГО в случае ДТП по вине водителя.
Если по полису нет выплат, значение коэффициента ежегодно уменьшается на 0,05
(пока не достигнет минимального значения — 0,5).
Так, водитель с 10-летним безаварийным
стажем получает скидку на ОСАГО в размере 50% (коэффициент — 0,5).
Узнать больше о КБМ и других коэффициентах ОСАГО можно в разделе «Термины».
Почему КБМ мог измениться не в вашу пользу
При оформлении ОСАГО страховые компании обязаны делать расчет по утвержденным Банком России тарифам и проверять коэффициент КБМ. Для этого страховщики используют данные автоматизированной информационной системы (АИС), запущенной Российским Союзом Автостраховщиков (РСА). Значение КБМ автоматически корректируется ежегодно 1 апреля и не меняется до 31 марта следующего года.
Вот основные причины обнуления КБМ и потери скидки на ОСАГО:
1. Смена фамилии или имени и замена водительских прав.
! По закону
в период действия договора ОСАГО страхователь (тот, кто подписывает договор
со страховой
компанией) обязан незамедлительно сообщать страховщику об изменении сведений, указанных в договоре
страхования, в письменной форме.
В случае одновременного действия нескольких договоров следует вносить изменения в каждый из них.
2. Вы внесены сразу в несколько полисов ОСАГО.
! Ваши близкие могли вписать вас в свои полисы, и, возможно, именно тут закралась ошибка: был указан неверный коэффициент, и теперь значение вашего КБМ в базе РСА с обнуленной скидкой. Найти, в каком полисе и с какого момента произошел пересмотр, можно при помощи фильтра по месяцам в течение нескольких лет.
3. Страховая компания не передала необходимые данные в РСА.
! Обстоятельств, при которых
страховщик не заносит нужную информацию в систему, мало, а случаи такие редки. Однако
подобная ситуация может указывать на мошеннические действия. Стоит проверить не только КБМ,
но и полис на подлинность.
Как проверить свой КБМ
Сделать это можно можно бесплатно на сайте РСА. Нужно лишь ввести Ф. И. О., дату рождения, а также серию и номер действующего водительского удостоверения (если была замена прав, необходимо указать данные предыдущего документа).
Как бесплатно восстановить КБМ
Перед тем как восстанавливать КБМ, убедитесь:
✔ что за прошедший период не было страховых случаев и выплат;
✔ прошел именно год. (За каждый год безаварийной езды скидка увеличивается на 5%.)
Шаг 1: Установите, с какого момента
и в какой страховой компании произошла потеря КБМ на сайте РСА. Сохраните историю изменений
вашего коэффициента (достаточно распечатать страницу сайта).
Шаг 2: Найдите старые страховые полисы: в них есть отметка о вашем КБМ. Сделайте копии этих документов.
Шаг 3: При необходимости подготовьте справку об отсутствии выплат по ущербу, документы, подтверждающие смену фамилии, копии старого и нового водительского удостоверения.
Шаг 4: Сперва обратитесь с жалобой в страховую компанию. Если страховщик был ликвидирован, то в РСА и ЦБ РФ.
! С декабря 2015 года
применяется упрощенная схема, по которой в случае несогласия страхователя с примененным
значением КБМ страховая компания обязана проверить коэффициент, и, если полученное значение
не совпадает с примененным, страховщик применяет новое. Именно оно будет учитываться как
в текущем договоре, так и в последующих (при отсутствии заявленных убытков).
ОСАГО — Армеец
Страница изменена: 30.09.2021 15:27:08
Страховой полис «ОСАГО» — простое и надежное решение для каждого водителя
Страховой полис «ОСАГО» — максимально простой способ уберечься от расходов на возмещение ущерба при ДТП, в котором виноваты вы.
В отличие от КАСКО полис ОСАГО является обязательным для всех водителей. Объектом страхования является гражданская ответственность, то есть страховая компания покроет стоимость вреда, причиненного в результате ДТП по вашей вине. Стоимость полиса ОСАГО рассчитывается индивидуально и зависит от таких факторов как общий стаж вождения, территориальный коэффициент, мощность автомобиля, история безаварийного вождения, количество водителей, вписанные в страховой полис.
Также на нашем сайте вы можете оформить электронный полис ОСАГО онлайн.
Внимание! Страховое мошенничество!
АО СК «Армеец» выявлен факт страхового мошенничества, когда неизвестные лица, представляясь сотрудниками Компании, предлагают гражданам, осуществляющим посредническую деятельность по заключению договоров страхования, заключить агентские договоры и реализовывать электронные полисы ОСАГО. При этом, в целях убедительности, они ведут длительную переписку от имени Компании, а после подписания агентского договора, предоставляют Логин и Пароль к сфальсифицированному сайту (базе) АО СК «Армеец».
В случае поступления подозрительных предложений по сотрудничеству, либо выявления поддельных полисов ОСАГО (подлинность полиса можно проверить здесь), просим сообщать данные факты в Службу безопасности Компании по телефону 8 (843) 204-05-06 (вн. 1355).
ВНЕСЕНИЕ ИЗМЕНЕНИЙ И ДОСРОЧНОЕ ПРЕКРАЩЕНИЕ
Для внесения изменений в договор страхования, а так же для досрочного прекращения договора необходимо обратиться в ближайший офис АО СК «Армеец», либо направить оригинал заявления и копии документов, послужившие основанием для внесения изменений/досрочного прекращения договора, посредством почтовой связи по адресу: 420073, РТ, г. Казань, ул. Шуртыгина, д. 24.
По электронной почте заявления на внесение изменений и досрочное прекращение договоров страхования не принимаются!
ВОЗВРАТ ДЕНЕЖНЫХ СРЕДСТВ
При ошибочном переводе денежных средств необходимо заполнить заявление (DOC, PDF) и выслать скан-копии заполненного заявления и паспорта (страницы с фотографией и пропиской) на адрес: armeec@armeec.
ruВОССТАНОВЛЕНИЕ КБМ
Проверить свой КМБ можно тут.Если вы не согласны с примененным КБМ по действующему договору ОСАГО, либо при заключении нового договора, скачайте и заполните одно из заявлений на пересмотр КБМ и вышлите его на адрес [email protected]
Заявление на перерасчет КБМ и заявление на возврат денежных средств по одному водителю
Заявление на перерасчет КБМ и заявление на возврат денежных средств, если полис — без ограничения количества лиц
Телефон горячей линии
ОСАГО
Европротокол – это процедура упрощенного оформления документов о дорожно-транспортном происшествии (далее – ДТП) без участия уполномоченных сотрудников полиции. Для оформления ДТП по процедуре Европротокола, участники ДТП заполняют бланк извещения о ДТП, выданный при покупке полиса ОСАГО.
Оформление ДТП в рамках Европротокола возможно при выполнении следующих условий:
- гражданская ответственность участников ДТП застрахована в соответствии с Федеральным законом об ОСАГО №40-ФЗ;
- ДТП произошло в результате взаимодействия (столкновения) 2 (двух) ТС (включая ТС с прицепами к ним) и в результате ДТП вред причинён только указанным ТС;
- у участников ДТП отсутствуют разногласия относительно обстоятельств ДТП и повреждений ТС, что зафиксировано в Извещении о ДТП.
В случае наличия разногласий, информация о них должна быть отражена в Извещении о ДТП и сведения о ДТП переданы в РСА посредством приложений «ДТП. Европротокол», «Помощник ОСАГО» либо посредством системы ГЛОНАСС (далее – средства технического контроля), установленной на ТС одного из участников ДТП.
В случае наличия разногласий, информация о них должна быть отражена в Извещении о ДТП и сведения о ДТП переданы в РСА посредством приложений «ДТП. Европротокол», «Помощник ОСАГО» либо посредством системы ГЛОНАСС (далее – средства технического контроля), установленной на ТС одного из участников ДТП.Важно! Если перечисленные выше требования не выполняются, то оформление Европротокола невозможно, в этом случае необходимо обратиться в ГИБДД (тел. 102, 112, 911) для оформления документов о ДТП.
Заполнение одного экземпляра Извещения о ДТП участниками ДТП
Бланк извещения о ДТП состоит их 2 (двух) страниц, сведения лицевой страницы копируются на вторую страницу. Участники совместно заполняют лицевую страницу Извещения о ДТП, затем разделяют две страницы Извещения о ДТП. Каждая страница – экземпляр виновного лица и потерпевшего. Каждый участник заполняет оборотную страницу своего экземпляра Извещения о ДТП и направляет своему Страховщику по ОСАГО в течение 5 (пяти) рабочих дней с момента оформления ДТП.
Извещение о ДТП может быть составлено в электронном виде посредством приложения «Помощник ОСАГО» при наличии одновременно следующих обстоятельств (помимо указанных выше):
- ДТП произошло на территории Москвы, Московской области, Санкт-Петербурга, Ленинградской области, Республики Татарстан;
- владельцами ТС, участвующих в ДТП, являются физические лица;
- у участников ДТП отсутствуют разногласия.
Размер выплаты по Европротоколу
Если ДТП произошло до 01.10.2019
(предусмотрено составление Извещения о ДТП только в бумажном виде):
- До 100 000₽ при отсутствии разногласий у участников ДТП.
- До 100 000₽ при наличии разногласий у участников ДТП и фотофиксации сведений о ДТП с помощью средств технического контроля и передачи сведений в РСА.
- До 400 000₽ при отсутствии разногласий у участников ДТП и фотофиксации сведений о ДТП с помощью средств технического контроля и передачи сведений в РСА, если ДТП произошло в Москве, Московской области, Санкт-Петербурге, Ленинградской области.
Если ДТП произошло 01.10.2019 или позднее
Составление Извещения о ДТП в бумажном виде в любом регионе РФ:
- До 100 000₽ при отсутствии разногласий у участников ДТП.
- До 100 000₽ при наличии разногласий у участников ДТП и фотофиксации сведений о ДТП с помощью средств технического контроля и передачи сведений в РСА
- До 400 000₽ при отсутствии разногласий у участников ДТП и фотофиксации сведений о ДТП с помощью средств технического контроля и передачи сведений в РСА.
Составление Извещения о ДТП в электронном виде (возможно, если ДТП произошло в Москве, Московской области, Санкт-Петербурге, Ленинградской области, Республике Татарстан):
- До 100 000₽ при составлении Извещения о ДТП с помощью приложения «Помощник ОСАГО» (без фотофиксации поврежденных ТС).
- До 400 000₽ при составлении Извещения о ДТП с помощью приложения «Помощник ОСАГО» (с фотофиксацей поврежденных ТС) и передачи сведений в РСА.
Застраховать с ошибками: что показал новый сервис по проверке ОСАГО | Статьи
Автовладельцы могут получить штраф или вообще лишиться страховой выплаты, если при оформлении ОСАГО были указаны неверные данные. Так поступают недобросовестные посредники с целью оформить полис дешевле, а с автовладельца получить обычную сумму. Российский союз автостраховщиков (РСА) запустил сервис, с помощью которого автовладельцы самостоятельно могут проверить указанные в базе АИС ОСАГО сведения. Что делать, если в полисе обнаружились ошибки, разбирались «Известия».
Пробить по базе
Раньше на сайте РСА можно было проверить, является ли полис действующим на момент ДТП. С помощью нового сервиса автовладелец сможет узнать, какие именно параметры были указаны при оформлении полиса — марка, модель и категория транспортного средства, мощность, узнать коэффициент бонус-малус, регион использования автомобиля, количество водителей, допущенных к управлению, и т.д. И, естественно, его цену.
В РСА сообщили «Известиям», что ограничились добавлением ключевых параметров, которые обычно искажаются недобросовестными посредниками и существенно влияют на цену полиса ОСАГО.
Что показала проверка
Кроме того, в сервисе указаны собственник и страхователь транспортного средства. И хотя все буквы, кроме первой, закрыты звездочками, имя, отчество и год рождения позволяют сопоставить указанных в остальных документах лиц. Это, как и срок действия страховки, важная информация, если ДТП уже произошло и у вас есть сомнения относительно другого участника аварии.
Между тем проверка редакцией «Известий» девяти машин и одного мотоцикла оставила много вопросов. Например, корректный результат дает поиск по серии и номеру полиса, а также по VIN автомобиля. Если искать по госномеру, система в большинстве случаев ничего не находит либо отображает данные старого полиса и прежних владельцев машины.
Фото: ИЗВЕСТИЯ/Зураб Джавахадзе
Автоэксперт Игорь Моржаретто считает, что новый сервис еще будут дорабатывать, и положительно оценил его появление.
«Только когда покупаешь новый полис, выясняется, что у тебя странный какой-то КБМ. Начинаешь выяснять самостоятельно, а для этого нужен источник информации, нужна обратная связь, где я могу сказать: «Вы, ребята, неправы, у меня по-другому», — рассказал он.
Без номера и категории
Обычно госномер не попадает в базу, если автовладелец оформил ОСАГО до того, как поставил автомобиль на учет в ГИБДД. Однако у единственного проверенного мотоцикла не оказалось ни госномера, хотя транспортное средство было поставлено на учет, ни марки и модели, ни мощности. А в качестве категории было указано загадочное: «0 Прочее (категория «с»)». Даже в РСА не смогли объяснить этот термин. В Союзе пообещали дать ответ технического специалиста, но на момент сдачи материала комментарий не предоставили.
Фото: ИЗВЕСТИЯ/Дмитрий Коротаев
Отсутствие госномера автомобиля в базе теоретически грозит добросовестному автовладельцу штрафом, когда автоматическая проверка ОСАГО с помощью камер будет запущена.
Проблемы могут возникнуть, подтвердили в РСА и попросили всех, получивших полис ОСАГО до регистрации ТС, сообщить в свою страховую компанию о присвоенном автомобилю госномере.
Внимание, работают мошенники
РСА и страховщики фиксирует большое количество попыток оформить полис ОСАГО с недостоверными сведениями.
«В данном случае стоит говорить о недобросовестных «посредниках», которые, используя незнание автовладельцев, оформляют полис ОСАГО онлайн и вводят недостоверные сведения, например цель использования, мощность и т.д., снижают стоимость полиса, а затем передают клиенту иной полис с иной стоимостью, разницу присваивая себе. В практике «Согласия» есть такие прецеденты, подобные действия «посредников» носят мошеннический характер и наносят вред потребителю и репутации страховщика», — рассказала «Известиям» директор судебно-правового департамента страховой компании «Согласие» Анна Полина-Сташевская. И посоветовала оформлять полис е-ОСАГО, не требующий привлечения посредников.
Президент РСА Игорь Юргенс отметил, что в настоящее время в системе АИС ОСАГО 2.0 работают фильтры, позволяющие отсеивать попытки оформить полис ОСАГО, указав при оформлении заведомо неверные данные.
Офис страховой компании
Фото: ТАСС/Сергей Николаев
«Однако никакие технические решения не могут на 100% защитить от мошенничества», — отметил он.
И действительно, в одном из проверенных «Известиями» полисов в графе «Цель использования» было указано «Учебная езда», хотя машина используется в личных целях. Почему посредник указал ее при оформлении полиса — загадка.
«Указание в графе «Цель использования» варианта «Учебная езда» в настоящее время не влияет на формирование страховой премии по ОСАГО, а также на получение страховой выплаты в случае страхового события. Однако стоит быть внимательным, возможны случаи, когда похожая ошибка может привести к регрессу. Например, если у автомобиля есть лицензия такси, но в страховом полисе указано, что транспортное средство используется для личных целей, в случае аварии страховая компания может выставить регресс лицу, причинившему вред», — рассказали в пресс-службе «Альфастрахования».
Кроме того, если полис окажется оформленным на другую машину или другого страхователя, пострадавшему в ДТП вообще могут отказать в страховой выплате.
Ваш полис недействителен
Какой процент неверных сведений в полисе сделает его недействительным? Для договоров ОСАГО нет такого понятия — «процент неправильно указанных данных», уточнили в РСА. В Союзе добавили, что в каждом конкретном случае необходимо разбираться, была ли допущена опечатка или случайная ошибка либо данные были введены заведомо неверно.
Федеральный закон об ОСАГО, Положение о правилах ОСАГО не содержат в себе указаний о проценте неправильных сведений, содержащихся в полисе ОСАГО, чтобы признать его недействительным, отметил ведущий юрист Европейской юридической службы Орест Мацала. По его словам, чтобы досрочно прекратить действие договора ОСАГО либо вовсе признать его недействительным, необходимо установить, что недостоверные сведения были представлены намеренно и это повлекло за собой необоснованное снижение стоимости ОСАГО.
Фото: ТАСС/Ведомости/Евгений Разумный
«Любые недостоверные сведения, которые непосредственно повлияли на размер страховой премии, позволяют страховщику досрочно прекратить договор страхования либо в дальнейшем предъявить регрессные требования в соответствии со ст. 14 закона об ОСАГО. Неправильно указанный VIN при совокупности с иными обстоятельствами свидетельствует о недостижении согласия между сторонами о конкретном имуществе, при использовании которого страхуется ответственность владельца транспортного средства, аналогичную позицию высказал ВС РФ в постановлении пленума ВС РФ № 58», — добавила Анна Полина-Сташевская.
Пишите письма
Что делать, если при проверке полиса ОСАГО в базе обнаружились неверные сведения? Следует обратиться в страховую компанию и написать письменное заявление, чтобы изменения в договоре были сделаны. Если установлено, что имело место мошенничество, эксперты и страховщики рекомендуют обратиться и в правоохранительные органы.
Кроме того, у автовладельца есть шанс получить компенсацию через суд, считает Орест Мацала.
«Поскольку страхование ОСАГО — это услуга, при некачественно оказанной услуге, в том числе и при заключении договора, можно требовать компенсации всех убытков и возмещения морального вреда в соответствии со ст. 15 и 29 закона «О защите прав потребителей», — отметил ведущий юрист Европейской юридической службы.
РЕГИСТРАЦИЯ ЗАПРОСОВ НА ПРОВЕРКУ ПРАВИЛЬНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ КБМ
«ПРОВЕРКА ПРАВИЛЬНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ КБМ»
ВОПРОСЫ И ОТВЕТЫ:
1. Что такое КБМ и чем он полезен клиенту?
КБМ (коэффициент бонус-малус, скидка за безаварийную езду) — один из показателей, влияющих на стоимость полиса ОСАГО. В зависимости от наличия/отсутствия страховых выплат коэффициент может быть повышающим или понижающим. Данный коэффициент сохраняется как при продлении ОСАГО у текущего страховщика, так и при переходе к другому.
2. Вы поменяли водительское удостоверение, как не потерять КБМ?
В случае замены водительского удостоверения Страхователь должен сообщить об изменениях Страховщику как можно скорее, в этом случае КБМ не будет утерян.
3. Какой КБМ применяется, если договор ОСАГО предусматривает неограниченный список лиц, допущенных к управлению транспортным средством?
Для договоров обязательного страхования, не предусматривающих ограничение числа лиц, допущенных к управлению транспортным средством, владельцем которого является физическое лицо, страховой тариф рассчитывается с применением КБМ, равного 1, проверка правильности применения КБМ не предусмотрена.
4. У меня перерыв в страховании ОСАГО, возможно ли восстановить КБМ?
Перерыв в страховании более не влияет на КБМ, но только если такой перерыв был после 01.04.2019. Если перерыв был до этой даты, то КБМ обнуляется (становится равным 1).
5. Что делать, если я не согласен с полученным значением КБМ после проверки?
Результат проверки КБМ+ устанавливается при проведении комплексной проверки всей страховой истории в отношении субъекта на платформе РСА, в связи с чем у Страховщика отсутствует возможность повлиять на установленное значение. Если после поверки КБМ+ Вы не согласны с полученным значением КБМ, рекомендуем обратиться в РСА для проведения дополнительной проверки.
6. Стоимость полиса ОСАГО зависит только от наличия скидки (КБМ)?
Нет, на стоимость договора кроме КБМ могут влиять другие коэффициенты, установленные Центральным Банком Российской Федерации от 24 08..2020 N 5515-У «О предельных размерах базовых ставок страховых тарифов и коэффициентах страховых тарифов, требованиях к структуре страховых тарифов, а также порядке их применения страховщиками при определении страховой премии по обязательному страхованию гражданской ответственности владельцев транспортных средств».
Если КБМ не изменился, а стоимость полиса стала выше, возможно, изменилась базовая ставка — вы можете увидеть все примененные коэффициенты в разделе 7 вашего страхового полиса.
7. Сколько длится проверка КБМ+?
Мы проверим и направим Ваши документы в РСА в течение 3-х дней. После этого РСА проведет комплексную проверку страховой истории в срок до 5 рабочих дней, начиная со дня, следующего после принятия заявления.
8. У меня остались вопросы, куда можно обратиться?
В случае возникновения вопросов, касающихся правильности применения КБМ, Вы можете задать их по адресу [email protected]. Наши специалисты помогут Вам разобраться в тонкостях КБМ
Проверить »
Все, что нужно знать о КБМ
В расчете стоимости договора обязательной автостраховки (ОСАГО) учитывается много факторов, среди которых водительский опыт, возраст, регион, мощность двигателя и даже аккуратность водителя. Да, поведение водителя отражается в полисе автогражданской ответственности и даже влияет на его стоимость. Делается это при помощи коэффициента страховых тарифов под названием бонус-малус, который косвенно отражает страховую историю. Давайте разберем, что означает КБМ, откуда он берется, как он рассчитывается и как помогает экономить средства или наоборот нести убытки…
Что за термин КБМ
Все без исключения страховые компании рассчитывая стоимость автостраховки в стандартной формуле обязательно применяют КБМ. Это коэффициент, который наглядно показывает насколько безаварийно ездит водитель. КБМ позволяет получить либо скидку, за прилежное управление ТС, либо надбавку к стоимости за автоаварию, совершенную по его вине. Это своего рода инструмент поощрения/наказания водителей. Благодаря бонусу-малусу можно существенно сэкономить при оформлении страховки, но для этого не только водителю-страхователю из года в год нужно ездить без ДТП, а и всем лицам, попавшим в полис. Почему? Узнаем далее.
Кому еще важен КБМ
Множитель «бонус-малус» – показатель, который используется для мотивации водителей. Ведь ни для кого не секрет, что страховые компании не заинтересованы в многочисленных ДТП и страховых выплатах. Их интерес заключается в наращивании количества застрахованных водителей, которые аккуратно управляют ТС и попадают в автопроишествия в самых редких случаях. Именно для них путем применения в стандартной формуле множителя КБМ страховая компания проявляет свою лояльность и снижает общую стоимость ОСАГО. Как видим, этот показатель важен и для страхователя, и для страховщика.
Кто регулирует КБМ
КБМ наряду со всеми остальными тарифами и страховыми коэффициентами регулирует Центральный банк России. Последние изменения дотированы 28.07.2020 в указании Банка РФ № 5515-У (http://cbr.ru/queries/unidbquery/file/90134/1098)
Как узнать свой КБМ
Существует два способа это сделать.
- При помощи онлайн-сервиса союза автостраховщиков России (АИС РСА). Он представляет собой базу данных (БД) с информацией обо всех транспортных средствах и водителях, когда-либо заключавших полисы ОСАГО. Также в базу вносится информация о возмещениях, выплатах и автопроишествиях, в которых указанный водитель был признан виновником. Согласно закону каждая страховая компания обязана вносить соответствующие данные в эту БД, чтобы на этапе заключения нового полиса можно было проверить текущее значение КБМ. Если предшествующая страховая компания, с который был ранее заключен договор, исправно занесла информацию в АИС, то каждый желающий сможет ее увидеть. Узнать свой показатель можно здесь — https://autoins.ru/osago/raschet-stoimosti-osago/proverit-kbm/. Согласившись на обработку персональных данных, система перенаправит на страницу https://dkbm-web.autoins.ru/dkbm-web-1.0/kbm.htm, где необходимо корректно заполнить все пункты. Данная информация предоставляется бесплатно.
- При помощи онлайн-калькуляторов. Они есть на сайтах многих страховых компаний. Это либо калькуляторы по расчету общей стоимости автогражданки, либо спец.калькуляторы КБМ, которые разрабатываются на основе данных специальной таблицы и данных, полученных автоматически из базы АИС.
Какие виды КБМ различают
- КБМ водителя при ограниченном полисе ОСАГО. Когда страхователь страхует ответственность целого перечня водителей, в полисе записываются их ФИО и номера их водительских прав. КБМ считают у каждого водителя по его личной истории страхования. Для расчета общей стоимости ОСАГО берется максимальный или простыми словами «найхудший» показатель.
Например, в полисе КБМ мужа-страхователя составляет 0,5, а жены 1,5, скидка на такой полис предоставлена не будет. А наоборот для расчета будет взят КБМ=1,5, и полис значительно подорожает.
- КБМ собственника при неограниченном полисе ОСАГО. Если застраховать транспорт без ограничения кол-ва водителей, то их КБМ не будет браться во внимание. По умолчанию он всегда будет равен 1.
Когда применяется этот множитель
Каждый раз, когда между страхователем и страховщиком заключается «автогражданка». КБМ берется из данных ОСАГО за предыдущий период. Он увеличивается, если были страховые выплаты и уменьшается, если аварий не зафиксировано.
В каких случаях КБМ равен 1 или вовсе не применяется
Когда водитель первый раз оформляет страховку, то его КБМ равно 1, то есть никак не влияет на стоимость заключаемого договора страхования.
Коэффициент может стать ложным, при смене данных водителя, например ФИО, места регистрации или прав. Когда получает новый документ, он обязан сообщить об этом в страховую, которая в свою очередь внесет изменения в БД и автостраховку. Если не сделать этого, то реальные данные будут расходиться с полисом, а это может повлечь за собой ряд неприятностей, в том числе это может привести к потери коэффициента.
Еще коэффициент может быть неправильным, если страховой менеджер сделал ошибку или несвоевременно внес данные в единую БД. Чтобы избежать таких ситуаций, лучше время от времени проверять свой КБМ самостоятельно в общей онлайн-базе.
Как вернуть правильный коэффициент бонус-малус
Для сверки актуальности КБМ в страховке в первую очередь нужно выяснить текущий коэффициент бонус-малус. Для этого — заполняется заявка на официальном сайте РСА, в которой указывается вся необходимая информация. После этого система отразит на экране вашего монитора всю историю водителя, его КБМ и покажет, если он рассчитан некорректно.
Затем водитель может самостоятельно обратиться в свою страховую для того, чтобы восстановить показатель до нужного параметра. Либо это можно сделать прямо в онлайн-режиме на портале https://autoins.org/vosstanovit-kbm.
Как считается КБМ при заключении полиса
У каждого водителя есть свой личный КБМ. Когда он впервые оформляет автогражданку, то автоматом ему присваивается коэффициент = 1 и в общей формуле расчета «дебютной» страховки, это не будет играть никакой роли. Через год у водителя уже сформируется так называемая «история езды». Если он аккуратен и за текущий год не стал виновником автопроишествия, его коэффициент снизится на 5%, то есть станет 0,95. Если же за год клиент попал дважды в ДТП по собственной вине, то его множитель значительно повысится, и стоимость полиса будет просчитываться по КБМ=2,45. Как говорилось выше, если же в ОСАГО фигурирует ряд водителей, то бонус-малус принимается по максимальному значению.
Зная свой последний КБМ и количество ДТП с возмещениями в текущем году, по таблице можно наглядно увидеть каким будет множитель для расчета в следующем году.
Минимальный показатель по КБМ дает максимальную скидку. К примеру, КБМ 0,5 соответствует скидке в половину стоимости — 50%, а КБМ 2,45 – надбавке к сумме ОСАГО на 145%.
Простой пример, если водитель ни разу не стал виновником автопроишествия со дня получения прав в течение трех лет, то его КБМ будет равен 0,85, что даст ему возможность получить скидку 15%. Но если за четвертый год водительского стажа, он станет участником сразу двух аварий, его коэффициент взлетит до отметки 1,4.
Использование наличных средств в гуманитарной помощи
Использование наличных денег и ваучеров в рамках гуманитарной помощи значительно увеличилось за последнее десятилетие. Это обязательство в рамках Большой сделки между некоторыми из крупнейших мировых доноров и гуманитарных организаций, цель которой — предоставить больше средств в руки нуждающимся людям. Интеграция инвалидов также стала ключевой частью международных гуманитарных рамок, таких как Хартия по вовлечению людей с ограниченными возможностями в гуманитарную деятельность.В то время как предоставление наличных средств является способом предоставления помощи в форме, отвечающей реальным потребностям людей, пострадавших от стихийных бедствий, остаются препятствия для участия людей с ограниченными возможностями в таких программах.
В недавнем исследовании мы изучили, какие практики делают денежные переводы максимально инклюзивными. Мы изучили программы денежных переводов (CTP) в шести гуманитарных мерах: Пакистан, Бангладеш, Нигер, Индонезия, Зимбабве и Филиппины с 2014 по 2019 год. Используя подход, основанный на исследовании конкретного случая, на основе Eisenhardt (1989), мы подробно задокументировали шесть ответов чтобы понять, могли ли люди с ограниченными возможностями в равной степени участвовать в программах и получать от них пользу, и какие методы реализации программ помогали им в этом или мешали им.
Рассмотрены четыре механизма выдачи наличных:
- Наличные деньги: бумажные деньги
- Банковский перевод: электронный перевод через поставщика финансовых услуг на банковский счет
- Беспроводной перевод: электронный перевод через поставщика финансовых услуг — получатели снимают наличные через аффилированного денежного агента с соответствующим идентификационным номером
- Мобильная наличность: электронный перевод на мобильные телефоны получателя в форме электронной наличности
Мы определили пять принципов для программирования с учетом инвалидности (на основе набора CBM Disability Inclusive Development Toolkit) и использовали их для кодирования каждого из 19 шагов цикла программирования денежных переводов Партнерства по обучению наличным деньгам (инструментарий качества программы CaLP) для инклюзивные практики.Используя перекрестное сравнение, мы определили образцы успешной инклюзивной практики.
На что указывают наши данные…
- Все механизмы доставки наличных имеют определенные физические препятствия для людей с ограниченными возможностями, но некоторые из них более доступны, чем другие. Доставка наличными через мобильный телефон является наиболее доступной, поскольку средства переводятся напрямую в электронные кошельки получателя без необходимости физического доступа к точке выдачи наличных. Однако прямые денежные переводы более доступны, чем банковские или электронные переводы, поскольку организации-исполнители могут в большей степени контролировать физическую доступность прямого распределения наличных, чем доступность банкоматов или неформальных банковских точек.
- Инклюзивные программы должны включать поддержку людей с ограниченными возможностями для преодоления физических и институциональных барьеров доступности. Для раздачи прямых денежных средств выбираются физически доступные точки раздачи. Для доставки банковским переводом включение требует открытия банковского счета или получения документов, удостоверяющих личность, а также доступа к точкам распределения банка. Для мобильных наличных должны быть предоставлены мобильные телефоны с функциями универсального доступа.
- Существует высокий риск того, что не удастся идентифицировать затронутые домохозяйства с инвалидами, которые имеют право на денежную помощь, несмотря на четкие критерии адресности, связанные с инвалидностью.Эффективность определения отвечающих критериям домохозяйств повышается за счет участия лиц с ограниченными возможностями и организаций лиц с ограниченными возможностями (OPD) в адресной деятельности.
… в сравнении с другими исследованиями
Мы выдвинули наши выводы против Leduc et al. (2016), которые проанализировали существующую литературу, касающуюся инклюзивных гуманитарных денежных программ. Что касается их рекомендаций по обеспечению включения инвалидности в денежные переводы, мы можем сделать некоторые соответствующие выводы.
- Наше исследование подтверждает важность использования OPD для выявления лиц с ограниченными возможностями. Мы также предлагаем, чтобы наделение лиц с ограниченными возможностями формальных ролей и обязанностей в процессе адресности повысило эффективность определения соответствующих критериям домохозяйств.
- Наши результаты подтверждают, что индивидуальная поддержка необходима в значительном количестве случаев, чтобы люди с различными видами инвалидности могли понять информационные материалы о способах доставки денежных средств, если материалы не предоставляются в доступных форматах (т.е. доступны для слепых и глухих и доступны в удобном для чтения виде для лиц с умственными недостатками или нарушениями обучаемости).
- Leduc et al. предполагают, что физический и сенсорный доступ к точкам распределения жизненно важен. Мы считаем, что институциональная доступность также имеет решающее значение. Например, открытие банковского счета может сопровождаться требованиями, которые трудно выполнить для людей с ограниченными возможностями, такими как предоставление действительного удостоверения личности или воспроизведение подписи. Хотя в определенных ситуациях Leduc et al.рекомендуют выбрать доверенное лицо для снятия средств с лиц с ограниченными возможностями, наши результаты показывают, что существует реальный риск незаконного присвоения денежных переводов членами семьи или опекунами, если контроль над доступом и использованием денежных средств не передается лицу с ограниченными возможностями. сами инвалиды.
Заключение
Ключевой вывод этого исследования заключается в том, что инклюзивное ОСАГО невозможно при обычном ведении бизнеса. Факты показывают, что, если организации не пересмотрят свои подходы, мы по-прежнему не сможем идентифицировать людей с ограниченными возможностями в ОСАГО.Им по-прежнему будет трудно, если вообще возможно, получить доступ к распределению денежных средств, и мы можем подвергнуть их рискам защиты. Нам необходимо сделать значительные инвестиции в доступность наших программ ОСАГО и в особую поддержку нуждающимся в ней лицам, встроенную и заложенную в наши программы с самого начала.
Скачать PDFОлигомеризация и связывание углеводов глюканфосфатаз
Anal Biochem. Авторская рукопись; доступно в PMC 15 декабря 2019 г.
Опубликован в окончательной отредактированной форме как:
PMCID: PMC6233729
NIHMSID: NIHMS1509505
Savita Sharma
a x, Кафедра молекулярной и клеточной биохимии, Университет Кейтона KY 40536
Карл Д.Vander Kooi
a Департамент молекулярной и клеточной биохимии, Университет Кентукки, Лексингтон, штат Кентукки 40536
Мэтью С. Джентри
a Департамент молекулярной и клеточной биохимии, Университет Кентукки, Лексингтон 9003, KY 40536 9 Craig W. Vander Kooi
a Департамент молекулярной и клеточной биохимии, Университет Кентукки, Лексингтон, штат Кентукки, 40536
b Центр структурной биологии, Университет Кентукки, Лексингтон, штат Кентукки 40536
a Департамент Молекулярная и клеточная биохимия, Университет Кентукки, Лексингтон, штат Кентукки, 40536
b Центр структурной биологии, Университет Кентукки, Лексингтон, штат Кентукки 40536
* Кому следует обращаться: 741 South Limestone Ave, BBSRB B175, Lexington, KY 40536, телефон: (859) 323-8418, факс: (859) 257-2283, [email protected]. Окончательная отредактированная версия этой статьи издателем доступна на сайте Anal Biochem. См. другие статьи в PMC, в которых цитируется опубликованная статья.Abstract
Глюканфосфатазы представляют собой уникальное подмножество семейства фосфатаз, которые связываются с углеводными субстратами и дефосфорилируют их. Члены семьи встречаются в различных организмах, от одноклеточных красных водорослей до людей. Природа их функциональной олигомеризации была источником значительных споров. Мы демонстрируем, что человеческий белок лафорин ведет себя аберрантно при проведении анализа методом эксклюзионной хроматографии (SEC) из-за взаимодействия с углеводной матрицей.Это взаимодействие усложняет анализ мутаций лафорина при болезни человека. Здесь мы показываем, что SEC с многоугловым статическим светорассеянием (SEC-MALS) обеспечивает метод надежного определения состояния олигомеризации лафорина и вариантов лафорина. Мы также проанализировали глюканфосфатазы из фотосинтезирующих организмов, чтобы определить, было ли это взаимодействие характерным для всех глюканфосфатаз. Было обнаружено, что избыток крахмала-четыре (SEX4) из зеленых растений не имеет значительного взаимодействия с матрицей и вместо этого существует в виде мономера.Напротив, Cm-лафорин из красных водорослей существует в виде мономера в растворе, но все же проявляет значительное взаимодействие с матрицей. Эти данные демонстрируют диапазон поведения олигомеризации членов семейства глюканфосфатаз и устанавливают SEC-MALS в качестве надежной методологии для количественной оценки и сравнения состояний олигомеризации между различными белками и вариантами белков в этом семействе.
Ключевые слова: SEC-MALS, глюканфосфатаза, лафорин, олигомеризация
Графический реферат
Введение
Глюканфосфатазы являются членами семейства фосфатаз двойной специфичности (DSP) [1].Их субстратами являются фосфорилированные углеводы, и они действуют как ключевые регуляторы углеводного обмена. Глюканфосфатазы из различных царств жизни были идентифицированы на основании присутствия доменов DSP и модуля связывания углеводов (CBM) [2]. Глюканфосфатаза лафорин человека является критическим регулятором метаболизма гликогена, а мутации в гене лафорина приводят к болезни Лафора (LD), разрушительной, фатальной, аутосомно-рецессивной ювенильной эпилепсии [3]. Глюканфосфатазы растений имеют решающее значение для метаболизма крахмала, и потеря приводит к фенотипу избытка крахмала [4].
Глюканфосфатазы из разных царств действуют на разные углеводные субстраты и обладают различной архитектурой доменов (). Лафорин позвоночных, типичным примером которого является человеческий белок, Hs-лафорин, обладает N-концевым углеводно-связывающим доменом CBM20 и C-концевым доменом DSP. Глюканфосфатазы зеленых растений, типичным представителем которых является Arabidopsis thaliana (At) SEX4, обладают N-концевым целевым пептидом хлоропласта (cTP), DSP, CBM48 и специфичным для растений C-концом (CT) [5]. Зеленые растения дополнительно содержат две другие глюканфосфатазы, Like-SEX4 (LSF) 1 и LSF2 [6].Красные водоросли, типичным примером которых является Cyanidioschyzon merolae (Cm) -лафорин, содержат вариабельную N-концевую область, которая, как предполагается, внутренне неупорядочена, за которой следуют два CBM20 и C-концевой домен DSP. Из-за идентичности домена и организации было выдвинуто предположение, что белки позвоночных и красных водорослей наиболее похожи [2]. Однако, поскольку они действуют на разные субстраты и разные комбинации доменов и структуру, сходство и различие между функцией глюканфосфатаз из разных царств еще предстоит определить.
Схема домена глюканфосфатаз. Для ферментов из разных царств характерны разный тип домена и организация, количество аминокислот указано по горизонтальной оси. Типы доменов включают в себя: модуль связывания углеводов (CBM), фосфатазу двойной специфичности (DSP), нацеливающий пептид на хлоропласт (cTP) и C-конец (CT).
Лафорин — многодоменный и многофункциональный белок. Предыдущие исследования выявили ключевые аспекты функциональности лафорина, включая связывание углеводов, белковые взаимодействия, каталитическую активность и димеризацию.Были дебаты относительно равновесия, регуляции и функции различных олигомеров лафорина [7-9]. Недавние исследования продемонстрировали структурную основу стабильной димеризации в растворе, опосредованной доменом DSP, и показали, что мутации, вызываемые болезнью человека, были обнаружены в димере. интерфейс и вредны для олигомеризации белков [10]. Этот результат мотивировал исследования димеризации лафорина и разработку методов для надежного определения состояния олигомеризации мутаций пациента.Мы демонстрируем, что SEC-MALS позволяет надежно определять димеризацию лафорина и хорошо подходит для оценки олигомеризации мутаций пациента у человека, критически отделяя связывание углеводов от олигомеризации. Также была проанализирована олигомеризация глюканфосфатаз из других царств жизни и было обнаружено, что глюканфосфатазы из других царств существуют в мономерной форме. Эти данные устанавливают надежный метод оценки различного поведения при олигомеризации глюканфосфатаз и вариантов из разных царств.
Материалы и методы
Экспрессия и очистка белка
Дикий тип (WT) и мутантный лафорин человека [10], SEX4 [5] и SEX4ΔCBM [11] были экспрессированы и очищены, как сообщалось ранее. Cm-лафорин (домены 123, остатки 157-532 C480S) и конструкции субдоменов, линкер CBM (домены 12l, остатки 157-379), CBM (домены 12, остатки 157-356) и DSP (домены 3, остатки 379 -532 C480S) были экспрессированы из pET28b в штамме E. coli Rosetta-2 (DE3) (Millipore Sigma, Burlington, MA).Клетки выращивали в Terrific Broth до OD 600 1,5, подвергали воздействию холодового шока в течение 15 минут, индуцировали 1 мМ IPTG и выращивали в течение ночи при 16 ° C. Осадки клеток собирали и замораживали при -20 ° C. Клетки лизировали с использованием лизоцима и обработки ультразвуком. Первоначальную очистку выполняли с помощью аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом (IMAC) со смолой HIS-Select HF (Millipore Sigma, Сент-Луис, Миссури). Белок загружали и промывали 20 мМ Трис, 100 мМ NaCl, 5 мМ 2-меркаптоэтанола (ВМЕ), pH 8,0, и элюировали 300 мМ имидазолом, 100 мМ NaCl, 5 мМ BME, pH 8.0. Затем белки очищали препаративным исключением по размеру с использованием AKTA pure с колонкой Superdex75 HiLoad 16/60 (GE Healthcare Life Sciences, Мальборо, Массачусетс), уравновешенной и прогоняли в буфере SEC [20 мМ Трис, 100 мМ NaCl, 2 мМ дитиотреитол ( DTT), pH 7,5]. Дополнительный анализ SEC выполняли с использованием колонки Bio-Select SEC 125-5 на основе диоксида кремния (Bio-Rad, Hercules, CA) в буфере SEC.
SEC-MALS
Белки обрабатывали на AKTA pure с встроенной колонкой Superdex 75 Increase 10/300 (GE Healthcare Life Sciences), miniDAWN TREOS и Optilab T-rEX (Wyatt Technologies, Санта-Барбара, Калифорния).Колонку уравновешивали и запускали в буфере SEC, загружали 500 мкл 1-2 мг / мл белка, и колонка работала со скоростью 0,5 мл / мин. Добавление 100 мМ мальтозы в рабочий буфер использовали для определения эффекта удержания лафорина. Кажущуюся молекулярную массу по результатам анализа SEC рассчитывали путем подбора объема элюирования стандартов белка Бычий альбумин, яичный альбумин, карбоангидраза и лизозм. Данные по светорассеянию обрабатывали с помощью ASTRA (Wyatt Technologies). Молекулярную массу определяли путем анализа пиков на полувысоте с использованием показателя преломления (RI) в качестве источника концентрации.Дальнейший анализ и графики были подготовлены с использованием Prism (Graphpad Software, La Jolla, CA).
Результаты и обсуждение
Анализ лафорина человека
Одной из ключевых особенностей лафорина является его способность олигомеризоваться, но существуют серьезные споры о природе и влиянии мутаций пациента на олигомеризацию. Сначала мы проанализировали лафорин человека дикого типа с использованием SEC-MALS. Мы обнаружили, что лафорин элюируется как один вид. При калибровке по сравнению с белками известной молекулярной массы анализ SEC показывает, что он элюируется в объеме, соответствующем мономерному белку.Однако SEC-MALS указывает, что он существует в виде димера в растворе (,), что согласуется с нашим предыдущим определением аналитическим ультрацентрифугированием и малоугловым рентгеновским рассеянием (SAXS). Чтобы проверить, вызвано ли дивергентное удерживание лафорина дикого типа остаточными матричными взаимодействиями, поскольку Superdex представляет собой матрицу исключения размера на основе углеводов, мы протестировали поведение лафорина дикого типа в присутствии и в отсутствие мальтозы. Действительно, мы обнаружили, что существует значительное уменьшение объема элюирования в присутствии мальтозы и соответствующее увеличение молекулярной массы (,).Это говорит о том, что предыдущие оценки олигомеризации лафорина с помощью SEC были неоднозначными из-за комбинированных эффектов как олигомеризации, так и взаимодействий лафорина со смолой на основе углеводов, что дает объяснение предыдущим противоречивым результатам.
Поведение глюканфосфатазы лафорин. A) WT лафорин без и с добавлением мальтозы (синий). Правая ось Y представляет массу, измеренную MALS, с индивидуальными подгонками, определенными из диапазона элюирования, указанного на каждой панели.Объем элюирования стандартов SEC указан в верхней части панели. Б) Лафорин W32G, K87T и C266S. В) Лафорин F321C.
Таблица 1:
Определение олигомеризации глюканфосфатазы
| Белок | Теоретический Мономер MW (KDa) | Кажущийся MW SEC (KDa3) | MW Отношение MALS / Теоретическое | ||
|---|---|---|---|---|---|
| HS-лафорин WT | 39.1 | 39,9 | 78,2 (± 5,4%) | 1,0 | 2,0 |
| HS-лафорин WT + мальтоза | 39,4 | 62,0 | 95,2 (± 3,7%) | 1,6 | |
| HS-лафорин W32G | 39,0 | 56,8 | 80,1 (± 1,2%) | 1,5 | 2,1 |
| Hs-лафорин K87T | 39,1 | 57,0 76,0 1,5 | 2.0 | ||
| Hs-лафорин C266S | 39,1 | 39,0 | 77,4 (± 1,6%) | 1,0 | 2,0 |
| Hs-лафорин% F321C | 39,1 ) | 0,8 | 1,1 | ||
| At-SEX4 | 33,0 | 39,6 | 34,6 (± 1,4%) | 1,2 | 1,0 |
| At-SEX4 | 25.8 (± 1,5%) | 1,3 | 1,0 | ||
| См-лафорин 123 | 44,9 | 33,3 | 44,3 (± 2,0%) | 0,7 | 1,0 |
| Cm | 27,8 | −73,8 | 28,3 (± 2,3%) | −2,7 | 1,0 |
| См-лафорин 3-ДСП | 19,5 | 23,4 | 19,2 9017 ± 0,8 | 1,0 |
Эти результаты показывают, что SEC-MALS является надежным методом прямого определения состояния олигомеризации мутаций лафорина у пациентов без эффектов со стороны других функциональных возможностей белка.Затем мы проанализировали две мутации пациентов, W32G и K87T, обе локализованные на границе связывания углеводов домена CBM, которые резко снизили связывание углеводов. В обоих случаях белки элюировались в виде одного пика, но с объемом, отличным от объема белка дикого типа, что убедительно свидетельствует о том, что остаточное взаимодействие домена CBM с матрицей колонки отвечает за аберрантное поведение элюирования (). SEC-анализ показал очевидную молекулярную массу мономера и димера. Однако анализ с помощью SEC-MALS показал, что белки существуют в виде стабильных димеров, что указывает на сильную способность разделять изменения в олигомеризации и связывании углеводов ().Затем мы оценили мутацию C266S, локализованную в активном сайте DSP-домена лафорина, которая является каталитически неактивной. В этом случае мутантный белок вел себя как белок дикого типа, и анализ SEC-MALS показал, что белок существует в виде стабильного димера (,). Эти данные показывают, что олигомеризация лафорина и связывание углеводов, но не каталитическая активность, влияют на кажущуюся молекулярную массу белка.
Для дальнейшего тестирования этого метода мы проанализировали новую мутацию F321C, недавно идентифицированную у пациента мутацию, расположенную на границе димера.F321C также элюировался одним пиком, но с другим объемом, чем у белка дикого типа (). В этом случае анализ SEC и SEC-MALS показал, что мутантный белок существует в виде мономера, дополнительно поддерживая DSP-опосредованную димерную форму фермента и обеспечивая основу для понимания его роли в заболевании (2). Взятые вместе, эти данные демонстрируют, что SEC-MALS является ценным инструментом в продолжающихся усилиях, направленных на определение биохимической основы дисфункции мутаций лафорина.
Анализ глюканфосфатаз из фотосинтезирующих организмов
Затем мы оценили глюканфосфатазы из различных фотосинтезирующих организмов.Сначала мы исследовали поведение глюканфосфатазы SEX4, консервативной глюканфосфатазы, обнаруженной в зеленых растениях. SEX4 дефосфорилирует крахмал и связывается с линейными олигосахаридами с использованием интегрированного интерфейса CBM / DSP [12]. При анализе с помощью SEC-MALS было обнаружено, что SEX4 существует в виде мономера в растворе (,), что согласуется с предыдущими структурными исследованиями [5]. В отличие от лафорина, SEX4 элюировался после гель-фильтрации в ожидаемом объеме. Дальнейшая делеция SEX4 CBM мало влияла на кажущуюся подвижность или состояние олигомеризации SEX4 (,).Хотя белки SEX4 и лафорин имеют домены CBM, они принадлежат к разным семействам. SEX4 имеет домен CBM48, тогда как лафорин имеет домен CBM20 [13]. Различные семейства CBM обладают разными связывающими свойствами для углеводов [14], что потенциально объясняет разницу в наблюдаемых матричных взаимодействиях.
Поведение глюканфосфатазы зеленых растений SEX4. SEC-MALS анализ SEX4 WT и dCBM.
Затем мы оценили Cm-лафорин, чтобы определить поведение глюканфосфатазы красных водорослей, которая имеет два домена CBM20 и домен DSP ().См-лафорин хорошо себя ведет при гель-фильтрации, элюируя в виде одного вида (). Однако кажущаяся подвижность белка дает оценку молекулярной массы на 25% ниже, чем у мономерного белка, что физически неправдоподобно (). Однако анализ SEC-MALS показывает, что белок существует в растворе в виде мономера (). Основываясь на данных Hs-лафорина, мы предположили, что домены CBM могут взаимодействовать с матрицей, что приводит к наблюдаемой аномальной подвижности. Чтобы проверить эту гипотезу, мы сначала выполнили анализ SEC с использованием колонки Bio-Silect на основе диоксида кремния.Поразительно, но кажущаяся молекулярная масса Cm-лафорина (46 кДа) соответствует мономерному виду, что согласуется с олигомерным состоянием, определенным с помощью MALS (). Этот результат дополнительно подтверждает вывод о том, что остаточные матричные взаимодействия являются основой аномального вымывания из колонки Superdex. Чтобы определить вклад различных доменов, мы разработали конструкции субдоменов, которые выражали либо CBM-домены, либо DSP-домен с линкером CBM-DSP и без него. Интересно, что мы обнаружили, что линкер необходим для экспрессии домена CBM, но необязателен для домена DSP ().Затем мы оценили поведение отдельных конструкций, содержащих CBM и DSP. Поразительно, но конструкция, содержащая CBM, показала очень аномальное удерживание при гель-фильтрации. Эта конструкция фактически элюировалась после полного объема колонки, что привело к физически невозможной оценке молекулярной массы с помощью SEC (,). Напротив, только домен DSP элюируется в ожидаемом объеме и фактически до объема элюирования гораздо большего полного белка (). Важно отметить, что анализ SEC-MALS демонстрирует, что обе конструкции имеют хорошее поведение и являются мономерными, что согласуется с полной трехдоменной конструкцией ().
Поведение красных водорослей глюканфосфатаза Cm-лафорин. A) Анализ SEC-MALS глюканфосфатазы красных водорослей Cm-лафорин с использованием колонки Superdex. B) SEC-анализ Cm-лафорина с использованием колонки Bio-Silect SEC. Объем элюирования стандартов SEC указан в верхней части панели. C) Гели для сверхэкспрессии / очистки конструкции Cm-лафорин, содержащие два полных домена CBM и DSP (123), оба CBM с линкером (12l), оба CBM (12) и DSP (3). Линкер необходим для доменов CBM, поскольку экспрессия и очистка 12 мкл, но не 12 приводит к растворимому и свернутому белку.D) SEC-MALS-анализ изолированных конструкций CBM-домена, содержащих (12l) и E) DSP-домен (3).
Эти данные интригуют, поскольку олигомеризация Cm-лафорина отличается от лафорина позвоночных и больше похожа на SEX4 растений. Хотя биоинформатический анализ глюканфосфатазы из Cyanidioschyzon merolae показал, что она более тесно связана с лафорином глюканфосфатазы позвоночных, и поэтому она была названа Cm-лафорином, ее функциональные отношения еще предстоит определить.Что касается олигомеризации, эти данные указывают на то, что Cm-лафорин биохимически более похож на SEX4 наземных растений, чем на лафорин позвоночных. Эта функциональная консервация может быть связана с различиями между углеводным субстратом и позвоночными, обладающими растворимым гликогеном, в то время как растения и водоросли производят нерастворимый крахмал. Действительно, недавние исследования продемонстрировали, что активность различных глюканфосфатаз сильно зависит от природы используемого глюканового субстрата [11].
Выводы
Мы сообщаем об использовании SEC-MALS в качестве надежного метода оценки олигомерного состояния глюканфосфатаз и вариантов белков без влияния связывания углеводов. Эти результаты подчеркивают, что использование только SEC для оценки молекулярной массы белков, содержащих модули связывания углеводов, может быть проблематичным. Поскольку SEC-MALS позволяет быстро оценивать ферменты и варианты глюканфосфатазы, а также напрямую определять олигомерное состояние, это предпочтительный метод для определения олигомеризации глюканфосфатаз и, вероятно, других семейств углеводсвязывающих белков.
Этот метод позволяет определять различия в олигомерном состоянии новых мутаций пациентов-людей, выявленных у пациентов с LD. Кроме того, из-за его рецессивного наследования значительное количество потенциальных мутаций-носителей было идентифицировано в результате крупномасштабных попыток популяционного секвенирования. Этот подход поможет текущим исследованиям выявить биохимические особенности как новых мутаций болезни, так и мутаций потенциальных носителей, с целью диагностики и лечения конкретного пациента.
Кроме того, мы демонстрируем, что глюкановые фосфатазы из разных царств демонстрируют диапазон поведения олигомеризации. Интересно, что глюканфосфатазы из очень разных фотосинтезирующих организмов, наземных растений и красных водорослей оказались мономерными. Будущие исследования определят природу общих и уникальных аспектов функции глюканфосфатазы в разных царствах жизни.
Основные моменты
Глюканфосфатазы дефосфорилируют углеводные субстраты.
Различные состояния олигомеров важны для их правильной биологической функции.
Лафорин демонстрирует взаимодействие с углеводной матрицей столбца исключения размера.
Глюканфосфатазы фотосинтезирующих организмов существуют в виде мономеров.
SEC-MALS позволяет определять и сравнивать олигомеризацию глюканфосфатазы.
Благодарности
Мы благодарим доктора Эмилию Гальперин, г-жуКэти Брюэр и сотрудников лабораторий Vander Kooi и Gentry за полезные обсуждения и помощь.
Финансирование
Эта работа была поддержана Национальным научным фондом (CHE-1808304 для C.W.V.K и MCB-1252345 для M.S.G.) и Национальными институтами здравоохранения (P20GM103486, основная поддержка; R01NS070899 для M.S.G .; и P01NS097197) для M.S.G. и P01NS097197.